هذا البروتوكول يجعل من الممكن رؤية أنواع مختلفة من الثقافات ومراقبة تفاعلاتها مع مصفوفة خارج الخلوية. الميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو أن المصفوفة التي تحصل عليها يتم تجديدها بواسطة الخلايا الليفية وأنها ستكون مشابهة تماما لتلك التي تم إنشاؤها في الجسم الحي. ونحن نعتقد أن هذا المرض تأتي غير ذات صلة عند استخدام الخلايا الليفية الحصول على من أطباق الخبز.
إنشاء مصفوفة من هذه الخلايا يمكن أن ينير لنا كيف يمكن أن تؤثر، على سبيل المثال، الحالة المستمرة. ويمكن أيضاً تطبيق هذه الأساليب على، على سبيل المثال، الدراسات الفيزيائية على الناجين من المصفوفة. التصور من هذا البروتوكول من المهم أن نلاحظ تقنية الأنابيب من الخطوات التي لديك لوصي.
عند محاولة هذه الطرق للمرة الأولى قد يستغرق وقتاً أطول مما كان متوقعاً. نصيحتنا هي أن نستعد قدر الإمكان مقدماً واستخدام فترات المدة للاستعداد للخطوات التالية. ابدأ بإعداد 0.2٪ جيلاتين و1٪ من الجلوتارالديهيد و محلول أيثانولامين واحد مُولس وفقاً لاتجاهات المخطوطة.
التأكد من تشغيل كل حل من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر قبل الاستخدام. المقبل، وإعداد حمض الاسكوربيك وتحلل العازلة. تخفيف القلم-العقدية برنامج تلفزيوني كما هو موضح في المخطوطة وإعداد DMEM مع 10٪ FBS.
إعداد الحرارة المشوهة 2٪ BSA عن طريق إضافة 2 غراما من BSA إلى 100 ملليلتر من الماء المعقم والاحترار في حمام الماء المغلي لمدة سبع دقائق. ثم, ملحق FBS مع البنسلين, ستربتوميسين, جنتاميسين, و amphotericin B.Culture التيلوميرات المؤتلفة transed خلد الخلايا الليفية القلفة البشرية وDEM مع 10٪ FBS والحفاظ عليها في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. لإنشاء ثقافة الخلايا الليفية الأولية، وقطع عينات الأنسجة إلى قطع صغيرة من ما يقرب من ملليلتر اثنين إلى ثلاثة مكعبات والبذور لهم في FPS مع تركيز عال من المضادات الحيوية.
عندما تظهر الخلايا الليفية الأولى، استبدل الوسيط بـ FBM لصيانة الخلايا. إضافة ملليلترين من 0.2٪ حل الجيلاتين إلى كل بئر من لوحة ستة بئر واحتضان لمدة ساعة واحدة لمدة 37 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. بعد الحضانة، الاستنشاق الجيلاتين وغسل كل جيدا مع ملليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني.
إضافة ملليلترين من 1٪ من الجلوتارالدهيد إلى كل بئر واحتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاثين دقيقة والتي سوف عبر ربط الجيلاتين. البيربيرات الجلوتارالديهيد وغسل الآبار في ملليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق. لمنع الجلوتارالدهيد المتبقية، إضافة ملليلتر من واحد الأيثانولامين مولر واحتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاثين دقيقة.
التعرق الإيثانول وكرر يغسل مع برنامج تلفزيوني. إضافة ملليلتر واحد من DMEM مع 10٪ FPS. إذا تحول المتوسط على الفور الوردي، إزالته، وغسل الآبار مرة واحدة مع ملليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني وإضافة ملليلتر آخر من DMEM.
بذور ملليلتر واحد من تعليق الخلايا الليفية مع 5 × 10 الخلايا الخامسة في كل بئر والثقافة الخلايا حتى يتم التوصل إلى التقاء 100٪. ثم قم بإزالة الوسط واستبدله بـ DMEM مع 10٪ FBS و 50 ميكروغرام لكل ملليلتر حمض الأسكوربيك. استبدال الوسط كل يومين لمدة ستة أيام.
بعد يومين من آخر علاج حمض الاسكوربيك إزالة المتوسطة وغسل الآبار مع ملليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني. بعد يغسل، ببطء إضافة ملليلتر واحد من العازلة مسخن قبل واحتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس إلى عشر دقائق حتى يتم lyslysed الخلايا الليفية. دون إزالة العازلة تحلل، إضافة بعناية ملليلتر من برنامج تلفزيوني إلى كل بئر ومن ثم التعرق ما يقرب من 2.5 ملليلتر.
كرر هذه العملية مرتين لمجموع ثلاثة يغسل. بعد الغسيل النهائي، أضف ميليتين من برنامج تلفزيوني مع العقدية القلم. ختم لوحة مع الفيلم والاحتفاظ بها في أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر.
يمكنك زراعة خلايا HUVEC و EMB-2 مع 2٪ FBS حتى أقصى التقاء. ثم استبدال المتوسطة مع EBM-2 دون FBS لمدة ثماني ساعات. لتحضير المصفوفات لبذات الخلايا، قم بإزالتها من الثلاجة واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
كتلة المصفوفات بإضافة مليلترين من الحرارة المشوهة 2٪ BSA واحتضان لهم في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم، الطامح BSA وغسلها مع ملليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني. البذور 2 × 10 إلى خلايا HUVEC الخامسة إلى كل بئر من لوحة المغلفة مع المصفوفات المستمدة من الخلايا الليفية.
احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة ثم فحص الهياكل مثل أنبوب تحت مجهر حقل مشرق القياسية في التكبير 20-40x. وقد استخدم هذا البروتوكول لدراسة آثار العلاج PDGF على تشكيل المصفوفة الليفية المشتقة. وأظهرت الخلايا الليفية الثالثة BGH التي تم احتضانها مع PDGF توزيع الخلايا أكثر محاذاة في المصفوفات من تلك المحتضنة دون PDGF.
تم زيادة الكولاجين 1 والتعبير البروتين فيبرومينيكين في المصفوفات المستمدة من الخلايا الليفية التي حفزت PDGF وبالتالي تم زيادة سمك المصفوفة. وعلاوة على ذلك، توضح مخططات الرسم البياني الاتجاهي أن الكولاجين 1 والليفي يظهران أنماطًا متوازية. عندما تم بذر خلايا HUVEC على مصفوفات مزيل الخلية المستمدة من الخلايا الليفية التي حفزت PDGF أنها وضعت هياكل أكثر الشعيرات الدموية مثل مما كانت عليه في ظل ظروف محفزة لا شيء.
التأكد من أن المصفوفات المستمدة من PDGF-BB تنشيط الخلايا الليفية تعزيز تنشيط الخلايا البطانية. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم إعداد الحلول مسبقًا والتأكد من أن الخلايا جاهزة قبل البدء. إلى جانب الخلايا البطانية يمكن أيضا أن تكون مصفوفات الدراسات بذر مع الخلايا الظهارية ويمكن ملاحظة رد فعل على العوامل الخارجية مثل حالة في وسائل الإعلام أو الأدوية السامة للخلايا.
إن توليد مصفوفة خارج الخلية أمر بالغ الأهمية في تصميم تجارب الأورام الكلية.
