Apresentamos massas fundamentais, mas altamente demandadas para criação em massa, observações e estudos moleculares usando massas tortrix de pragas graves, para estudar sua biologia. Até agora, a estrutura dos ovos de insetos impediu uma análise mais aprofundada. Notavelmente, possibilitamos o estudo de ovos finos, macios e frágeis cobertos pela secreção materna.
Espera-se que sejam aplicáveis técnicas simples para novas pesquisas sobre tortrix, experimentando outros insetos e outros taxas. Comece colocando uma fêmea e dois machos em um copo de plástico de 120 mililitros com um pedaço de papel parafina para estabelecer uma linha de Matra. Corte aproximadamente 60 gramas de dietas artificiais usando um Ralador para criação em massa.
Coloque a massa de ovos cheia de embriões maduros na dieta artificial fatiada em um recipiente plástico. Coloque papéis de parafina na massa de ovos com as dietas fatiadas. Coloque 15 machos e 10 fêmeas em uma caixa de plástico para acasalamento a 25 graus Celsius.
Colete ovos a cada cinco a sete dias e repita etapas de criação em massa para cada geração. Mergulhe a massa de ovos em 1000 microlitres de 1,2% de solução aquosa hipoclorito de sódio por 10 minutos ou em 1000 microliters de cinco soluçãos aquosas de hidróxido de potássio molar por 30 minutos para separar os ovos. Lave os ovos separados em 1000 microliters de PBSt.
Mergulhe ovos em uma mistura de peso por volume de 500 microliters de 100% heptano e 500 microlitres de 4% solução PBSt paraformaldeída. Misture por 10 minutos a 1500 rotações por minuto usando um misturador de vórtice. Mergulhe os ovos em uma mistura de 500 microlitres de 100% heptano e 500 microlitres de 100% metanol.
Misture por 10 minutos a 1500 rotações por minuto. Lave os ovos duas vezes com 1000 microliters de 100% de metanol e armazene-os a quatro graus Celsius em 100% de metanol. Mergulhe os ovos sequencialmente em 99%70% e 50% etanol e PBSt por cinco minutos cada para hidrofilização.
Lave os ovos com PBSt. Mergulhe os ovos em um micrograma por solução DAPI mililitro por cinco minutos e, em seguida, lave os ovos com PBS duas vezes. Mergulhe os ovos em 20 microlitros de solução 1,25% láctica, acética ou CN, para visualizar heterocromatina até que os núcleos ex exponhom uma cor vermelha brilhante.
Transfira os ovos manchados usando uma pipeta para um slide de vidro, em seguida, incluí-los com um reagente anti-fade e um copo de tampa. Extraia ferrate, amonamagnetama e adoxophyes honmai larvas das massas de ovos usando fórceps. Disseque as larvas na lâmina de vidro.
Fixar os tecidos com uma mistura de um a três ácido ascético de 99,7% em 100% de metanol por cinco minutos. Manche aqueles com 1,25% de peso em peso lá em solução láctica, ascética ou CN até que os núcleos estejam manchados. Determine o sexo de cada espécime observando a presença de heterocromatina para fêmeas ou ausência para machos sob um microscópio.
Para extrair DNA e RNA de larvas ferrate determinadas por sexo, a piscina 12 sexo determinou larvas ferrate masculinas ou femininas, e adicionar tampão de lise celular ou reagentes de extração de RNA em um tubo de 1,5 mililitro. As etapas de fixação, permeabilização e coloração permitem a visualização de núcleos com solução DAPI. A coloração láctica, ascética ou CN usando as larvas de Ferrate dissecadas revelou que as fêmeas exibem heterocromatina como ponto, mas os machos não têm heterocromatina.
Os protocolos modificados utilizando uma coluna de spin melhoraram a qualidade do RNA produzindo de 900 a 1500 nanogramas de produto com uma proporção de 260 a 200 de 1,9 para 2,1, e uma razão de 260 a 280 de 1,9 a 2,3. A taxa de concentração de RNA para o protocolo modificado foi inferior a 1,2, atendendo aos requisitos de qualidade para o sequenciamento de próxima geração. A intactidade do RNA extraído do sexo determinou que as larvas ferrate usando o protocolo modificado foram confirmadas usando eletroforese de microchip.
As bibliotecas preparadas foram confirmadas para render leituras de pontuação do 30º trimestre. Nossa mensagem contribui para estudos fundamentais de insetos e ferramentas de pragas. Além disso, nossos protocolos têm o potencial de serem usados para avaliar os pesticidas químicos eficazes ou micróbios intercelulares durante a embriogênese.
