نحن نقدم كتلا أساسية ، ولكن عالية الطلب على التربية الجماعية والملاحظات والدراسات الجزيئية باستخدام كتل Tortrix الخطيرة للآفات ، لدراسة بيولوجيتها. حتى الآن ، منع هيكل بيض الحشرات إجراء مزيد من التحليل. والجدير بالذكر أننا مكننا من دراسة البويضات الرقيقة والناعمة والهشة التي يغطيها إفراز الأمهات.
هناك تقنيات بسيطة من المتوقع أن تكون قابلة للتطبيق لمزيد من الأبحاث حول tortrix ، وتجربة الحشرات الأخرى وغيرها من الأصناف. ابدأ بوضع أنثى واثنين من الذكور في كوب بلاستيكي سعة 120 ملليلتر مع قطعة من ورق البارافين لإنشاء خط ماترا. قم بتقطيع ما يقرب من 60 جراما من الوجبات الغذائية الاصطناعية باستخدام مبشرة للتربية الجماعية.
ضع كتلة البيض المملوءة بالأجنة الناضجة على النظام الغذائي الاصطناعي المقطع إلى شرائح في وعاء بلاستيكي. ضع أوراق البارافين على كتلة البيض مع الوجبات الغذائية المقطعة. ضع 15 ذكرا و 10 إناث في صندوق بلاستيكي للتزاوج عند 25 درجة مئوية.
جمع البيض كل خمسة إلى سبعة أيام وتكرار خطوات التربية الجماعية لكل جيل. نقع كتلة البيض في 1000 ميكرولتر من محلول مائي هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 1.2٪ لمدة 10 دقائق أو في 1000 ميكرولتر من خمسة محلول مائي هيدروكسيد البوتاسيوم المولي لمدة 30 دقيقة لفصل البيض. اغسل البيض المنفصل في 1000 ميكرولتر من PBSt.
نقع البيض في خليط الوزن حسب الحجم من 500 ميكرولتر من 100 ٪ من الهيبتان و 500 ميكرولتر من محلول 4 ٪ Paraformaldehyde PBSt. اخلط لمدة 10 دقائق بمعدل 1500 دورة في الدقيقة باستخدام خلاط دوامة. نقع البيض في خليط من 500 ميكرولتر من 100٪ هيبتان و 500 ميكرولتر من الميثانول 100٪.
اخلط لمدة 10 دقائق بمعدل 1500 دورة في الدقيقة. اغسل البيض مرتين ب 1000 ميكرولتر من الميثانول بنسبة 100٪ وخزنه عند أربع درجات مئوية في 100٪ ميثانول. نقع البيض بالتتابع في 99٪ 70٪ و 50٪ من الإيثانول و PBSt لمدة خمس دقائق لكل منهما للمهب بالماء.
اغسل البيض باستخدام PBSt. اغمر البيض في ميكروغرام واحد لكل محلول DAPI ملليلتر لمدة خمس دقائق ، ثم اغسل البيض باستخدام PBS مرتين. نقع البيض في 20 ميكرولتر من محلول 1.25٪ من اللاكتيك أو الخليك أو CN ، لتصور heterochromatin حتى تظهر النوى لونا أحمر لامعا.
انقل البيض الملون باستخدام ماصة إلى شريحة زجاجية ، ثم أرفقها بكاشف مضاد للتلاشي وزجاج غطاء. استخراج يرقات Ferrate و Amonamagnetama و Adoxophyes honmai من كتل البيض باستخدام الملقط. تشريح اليرقات على الشريحة الزجاجية.
إصلاح الأنسجة بمزيج من واحد إلى ثلاثة 99.7٪ من حمض الزهد في 100٪ ميثانول لمدة خمس دقائق. قم بتلطيخ أولئك الذين لديهم وزن 1.25٪ بالوزن محلول اللاكتيك أو الزاهد أو CN حتى يتم تلطيخ النوى. تحديد جنس كل عينة من خلال مراقبة وجود heterochromatin للإناث أو غياب للذكور تحت المجهر.
لاستخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي من يرقات Ferrate المحددة بالجنس ، قم بتجميع 12 يرقات ذكور أو أنثى محددة من قبل الجنس ، وأضف إما المخزن المؤقت لتحلل الخلايا أو كواشف استخراج الحمض النووي الريبي في أنبوب واحد 1.5 ملليلتر. تتيح خطوات التثبيت والتخلل والتلطيخ تصور النوى باستخدام محلول DAPI. كشف تلطيخ اللاكتيك أو الزهد أو CN باستخدام يرقات Ferrate المشوهة أن الإناث تظهر heterochromatin كنقطة ، لكن الذكور يفتقرون إلى heterochromatin.
حسنت البروتوكولات المعدلة باستخدام عمود الدوران جودة الحمض النووي الريبي الذي ينتج 900 إلى 1500 نانوغرام من المنتج بنسبة 260 إلى 200 من 1.9 إلى 2.1 ، ونسبة 260 إلى 280 من 1.9 إلى 2.3. وكانت نسبة تركيز الحمض النووي الريبي للبروتوكول المعدل أقل من 1.2، مما يفي بمتطلبات الجودة لتسلسل الجيل التالي. تم تأكيد سلامة الحمض النووي الريبي المستخرج من يرقات Ferrate المحددة جنسيا باستخدام البروتوكول المعدل باستخدام الرحلان الكهربائي للرقاقة الدقيقة.
تم تأكيد المكتبات المعدة للحصول على قراءات عالية من درجة Q 30. تساهم رسالتنا في الدراسات الأساسية للحشرات وأدوات الآفات. علاوة على ذلك ، فإن بروتوكولاتنا لديها القدرة على استخدامها لتقييم المبيدات الكيميائية الفعالة أو الميكروبات بين الخلايا أثناء التكوين الجنيني.
