ونحن نشكر الموظفين في X06DA خط الأشعة في المصدر السويسري الخفيفة، بول شيرر، معهد، Villigen، سويسرا للحصول على دعم خلال جمع البيانات السنكروترون. ونحن ممتنون لمونيكا غومبرت حصول على الدعم الفني الممتاز. تم دعم المشروع من قبل جامعة كولونيا ومنح INST 216 / 682-1 FUGG من مجلس البحوث الألمانية. ومن المسلم به زمالة الدكتوراه من كلية الدراسات العليا الدولية في الصحة التنمية ومرض لCP. تلقت البحوث المؤدية إلى هذه النتائج بتمويل من برنامج الإطار السابع للجماعة الأوروبية (FP7 / 2007-2013) بموجب اتفاقية منحة رقم 283570 (BioStruct-X).

<ol>
	<li>Bouza, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+Clostridium+difficile+infection:+understanding+the+healthcare+burden.">Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden.</a> Clin Microbiol Infect. 18 (Suppl 6), 5-12 (2012).</li><li>O'Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile+infection+caused+by+the+epidemic+BI/NAP1/027+strain.">Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain.</a> Gastroenterology. 136 (6), 1913-1924 (2009).</li><li>Mitchell, B. G., Gardner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+and+Clostridium+difficile+infection:+a+review.">Mortality and Clostridium difficile infection: a review.</a> Antimicrob Resist Infect Control. 1 (1), (2012).</li><li>George, W. L., Sutter, V. L., Finegold, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+agent-induced+diarrhea--a+bacterial+disease.">Antimicrobial agent-induced diarrhea--a bacterial disease.</a> J Infect Dis. 136 (6), 822-828 (1977).</li><li>George, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Clostridium+difficile+as+a+cause+of+pseudomembranous+colitis.">Identification of Clostridium difficile as a cause of pseudomembranous colitis.</a> Br Med J. 1 (6114), 695 (1978).</li><li>Bartlett, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Narrative+review:+the+new+epidemic+of+Clostridium+difficile-associated+enteric+disease.">Narrative review: the new epidemic of Clostridium difficile-associated enteric disease.</a> Ann Intern Med. 145 (10), 758-764 (2006).</li><li>Kelly, C. P., LaMont, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile--more+difficult+than+ever.">Clostridium difficile--more difficult than ever.</a> N Engl J Med. 359 (18), 1932-1940 (2008).</li><li>&#220;nal, C. M., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+therapeutic+strategies+for+Clostridium+difficile+infections.">Novel therapeutic strategies for Clostridium difficile infections.</a> Expert Opin Ther Targets. 20 (3), 269-285 (2016).</li><li>Kelly, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Monoclonal+Antibody,+Bezlotoxumab+Targeting+C.+difficile+Toxin+B+Shows+Efficacy+in+Preventing+Recurrent+C.+difficile+Infection+(CDI)+in+Patients+at+High+Risk+of+Recurrence+or+of+CDI-Related+Adverse+Outcomes.">The Monoclonal Antibody, Bezlotoxumab Targeting C. difficile Toxin B Shows Efficacy in Preventing Recurrent C. difficile Infection (CDI) in Patients at High Risk of Recurrence or of CDI-Related Adverse Outcomes.</a> Gastroenterology. 150 (4), S122 (2016).</li><li>Tsutsumi, L. S., Owusu, Y. B., Hurdle, J. G., Sun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+the+discovery+of+treatments+for+C.+difficile+infection:+A+clinical+and+medicinal+chemistry+review.">Progress in the discovery of treatments for C. difficile infection: A clinical and medicinal chemistry review.</a> Curr Top Med Chem. 14 (1), 152-175 (2014).</li><li>Hensbergen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile+secreted+Pro-Pro+endopeptidase+PPEP-1+(ZMP1/CD2830)+modulates+adhesion+through+cleavage+of+the+collagen+binding+protein+CD2831.">Clostridium difficile secreted Pro-Pro endopeptidase PPEP-1 (ZMP1/CD2830) modulates adhesion through cleavage of the collagen binding protein CD2831.</a> FEBS Lett. 589 (24), 3952-3958 (2015).</li><li>Cafardi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+zinc+metalloprotease+through+a+global+analysis+of+Clostridium+difficile+extracellular+proteins.">Identification of a novel zinc metalloprotease through a global analysis of Clostridium difficile extracellular proteins.</a> PLoS One. 8 (11), e81306 (2013).</li><li>Hensbergen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+secreted+metalloprotease+(CD2830)+from+Clostridium+difficile+cleaves+specific+proline+sequences+in+LPXTG+cell+surface+proteins.">A novel secreted metalloprotease (CD2830) from Clostridium difficile cleaves specific proline sequences in LPXTG cell surface proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (5), 1231-1244 (2014).</li><li>Schacherl, M., Pichlo, C., Neundorf, I., Baumann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Basis+of+Proline-Proline+Peptide+Bond+Specificity+of+the+Metalloprotease+Zmp1+Implicated+in+Motility+of+Clostridium+difficile.">Structural Basis of Proline-Proline Peptide Bond Specificity of the Metalloprotease Zmp1 Implicated in Motility of Clostridium difficile.</a> Structure. 23 (9), 1632-1642 (2015).</li><li>Rawlings, N. D., Waller, M., Barrett, A. J., Bateman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEROPS:+the+database+of+proteolytic+enzymes,+their+substrates+and+inhibitors.">MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors.</a> Nucleic Acids Res. 42 (Release 10.0), D503-D509 (2014).</li><li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeds+to+crystals.">Seeds to crystals.</a> J Struct Biol. 142 (1), 66-76 (2003).</li><li>Dauter, Z., Dauter, M., Dodson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jolly+SAD.">Jolly SAD.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (Pt 3), 494-506 (2002).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 2), 125-132 (2010).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66, 213-221 (2010).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphics System. , (2002).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>Wang, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+phase+ambiguity+in+macromolecular+crystallography.">Resolution of phase ambiguity in macromolecular crystallography.</a> Methods Enzymol. 115, 90-112 (1985).</li><li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li><li>Zwart, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+structure+solution+with+the+PHENIX+suite.">Automated structure solution with the PHENIX suite.</a> Methods Mol Biol. 426, 419-435 (2008).</li><li>Zheng, H., Handing, K. B., Zimmerman, M. D., Shabalin, I. G., Almo, S. C., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+crystallography+over+the+past+decade+for+novel+drug+discovery+-+where+are+we+heading+next?.">X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next?.</a> Expert Opin Drug Discov. 10 (9), 975-989 (2015).</li><li>Rubino, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+zinc-bound+Zmp1,+a+zinc-dependent+metalloprotease+secreted+by+Clostridium+difficile.">Structural characterization of zinc-bound Zmp1, a zinc-dependent metalloprotease secreted by Clostridium difficile.</a> J Biol Inorg Chem. 21 (2), 185-196 (2016).</li><li>Carson, M., Johnson, D. H., McDonald, H., Brouillette, C., Delucas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=His-tag+impact+on+structure.">His-tag impact on structure.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63 (Pt 3), 295-301 (2007).</li><li>Gasteiger, E., Walker, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Identification+and+Analysis+Tools+on+the+ExPASy+Server.">Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server.</a> The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).</li><li>Dummler, A., Lawrence, A. M., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+screening+for+the+detection+of+soluble+fusion+constructs+expressed+in+E.+coli+using+a+modular+set+of+vectors.">Simplified screening for the detection of soluble fusion constructs expressed in E. coli using a modular set of vectors.</a> Microb Cell Fact. 4, 34 (2005).</li><li>Stura, E. A., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+the+streak+seeding+technique+in+protein+crystallization.">Applications of the streak seeding technique in protein crystallization.</a> J Crys Growth. 110 (1), 270-282 (1991).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

الأشعة السينية البلورات لا تزال هي الطريقة الأسرع والأكثر دقة لتحديد الهياكل قرار بالقرب الذرية ثلاثية الأبعاد للبروتينات 28. ومع ذلك، فإنه يتطلب نمو البلورات واحدة امر جيد. هذه غالبا ما تكون صعبة للحصول على والدولة البلورية هي مصطنعة. ومع ذلك، فإن المقارنة بين الهياكل بروتين تحدده البلورات بالأشعة السينية مع تلك التي يحددها أساليب أخرى، وخاصة NMR، ويظهر عادة على اتفاق جيد للغاية. في حالة PPEP-1، بنية NMR نشرت مؤخرا 29 يبين اتفاق ممتاز مع التركيب البلوري لدينا 14، بما في ذلك التنقل من S-الحلقة. يصف هذا البروتوكول إنتاج وتنقية N-عضال صاحب الكلمات الدلالية البروتين rPPEP-1 للدراسات الهيكلية وبلورة وهيكل تحديد rPPEP-1 بلا علامات. كانت البلورات صعبة للنمو في هذه الحالة وتتطلب إجراء microseeding خاص. في تيكان القسم التالي سنناقش نتائج PPEP-1، وبيان كيف يمكن تكييفها على بروتوكول لإنتاج وبلورة أي بروتين آخر. تنويعات على تصميم بناء والتعبير وأعرب عن rPPEP-1 ك N-عضال صاحب الموسومة البديل (الشكل 1A)، كما لبلورة فمن الأفضل لإزالة صاحب العلامة من قبل الثرومبين الهضم بسبب تأثيره المحتمل على نجاح بلورة وبنية البروتين 30. لبروتينات أخرى قد يكون من المستحسن لاختبار بالإضافة إلى C-عضال صاحب الموسومة إصدار (على سبيل المثال مستنسخ باستخدام مواقع تقييد نفسها، وناقلات pET22b والتمهيدي العكسي دون توقف كودون في نهاية 3 &#39;) أو لمغادرة N-محطة صاحب العلامة uncleaved، كما هو الحال في بعض الحالات علامة قد يساعد أثناء التبلور. لrPPEP-1 على المحصول واستقرار C-عضال بناء صاحب الموسومة-كان أقل شأنا. بالإضافة إلى ذلك، الاختبارات الأولية لأفضل قوينبغي إدراج تعبير البروتين oluble في سلالات كولاي التالية: BL21 (DE3)، BL21 (DE3) pLysS أو Lemo21 (DE3)، BL21 (DE3) كودون بالإضافة إلى RIPL أو روزيتا 2 (DE3)، BL21 (DE3) نجم و C41 (DE3) في ثلاث درجات حرارة مختلفة مرة / الحضانة (3-4 ساعة على 37 درجة مئوية، 5 ساعة على 30 درجة مئوية، وبين عشية وضحاها في 20 درجة مئوية). قبل الاستنساخ، تحقق من وجود موقع انشقاق الثرومبين الداخلي باستخدام أداة إكسباسي PeptideCutter 31 لمنع انشقاق من البروتين من الفائدة. بدلا من ذلك، هناك ناقلات المتاحة وتوفير موقع انشقاق عن HRV3C (أي EMBL في PETM 14 32) أو TEV البروتيني (أي EMBL في PETM-11). تنقية البروتين ليبني rPPEP-1 يتم تنفيذ تحلل الخلية عبر صوتنة على الجليد / المياه. للبروتينات أكثر الحساسة التي تميل إلى تجميع أو يعجل أكثر &quot;لطيف&quot; طريقة خلية تحلل تنطوي على اختلال الخلايا قد يكون الاستخدامد. تحقق من وجود كميات كبيرة من البروتين غير قابلة للذوبان بعد خطوة الطرد المركزي الأولى، التي لم يتم الكشف عنها عند استخدام طريقة تحلل مثل تحلل الخلية الكيميائية. لتنقية rPPEP-1 عادة ما كانت تستخدم 2 مل من الراتنج NiNTA. قراءة إرشادات الشركة المصنعة على كيفية كبيرة قدرة بروتين ملزمة من الراتنج اختارت هي وضبط وفقا لذلك. في التنقيات الأولى من rPPEP-1، حيث كان يستخدم فقط 1 مل من الراتنج، ليست ملزمة على الكثير من البروتين لعمود وعثر في التدفق من خلال (1D الشكل). من ناحية أخرى استخدام الكثير من الراتنج قد خفض نقاء البروتين النقي. ضبط تركيز ايميدازول إلى تقارب ملزمة لاستخدامها بناء صاحب الكلمات الدلالية لمصفوفة NiNTA. ويفضل إجراء الغسيل تدريجي هنا (أي 10 ملم، 30 ملم، 50 ملم، 70 ملم ايميدازول)، التي يتم فيها رصد A280، ويسمح للوصول إلى خط الأساس في كل خطوة. وبهذه الطريقة لا يضيع البروتين، حتى لو كان ذلك من شأنه أن أزل خلالعالية خطوة ايميدازول غسل (على سبيل المثال في 50 أو 70 ملم). في حالة NHIS-rPPEP-1 بعض البروتين elutes بالفعل في 30 ملي ايميدازول، لكن من غير الواضح ما هو نوع من أنواع البروتين تمثله. بعض البروتينات تترسب / مجموع المباراتين عندما يتم مدال ايميدازول أو المخفف من حل البروتين. في مثل هذه الحالات والحد من تركيز ايميدازول في شطف العازلة إلى 150 ملم ووقت التعرض لتركيزات عالية ايميدازول، مثل تقليل تركيز ايميدازول من شطف في كوب يحتوي على حجم 5-10 أضعاف من العازلة دون ايميدازول مقارنة حجم شطف المخطط لها. لNHIS-rPPEP-1 الحضانة مع 2 وحدة الثرومبين في ملغ من البروتين بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية تكفي ليلتصق صاحب العلامة إلى ما يقرب من 100٪. ضبط كمية من الثرومبين للبروتين من الفائدة عن طريق استخدام 1-10 وحدة في بروتين ملغ في 4 درجة مئوية إلى 20 درجة مئوية. عندما تركيز البروتين باستخدام وحدة الترشيح الفائق الطرد المركزي وقفة في فترات من 5-10 دقيقة وتخلط عrotein لتجانس التدرج تركيز بناء في المكثف. إلا بروتين عالية التركيز يمكن تجميع / راسب. بلورة rPPEP-1 تنتج باستمرار بلورات intergrown غاية (البلورات تنمو على رأس كل منهما الآخر، وبالتالي وجود العديد من الكريستال المشابك) التي ليست مناسبة لتحليل حيود الأشعة السينية. قد يكون التفسير أن الكثير من الأحداث التنوي التي تحدث في منطقة التنوي من مرحلة الرسم (الشكل 7). <img alt="الرقم 7" src="/files/ftp_upload/55022/55022fig7.jpg" /> الرقم 7: مخطط المرحلة من تجربة البروتين التبلور. يمكن أن بلورات تشكل فقط، عندما يتم الفوق البروتين. التنوي يحدث في منطقة التنوي ونمو البلورات في منطقة متبدل الاستقرار. عندما البروتين الكافي، فإن ستبقى انخفاض واضح. &lt;لوحظ ص الطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; خفض البروتين أو مرسب تركيزات لا يحسن الوضع ثم لا التنوي من rPPEP-1 بعد الآن، وقطرات الابتعاد. كان Microseeding طريقة الاختيار، كما يتم جلب نواة صغيرة مباشرة في منطقة متبدل الاستقرار، الذي rPPEP-1 البلورات تنمو في نهاية المطاف (الشكل 7). من خلال تصميم الشاشة الأمثل في هذه الطريقة أن حالتها الأصلية (2.4 M فوسفات الأمونيوم ثنائي القاعدة، 0.1 M تريس درجة الحموضة 8.5) ويقع في C5 موقف (الشكل 4) (بدلا من نهاية عالية من الحموضة وتركيز مرسب) الأكثر من جديد شروط تتوافق مع شرط مع انخفاض التشبع مع الميل العالي لتمثيل جزء من منطقة متبدل الاستقرار 16 (الشكل 7). وهكذا، يمكن للنواة التي تعرض في أثناء البذر يحتمل أن يصل إلى بلورات واحدة كبيرة. لتحسين هذا الإجراء (كمية وحجم البلورات التي تشكلت حديثا) ومخزون البذور الأصلي يمكن أن تضعف 10 <suص&gt; -2 إلى 10 -5. هنا يمكن اختبارها عدة التخفيفات من مخزون البذور لتحديد أفضل التخفيف البذور لإنتاج بلورات واحدة كبيرة. بدلا من خط البذر باستخدام الطولي حيوان أو الشعر ذيل (الأرنب، القط، شينشيلا أو حصان) يمكن توظيف 33. الإجراء يمكن أن تستخدم للمشاركة في بلورة المنتج الببتيدات والركيزة الببتيدات من rPPEP-1. تم الحصول على بلورات في المجموعة الفراغية P2 1 الانعراج تصل إلى 1.25 من أسهم بذور المخفف 1: 250 في الإجراء الأمثل. بلورات تنمو في مجموعات الفضاء اثنين P2 1 2 1 2 1 (البروتين غير منضم) و P2 1 (الهياكل المعقدة)، في حين تنشأ من ظروف مشابهة جدا داخل الشاشة فوسفات الأمونيوم الإجراء الأمثل. ويرجع ذلك إلى التعبئة الكريستال وجدت في كل ص-PPEP-1 أشكال الكريستال، وبصورة رئيسية عن جزيئات صغيرة والببتيدات معالجة الجانب غير معبى من موقع نشط يمكن أن تكون وحدها soakeد في البلورات. هذا الجانب من جزيء يمكن الوصول إليها من الحاضر المذيبات في البلورة. لكن جزيئات معالجة كل المواقع الفرعية أو الجانب معبي تحتاج فقط إلى أن يشترك تبلور مع rPPEP-1، وافتتاح S-حلقة ستكون هناك حاجة لاستيعابهم في موقع نشط. بالإضافة إلى ذلك، يتم الاتصال rPPEP-1 من قبل الجزيئات المجاورة في الخروج من موقع ملزم الركيزة بالقرب من S3&#39;site (تشجيع الاتصالات وضوح الشمس في هذا المجال) - وهذه حقيقة يحد من طول الببتيدات الركيزة ل3 المخلفات في الجانب معبي في هذه الأشكال الكريستال اثنين. الكريستال تصاعد والبرد حماية تركيب بلورات البروتين هو الأسلوب الذي يتطلب بعض المهارة في التلاعب تحت مجهر تشريحي، وبالتالي يحتاج إلى بعض الممارسات. اختيار طول الأمثل للحلقة النايلون (أو غيرها من حلقة الاختيار، على سبيل المثال litholoop) لمنع الفائض من المذيبات حول وضوح الشمس التي تساهم في backgrounد نثر، وبالتالي أقل إشارة إلى نسبة الضوضاء من البيانات الحيود. أيضا يجعل الأمثل حجم الحلقة / طول الصيد من بلورات أسهل مثل وضوح الشمس لا تنزلق خلال الحلقة. لrPPEP-1 البلورات، والتي هي حوالي 100-200 ميكرون في أطول البعد، وقد تم اختيار الحلقات النايلون من 0.1-0.2 حجم مم. و-بروتيكتانت البرد قد تساهم أيضا في تفاقم جودة البيانات، مثل وضوح الشمس قد تواجه صدمة التناضحي عندما نقل إلى البرد حالة. هذا قد يعيق أو حتى تدمير النظام الداخلي للوضوح الشمس. بعناية اختيار نوع وتركيز البرد حاصن. كانت rPPEP-1 بلورات البرد محمية مع أي الجلسرين 20٪ أو 30٪ سكروز. إذا بلورة مجمع معقدة أو الركيزة الببتيد من rPPEP-1 مع يجند أخرى، ينبغي اختيار السكروز كما البرد حاصن كما يرتبط الجلسرين إلى الموقع معبي للموقع الركيزة ملزمة من rPPEP-1 14. تقرير هيكل الحل AutoSol الحصول على بايز-CC من 49.2 ± 18.4، وحرية التنقل (الرقم الجدارة) 0.41، وهو انحراف 0.17 وارتباط RMS 0.85. خريطة نموذج الارتباط هو 0.86 والعوامل حرة R / R هي 0.21 / 0.24. كل هذه المعايير تشير إلى وجود حل هيكل ناجحة.

المطثية العسيرة هي واحدة من الأسباب الرئيسية للنوسكميل المرتبطة المضادات الحيوية عدوى الإسهال 1. تنتقل هذه البكتيريا اللاهوائية إيجابية الجرام من خلال شكل بوغ لها عن طريق الفم برازي الطريق. في العقد الماضي، جديدة &#39;&#39; باء &#39;&#39; أو &#39;&#39; hypervirulent &#39;&#39; سلالات (على سبيل المثال BI / NAP1 / 027) تسبب في زيادة كبيرة في الإصابات الجديدة ومعدلات الوفيات في أمريكا الشمالية وأوروبا 2. جيم المرض -associated العسيرة (CDAD) هي التي تهدد الحياة التهاب القولون مع معدلات وفيات عالية 3. وتتراوح الأعراض من الإسهال 4 إلى التهاب القولون الغشائي الكاذب (5) وتضخم القولون السامة غالبا ما تكون قاتلة 6. علاج CDAD صعبة كما سلالات ضراوة مقاومة للأدوية المتعددة ومعدل تكرار مرتفع 7. وفي يشمل العلاج اللحظة ميترونيدازول المضادات الحيوية، fidaxomicin أو فانكومايسين، أو في repetitiالحالات المتكررة vely البراز زرع الجراثيم. هناك حاجة ماسة إلى استراتيجيات علاجية جديدة 8. يتم تسجيل بعض التقدم كما العلاجية الأجسام المضادة وحيدة النسيلة بزلوتوكسوماب، تستهدف جيم السم العسيرة ب 9، مؤخرا اجتاز بنجاح المرحلة الثالثة من التجارب السريرية ورفعت للموافقة عليها مع ادارة الاغذية والعقاقير وEMA. بالإضافة إلى ذلك، يتم اختبار مضادات حيوية جديدة في الوقت الراهن في مراحل مختلفة من التجارب السريرية 10. لتطوير علاج فعال يجب تحديد الأهداف العلاجية الجديدة. واكتشفت مؤخرا جيم ببتيداز داخلية-1 البروتيني العسيرة البرولين البرولين (PPEP-1؛ CD2830 / Zmp1، EC 3.4.24.89) مثل هذا الهدف واعد، وعدم وجود PPEP-1 في سلالة خروج المغلوب يقلل ضراوة C . صعب في الجسم الحي 11. PPEP-1 هو metalloprotease يفرز 12،13 الشق اثنين جيم adhesins صعب في اجتماعهم محطة سي 13 وبالتالي الإفراج عن bacter ملتصقةالجيش العراقي من ظهارة الأمعاء الإنسان. وبالتالي، فإنه يشارك في الحفاظ على التوازن بين النمط الظاهري لاطئة ومتحركة من جيم صعب. لتطوير مثبطات انتقائية ضد PPEP-1 وأن ​​نفهم كيف أنها تعترف ركائز لها معرفة وثيقة من هيكلها ثلاثي الأبعاد أمر لا غنى عنه. لقد تمكنا من حل التركيب البلوري الأول من PPEP-1 وحده، وفي مجمع مع الببتيد الركيزة 14. PPEP-1 هو الأنزيم البروتيني الأولى المعروفة التي انتقائي يشق روابط الببتيد بين اثنين من مخلفات البرولين 15. فإنه يلزم الركيزة بطريقة مزدوجة متلوى واستقرار ذلك عن طريق شبكة الأليفاتية العطرية طويلة من المخلفات الموجودة في S-الحلقة التي تغطي الموقع البروتيني نشط 14. هذا الوضع ملزم الركيزة هي فريدة من نوعها لPPEP-1 والتي لا توجد في البروتياز الإنسان حتى الآن. وهذا ما يجعل منه هدفا المخدرات واعدة، وبعيدا عن الهدف آثار مثبطات المستبعد جدا. لتطوير وشاشة انتقائية PPEP-1 يلعنهibitors في المستقبل هناك حاجة إلى كمية كبيرة من الذهب الخالص وmonodisperse PPEP-1 البروتين. وعلاوة على ذلك، لتحديد طريقة الربط من مثبطات الأولى، وهياكل التعاون وضوح الشمس مع PPEP-1 سوف يتعين تحديدها. في أيدينا PPEP-1 تنتج باستمرار بلورات intergrown. وهكذا وضعنا إجراء الأمثل لإنتاج بلورات واحدة ذات جودة حيود PPEP-1. في هذا البروتوكول وصفنا في التفاصيل الحل إنتاج وتنقية والبلورة وهيكل PPEP-1 14. نحن نستخدم تعبير الخلايا في القولونية من البديل PPEP-1 التي تفتقر إلى تسلسل إشارة إفراز، اللوني تقارب وحجم الإقصاء اللوني مع إزالة العلامة تنقية، تليها microseeding 16 إلى شاشة الأمثل وتحديد هيكل عبر الزنك والطول الموجي واحد تشتت الشاذة (والزنك SAD) 17. ويمكن تكييف هذا البروتوكول للإنتاج وهيكل تحديد البروتينات الأخرى (على سبيل المثال &lt;/ م&gt; metalloproteases) وعلى وجه الخصوص للبروتينات ينتج بلورات intergrown. بناء على طلبها، DNA البلازميد للبناء (pET28a-NHIS-rPPEP-1) البيانات الحيود ويمكن توفير لأغراض تعليمية.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Genes / Vectors / cell strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a vector</td><td>Merck-Millipore</td><td>69864</td><td>Thrombin cleavable N-terminal His-tag</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; strain BL21 (DE3) Star</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C601003</td><td>RNase H deficient</td></tr><tr><td>Codon-optimized gene (for &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;) of PPEP-1 (CD630_28300)</td><td>Geneart (Thermo Fisher Scientific)</td><td>custom</td><td>amino acids 27-220</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antifoam B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5757</td><td>aqueous-silicone emulsion</td></tr><tr><td>Agar</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>AppliChem</td><td>A1008</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1087</td><td>Buffer grade</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>any</td><td></td><td>Buffer grade</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>AppliChem</td><td>A1073</td><td>Buffer grade</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215996</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol 100%</td><td>any</td><td></td><td>purest grade</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td>any</td><td></td><td>for storage and cryocooling of crystals</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment (general)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator</td><td>any</td><td></td><td>providing temperatures of 20 &amp;deg;C - 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Glassware</td><td>any</td><td></td><td>baffled Erlenmeyer flasks (50 ml - 2.8 L)</td></tr><tr><td>Centrifuge for large culture volumes</td><td>any</td><td></td><td>centrifuge for processing volumes up to 12 L</td></tr><tr><td>Sonicator Vibra-Cell VCX500</td><td>Sonics</td><td>SO-VCX500</td><td>or any other sonicator / cell disruptor</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>any</td><td></td><td>centrifuge providing speeds up to 150,000 x g</td></tr><tr><td>NiNTA Superflow resin</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Empty Glass Econo-Column</td><td>Bio-Rad</td><td>7371007</td><td>or any other empty glass or plastic column</td></tr><tr><td>Size exclusion chromatography column HiLoad Superdex 200 16/600</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>Chromatography system &amp;Auml;kta Purifier</td><td>GE Healthcare</td><td>28406264</td><td>or any other chromatography system</td></tr><tr><td>Dialysis tubing Spectra/Por 3</td><td>Spectrum Labs</td><td>132724</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis tubing closures</td><td>Spectrum Labs</td><td>132738</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafiltration units (concentrators) 10,000 NWCO</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis spectrophotometer</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment (crystallography)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low volume pipette 0.1-10 &amp;micro;l</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Positive displacement pipette Microman M10</td><td>Gilson</td><td>F148501</td><td></td></tr><tr><td>Crystallization robot</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well crystallization plates TTP IQ with three protein wells</td><td>TTP</td><td>4150-05810</td><td>or any other 96-well crystallization plate&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>24-well CombiClover Junior Plate</td><td>Jena Bioscience</td><td>EB-CJR</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Clear Sealing Tape</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-511</td><td></td></tr><tr><td>Siliconized Glass Cover Slides</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-225</td><td></td></tr><tr><td>Commercial crystallization screens: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal</td><td>Hampton Research</td><td>diverse</td><td></td></tr><tr><td>Commercial crystallization screens: Wizard, PACT++, JCSG++</td><td>Jena Bioscience</td><td>diverse</td><td></td></tr><tr><td>JBS Beads-for-Seeds</td><td>Jena Bioscience</td><td>CO-501</td><td></td></tr><tr><td>CrystalCap SPINE HT (nylon loops)</td><td>Hampton Research</td><td>diverse</td><td>loop sizes 0.025 mm - 0.5 mm</td></tr><tr><td>CrystalCap Vial</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-904</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic Foam Dewar 800 ml</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-673</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic Foam Dewar 2 L</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-675</td><td></td></tr><tr><td>Vial Clamp, Straight</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-670</td><td></td></tr><tr><td>CrystalWand Magnetic, Straight</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane 6 Vial Holder</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-711</td><td></td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-708</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane Color Coder - White</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-713</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Straight microforcep</td><td>any</td><td></td><td>for manipulation of sealing tape. &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Acupuncture needle</td><td>any</td><td></td><td>&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; from a pharmacy</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>any</td><td></td><td>for inspection of crystallization plates and crystal mounting, magnification up to 160X</td></tr></tbody></table>

production, crystallization and structure determination of c. difficile ppep-1 via microseeding and zinc-sad

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.

هى overexpressed rPPEP-1 في العديد من سلالات كولاي، مع أعلى عائد في كولاي BL21 (DE3) نجم (الشكل 1C). بعد أول NiNTA خطوة تقارب اللوني و6xHis العلامة يمكن المشقوق بنجاح خارج من أكثر من البروتين وفي خطوة NiNTA الثانية بروتين غير مهضوم يمكن فصلها تماما عن هضم البروتين الثرومبين (1D الشكل). على S200 16/600 العمود rPPEP-1 بلا علامات يهاجر كما مونومر مع عرضية المواجه الأرجح المقابلة لأنواع مثنوي (الشكل 2A). البروتين النقي (الشكل 2B) والعائد حوالي 50 ملغم بروتين من 1 لتر من E. ثقافة القولونية. rPPEP-1 يبلور في مختلف الظروف (الشكل 3)، وغالبا ما تحتوي على الفوسفات. وintergrown البلورات للغاية في جميع الظروف، لذلك كان وضوح الشمس الأمثل التي يتعين القيام بها. الرقم 4 يصور schem(ه) من الإجراء الأمثل أداء لبلورات النابعة من حالة الشاشة التجارية SaltRx E4 (52) (الشكل 3B-C). مرة أخرى ظهرت بلورات intergrown في الآبار A6-D6 (الشكل 4). وقد تم إعداد الأوراق المالية microseed من بلورات نمت في C6 حالة (2.55 M فوسفات الأمونيوم ثنائي القاعدة، 0.1 M تريس درجة الحموضة 8.5) من الشاشة الأمثل والمخفف 1: 1000 في المحلول الام. يومين إلى سبعة أيام بعد البذر مع مخزون البذور مخففة في أخرى 20 الشروط المتبقية مع قطرات اضحة لوحظت كبيرة بلورات شعرية واحدة من جودة عالية حيود (الشكل 5) في معظم قطرات. بعد تركيب البلورات في الحلقات النايلون (الشكل 5E) البيانات الحيود إلى 1.67 القرار A جمعت لتحديد هيكل عبر والزنك SAD (الجدول 1)، مع إشارة شاذة تمتد إلى 2 Å. بالإضافة إلى ذلك، تم جمع البيانات الحيود الأم إلى 1.4 القرار A لتحديد من المهزومةهيكل ح-القرار (الجدول 1). التركيب البلوري للrPPEP-1 يمكن حلها (الشكل 6) ونموذج الهيكل الأصلي المكرر إلى R / R العوامل خالية من 0.156 / 0.182 1.4 القرار A (ID PDB: 5A0P) 14 (لمزيد من الصقل إحصاءات انظر الجدول 1). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> هيكل / بيانات </td><td> ذروة الزنك والصحراء </td><td> محلي </td></tr><tr><td> جمع البيانات </td><td></td><td></td></tr><tr><td> مجموعة الفضاء </td><td> P2 1 2 1 2 1 </td><td> P2 1 2 1 2 1 </td></tr><tr><td> أ، ب، ج (أ) </td><td> 43.17، 71.68، 117.70 </td><td> 43.17، 71.77، 117.80 </td></tr><tr><td> α، β، γ (درجة) </td><td> 90، 90، 90 </tد&gt; <td> 90، 90، 90 </td></tr><tr><td> الطول الموجي (أ) </td><td> 1.28254 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> القرار (أ) </td><td> 45،5-1،67 (1،72-1،67) </td><td> 45،5-1،40 (1،49-1،40) </td></tr><tr><td> عدد الملاحظات </td><td> 779717 (34025) </td><td> 310074 (45851) </td></tr><tr><td> عدد الأفكار فريدة من نوعها </td><td> 80960 (5597) </td><td> 71874 (11172) </td></tr><tr><td> تعددية </td><td> 9.6 (6.1) </td><td> 4.3 (4.1) </td></tr><tr><td> كمال (٪) </td><td> 99.2 (93.0) </td><td> 98.2 (95.6) </td></tr><tr><td> Rmerge (٪) </td><td> 6.8 (56.5) </td><td> 5.2 (52.6) </td></tr><tr><td> &lt;I / σ (I)&gt; </td><td> 21.86 (2.81) </td><td> 15.66 (2.48) </td></tr><tr><td> CC (1/2) (٪) </td><td> 100 (85.1) </td><td> 99.9 (85.5) </td></tr><tr><td> إحصاءات الصقل </td><td></td><td></td></tr><tr><td> R ثORK / R د مجانا (٪) </td><td></td><td> 15.60 / 18.17 </td></tr><tr><td> عدد ذرات البروتين غير H- </td><td></td><td> 3109 </td></tr><tr><td> عدد جزيئات الماء </td><td></td><td> 532 </td></tr><tr><td> عدد أيونات / الذرات الثقيلة </td><td></td><td> 2 الزنك </td></tr><tr><td> عدد الجزيئات الأخرى </td><td></td><td> - </td></tr><tr><td> عدد المجموعات TLS / سلسلة </td><td></td><td> 9 </td></tr><tr><td> جذر متوسط ​​مربع الانحرافات </td><td></td><td></td></tr><tr><td> طول الرابطة (أ) </td><td></td><td> 0.006 </td></tr><tr><td> زوايا السندات (درجة) </td><td></td><td> 1.022 </td></tr><tr><td> متوسط معامل B (2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> جميع ذرات البروتين </td><td></td><td> 16.12 </td></tr><tr><td> ماء </td><td></td><td> 29.74 </td></tr><tr><td> ذرات أخرى </td><td></td><td> 10.12 </td></tr><tr><td> راماشاندران مؤامرة ه (٪) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> الأكثر تفضيلا </td><td></td><td> 98.72 </td></tr><tr><td> يسمح بالإضافة إلى ذلك </td><td></td><td> 1.28 </td></tr><tr><td> غير مسموح بها </td><td></td><td> 0 </td></tr><tr><td> دخول PDB </td><td></td><td> 5a0p </td></tr></tbody></table> الجدول 1: جمع البيانات والإحصاءات الصقل.

Watch this Scientific Journal Video about Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD at JoVE.com

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.

إنتاج وبلورة وتحديد هيكل<em&gt; C. صعب</em&gt; PPEP-1 عن طريق Microseeding والزنك والصحراء

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

production-crystallization-structure-determination-c-difficile-ppep-1

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

11.5K Views.  University of Cologne. Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein. 

Video: Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Physical interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane protein complexes and in dynamic processes such as transmembrane (TM) signaling and regulation of cell-surface protein levels. Understanding the structural features driving the association of particular sequences requires sophisticated biophysical and biochemical analyses of TM peptide complexes. However, the extreme hydrophobicity of TM domains makes them very difficult to manipulate using standard peptide chemistry techniques, and production of suitable study material often proves prohibitively challenging. Identifying conditions under which peptides can adopt stable helical conformations and form complexes spontaneously adds a further level of difficulty. Here we present a procedure for the production of homo- or hetero-dimeric TM peptide complexes from materials that are expressed in E. coli, thus allowing incorporation of stable isotope labels for nuclear magnetic resonance (NMR) or non-natural amino acids for other applications relatively inexpensively. The key innovation in this method is that TM complexes are produced and purified as covalently associated (disulfide-crosslinked) assemblies that can form stable, stoichiometric and homogeneous structures when reconstituted into detergent, lipid or other membrane-mimetic materials. We also present carefully optimized procedures for expression and purification that are equally applicable whether producing single TM domains or crosslinked complexes and provide advice for adapting these methods to new TM sequences.

Biophysical and biochemical studies of interactions among membrane-embedded protein domains face many technical challenges, the first of which is obtaining appropriate study material. This article describes a protocol for producing and purifying disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes that are suitable for structural analysis by solution nuclear magnetic resonance (NMR) and other analytical applications.

إنتاج ثاني كبريتيد استقرت مجمعات الببتيد عبر الغشاء الدراسات الإنشائية

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Chemistry

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant strains. Carbohydrate substrate binding proteins (SBPs) represent viable targets for the development of protein-based vaccines and new antimicrobials because of their extracellular localization and the centrality of carbohydrate import for pneumococcal metabolism, respectively. Described here is a rationalized integrated protocol to carry out a comprehensive characterization of SP0092, which can be extended to other carbohydrate SBPs from the pneumococcus and other bacteria. This procedure can aid the structure-based design of inhibitors for this class of proteins. Presented in the first part of this manuscript are protocols for biochemical analysis by thermal shift assay, multi angle light scattering (MALS), and size exclusion chromatography (SEC), which optimize the stability and homogeneity of the sample directed to crystallization trials and so enhance the probability of success. The second part of this procedure describes the characterization of the SBP crystals using a tunable wavelength anomalous diffraction synchrotron beamline, and data collection protocols for measuring data that can be used to resolve the crystallized protein structure.

A streamlined protocol for performing an extensive biochemical and structural characterization of a carbohydrate substrate binding protein from Streptococcus pneumoniae is presented.

وصف SP0092 الركيزة-ملزمة-بروتين النقل الكربوهيدرات البيوكيميائية والهيكلية

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for culturing therapeutically relevant cells or tissues. Hydrogels prepared from poly(ethylene glycol) (PEG) derivatives are increasingly used for a variety of tissue engineering applications, in part due to their tunable and cytocompatible properties. In this protocol, we utilized thiol-ene step-growth photopolymerizations to fabricate PEG-peptide hydrogels for encapsulating pancreatic MIN6 b-cells. The gels were formed by 4-arm PEG-norbornene (PEG4NB) macromer and a chymotrypsin-sensitive peptide crosslinker (CGGYC). The hydrophilic and non-fouling nature of PEG offers a cytocompatible microenvironment for cell survival and proliferation in 3D, while the use of chymotrypsin-sensitive peptide sequence (CGGY&darr;C, arrow indicates enzyme cleavage site, while terminal cysteine residues were added for thiol-ene crosslinking) permits rapid recovery of cell constructs forming within the hydrogel. The following protocol elaborates techniques for: (1) Encapsulation of MIN6 &beta;-cells in thiol-ene hydrogels; (2) Qualitative and quantitative cell viability assays to determine cell survival and proliferation; (3) Recovery of cell spheroids using chymotrypsin-mediated gel erosion; and (4) Structural and functional analysis of the recovered spheroids.

Generation and Recovery of &#946;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

The following protocol provides techniques for encapsulating pancreatic &#x03B2;-cells in step-growth PEG-peptide hydrogels formed by thiol-ene photo-click reactions. This material platform not only offers a cytocompatible microenvironment for cell encapsulation, but also permits user-controlled rapid recovery of cell structures formed within the hydrogels.

جيل واسترداد خلايا β الأجسام الشبه الكروية من الهلاميات المائية PEG-الببتيد الخطوة النمو

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Bioengineering

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States alone, an average of 41,400 deaths and 1.86 million hospitalizations are caused by influenza virus infection each year 1. Point mutations in the polymerase basic protein 2 subunit (PB2) have been linked to the adaptation of the viral infection in humans 2. Findings from such studies have revealed the biological significance of PB2 as a virulence factor, thus highlighting its potential as an antiviral drug target.
The structural genomics program put forth by the National Institute of Allergy and Infectious Disease (NIAID) provides funding to Emerald Bio and three other Pacific Northwest institutions that together make up the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease (SSGCID). The SSGCID is dedicated to providing the scientific community with three-dimensional protein structures of NIAID category A-C pathogens. Making such structural information available to the scientific community serves to accelerate structure-based drug design.
Structure-based drug design plays an important role in drug development. Pursuing multiple targets in parallel greatly increases the chance of success for new lead discovery by targeting a pathway or an entire protein family. Emerald Bio has developed a high-throughput, multi-target parallel processing pipeline (MTPP) for gene-to-structure determination to support the consortium. Here we describe the protocols used to determine the structure of the PB2 subunit from four different influenza A strains.

Structure-based drug design plays an important role in drug development. Pursuing multiple targets in parallel greatly increases the chance of success for lead discovery. The following article highlights how the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease utilizes a multi-target approach for gene-to-structure determination of the PB2 influenza A subunit.

متعدد الاهداف نهج المعالجة المتوازية لتحديد الجينات إلى هيكل البلمرة الأنفلونزا PB2 الوحدة الفرعية

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

Immunology and Infection

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and IKK&#946;. Upon activation, the IKK complex phosphorylates the I&#954;B molecules leading to NF-&#954;B nuclear translocation and activation of target genes. Inhibition of the NEMO/IKK interaction is an attractive therapeutic paradigm for the modulation of NF-&#954;B pathway activity, making NEMO a target for inhibitors design and discovery. To facilitate the process of discovery and optimization of NEMO inhibitors, we engineered an improved construct of the IKK-binding domain of NEMO that would allow for structure determination of the protein in the apo form and while bound to small molecular weight inhibitors. Here, we present the strategy utilized for the design, expression and structural characterization of the IKK-binding domain of NEMO. The protein is expressed in E. coli cells, solubilized under denaturing conditions and purified through three chromatographic steps. We discuss the protocols for obtaining crystals for structure determination and describe data acquisition and analysis strategies. The protocols will find wide applicability to the structure determination of complexes of NEMO and small molecule inhibitors.

We describe protocols for the structure determination of the IKK-binding domain of NEMO by X-ray crystallography. The methods include protein expression, purification and characterization as well as strategies for successful crystal optimization and structure determination of the protein in its unbound form.

الإنتاج ، البلورة ، وتحديد الهيكل للمجال الملزم IKK من نيمو

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion cofactors triggering a dimer-dodecamer transition. Upon metal ion binding, several structural modifications occur in the active site and at the interaction interface, shaping dimers to promote the self-assembly. To observe such modifications, stable oligomers must be isolated prior to structural study. Reported here is a method that allows the purification of stable dodecamers and dimers of TmPep1050, an M42 aminopeptidase of T. maritima, and their structure determination by X-ray crystallography. Dimers were prepared from dodecamers by removing metal ions with a chelating agent. Without their&#160;cofactor, dodecamers became less stable and were fully dissociated upon heating. The oligomeric structures were solved by the straightforward molecular replacement approach. To illustrate the methodology, the structure of a TmPep1050 variant, totally impaired in metal ion binding, is presented showing no further breakdown of dimers to monomers.

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

This protocol has been developed to study the dimer-dodecamer transition of TmPep1050, an M42 aminopeptidase, at the structural level. It is a straightforward pipeline starting from protein purification to X-ray data processing. Crystallogenesis, data set indexation, and molecular replacement have been emphasized through a case of study, TmPep1050H60A H307A variant.

التصوير البلوري بالأشعة السينية لدراسة انتقال الدولة أوليغومريك من Thermotoga maritima M42 أمينوببتيداسي TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial crystallography experiments at both synchrotrons and XFELs. The method is based upon an understanding of the protein crystal phase diagram, and how that knowledge can be utilized. The method is divided into three stages: (1) optimizing crystal morphology, (2) transitioning to batch, and (3) scaling. Stage 1 involves finding well diffracting, single crystals, hopefully but not necessarily, presenting in a cube-like morphology. In Stage 2, the Stage 1 condition is optimized by crystal growth time. This strategy can transform crystals grown by vapor diffusion to batch. Once crystal growth can occur within approximately 24 h, a morphogram of the protein and precipitant mixture can be plotted and used as the basis for a scaling strategy (Stage 3). When crystals can be grown in batch, scaling can be attempted, and the crystal size and concentration optimized as the volume is increased. Endothiapepsin has been used as a demonstration protein for this protocol. Some of the decisions presented are specific to endothiapepsin. However, it is hoped that the way they have been applied will inspire a way of thinking about this procedure that others can adapt to their own projects.

The aim of this article is to give the viewer a solid understanding of how to transform their small-volume, vapor-diffusion protocol, for growing large, single protein crystals, into a large-volume batch micro-crystallization method for serial crystallography.

تحسين نمو بلورات الإندوثيابسين لتجارب علم البلورات التسلسلي

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We describe a versatile microfluidic chip that enables the production of crystals by the efficient method of counter-diffusion. The convection-free environment provided by the microfluidic channels is ideal for crystal growth and useful to diffuse a substrate into the active site of the crystalline enzyme. Here we applied this approach to the CCA-adding enzyme of the psychrophilic bacterium Planococcus halocryophilus in the presented example. After crystallization and substrate diffusion/soaking, the crystal structure of the enzyme:substrate complex was determined at room temperature by serial crystallography and the analysis of multiple crystals directly inside the chip. The whole procedure preserves the genuine diffraction properties of the samples because it requires no crystal handling.

A versatile microfluidic device is described that enables the crystallization of an enzyme using the counter-diffusion method, the introduction of a substrate in the crystals by soaking, and the 3D structure determination of the enzyme:substrate complex by a serial analysis of crystals inside the chip at room temperature.

التبلور والتصميم الهيكلي للانزيم: مجمع الركيزة بواسطة البلورات التسلسلية في رقاقة Microfluidic متعددة الاستخدامات

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

بلورة البروتينات الغشائية لتحديد الهيكل باستخدام Mesophases Lipidic

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Biology

A Purification and In Vitro Activity Assay for a (p)ppGpp Synthetase from Clostridium difficile

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to substrates to create phosphorylated products. The use of &#947;-32-P labeled NTP precursors allows simultaneous monitoring of substrate utilization and product formation by radiography. Thin layer chromatography (TLC) on cellulose plates allows rapid separation and sensitive quantification of substrate and product. We present a method for utilizing the thin-layer chromatography to assay the pyrophosphokinase activity of a purified (p)ppGpp synthetase. This method has previously been used to characterize the activity of cyclic nucleotide and dinucleotide synthetases and is broadly suitable for characterizing the activity of any enzyme that hydrolyzes a nucleotide triphosphate bond or transfers a terminal phosphate from a phosphate donor to another molecule.

A Purification and In Vitro Activity Assay for a pppGpp Synthetase from Clostridium difficile

Here, we describe a method for purifying histidine-tagged pyrophosphokinase enzymes and utilizing thin layer chromatography of radiolabelled substrates and products to assay for the enzymatic activity in vitro. The enzyme activity assay is broadly applicable to any kinase, nucleotide cyclase, or phosphor-transfer reaction whose mechanism includes nucleotide triphosphate hydrolysis.

تنقية و في المختبر نشاط الإنزيم (ع) بجب سينثاتيز من المطثيّة العسيرة

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to ...

إنتاج وبلورة وتحديد هيكل

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video