هذا البروتوكول يبين أن الإشعاع يؤثر على خصائص المصفوفة خارج الخلية من الأنسجة الدهنية في لوحة الدهون الثدي murine. إضافة الإشعاع في نموذج إزالة الخلايا لم يتم من قبل. تستخدم هذه التقنية عدة خطوات غسيل تخدم كل منها غرضًا كيميائيًا فريدًا في عملية إزالة الخلايا.
خصوصية هذه التقنية يسمح لغسلات الكيميائية ألطف، للحفاظ على خصائص الأنسجة بشكل أفضل. يحدث الانتكاس سرطان الثدي بعد العلاج، وخاصة في الحالات السلبية الثلاثية. تقييم كيفية المصفوفة خارج الخلية المشعة يغير سلوك الخلايا السرطانية سيؤدي إلى اكتشافات هامة حول آليات تكرار.
بعد العينات تشعيع، وذلك باستخدام مصدر سيزيوم، ونقل MFP المشعع وكامل وسائل الإعلام RPMI إلى خزانة السلامة الحيوية. ملء ستة سنتيمترات أو 10 أطباق سنتيمتر مع وسائل الإعلام ما يكفي لغمر MFP. احتضان في 37 درجة مئوية، مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون، لمدة يومين.
أولاً، ضع MFP في أطباق ستة سنتيمترات مع خمسة ملليلتر من محلول تريبسين-EDTA. رش ومسح الأطباق مع 70٪ الإيثانول واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. استخدام 0.7 ملليلتر مصافي لغسل MFP مع المياه ديوند، عن طريق صب الماء على الأنسجة ثلاث مرات.
استخدام ملقط لتدليك يدويا الأنسجة بين يغسل. المقبل، وتجفيف الأنسجة لفترة وجيزة على مهمة حساسة مسح ووزنها. ضع الأنسجة المجففة في بوبر ما قبل الأوتكفايد، يحتوي على شريط تحريك مناسب الحجم وغطى الأنسجة بـ 60 ملليلتر من 3٪ t-octylphenoxypolyethoxyethanol لكل غرام من الأنسجة.
يُحرّك المزيج لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم افرغ محتويات القارص في مصفاة شطف beaker بالماء الأيونية وصب هذا على الأنسجة.
كرر هذه العملية الشطف مرتين أكثر، مع التأكد من استخدام ملقط لتدليك يدويا الأنسجة بين يشطف. بعد ذلك، جفف لفترة وجيزة الأنسجة على مهمة حساسة مسح ووزنها. ضع الأنسجة وقضبان التحريك مرة أخرى إلى نفس الأكواب واغطيها بـ 60 ملليلتر من حمض الديوكسيكوليك بنسبة 4٪ لكل غرام من الأنسجة.
يُحرّك المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، تفريغ محتويات القارب في مصفاة شبكة ، وشطف beaker بالماء الأيونية وصب هذا على الأنسجة. كرر هذه العملية الشطف مرتين أكثر، مع التأكد من استخدام ملقط لتدليك يدويا الأنسجة بين يشطف.
تجفيف لفترة وجيزة الأنسجة المشطفة على مهمة حساسة مسح ووزنها. ضع الأنسجة المجففة في نفس القارق ، إلى جانب المياه الطازجة ذات الأيونات ، مع 1٪ من البنسلين -الستربتوميسين. تغطية beaker بإحكام مع فيلم البارافين وترك في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي استنزاف محتويات القارق في مصفاة، وتجفيف الأنسجة لفترة وجيزة على مهمة حساسة مسح ووزنها. ثم، ضع MFP في نفس القارب مع شريط التحريك المناسب الحجم. تغطية الأنسجة مع 60 ملليلتر من محلول يحتوي على 4٪ الإيثانول و 0.1٪ حمض peracetic لكل غرام من الأنسجة.
يُحرّك المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. تخلص محتويات القارص في مصفاة 0.7 ملليمتر. استخدام ملقط لتدليك يدويا الأنسجة ووضع محتويات مرة أخرى في beaker.
اغسل الأنسجة عن طريق تغطيتها بـ 60 ملليلتر من 1X PBS لكل غرام من الأنسجة. يُحرّك المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدّة 15 دقيقة. كرر عملية الغسيل هذه مرة أخرى.
بعد ذلك، تخلص محتويات القارص في مصفاة 0.7 ملليمتر. باستخدام ملقط، تدليك يدويا الأنسجة ووضع محتويات مرة أخرى في القارق. اغسل الأنسجة عن طريق تغطيتها بـ 60 ملليلتر من الماء المأون لكل غرام من الأنسجة.
يُحرّك المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدّة 15 دقيقة. كرر عملية الغسيل هذه مرة أخرى. تجفيف لفترة وجيزة الأنسجة المغسولة على مهمة حساسة مسح ووزنها.
تفريغ الأنسجة والمحتويات في مصفاة واستخدام ملقط لتدليك يدويا الأنسجة. ضع محتويات مرة أخرى في القارض وتغطية الأنسجة مع 60 ملليلتر من 100٪ ن-بروبانول لكل غرام من الأنسجة. يُحرّك المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
ثم، وتجفيف لفترة وجيزة الأنسجة على مهمة حساسة مسح ووزنها. تفريغ الأنسجة والمحتويات في مصفاة 0.7 ملليمتر واستخدام ملقط لتدليك الأنسجة يدويا. ضع المحتويات مرة أخرى في القارس وغسل الأنسجة عن طريق تغطيتها بـ 60 ملليلتر من الماء الأيوني لكل غرام من الأنسجة.
يُحرّك المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدّة 15 دقيقة. كرر عملية الغسيل هذه ثلاث مرات. بعد هذا، وتجفيف لفترة وجيزة الأنسجة على مهمة حساسة مسح ووزنها.
نقل الأنسجة إلى أنبوب 15 ملليلتر المسمى وتجميد في السلبية 80 درجة مئوية بين عشية وضحاها. أولاً، املأ حاوية ضحلة بالنيتروجين السائل. إزالة العينات من الفريزر وتزن كل MFP مزيل الهيمية.
ضع عينة واحدة في القذيفة، استخدم قفازاً مبرداً ليمسك بهون الهاون في النيتروجين السائل. ثم، استخدام الحشرات، تعلق على حفر باليد، لطحن العينة. طحن في فترات دقيقة واحدة للتحقق من التقدم وإزالة اليد قفاز من النيتروجين السائل.
كرر عملية الطحن هذه لجميع العينات، مع التأكد من رش ومسح هاون وحشرات بالإيثانول بين كل عينة. تخزين العينات مسحوق في أنابيب 15 ملليلتر في درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام. للبدء، إزالة العينات من الثلاجة وذوبان في درجة حرارة الغرفة.
في حين أن العينات تذوب، ومزيج البيبسين في حمض الهيدروكلوريك لتشكيل حل بيبسيين HCL. بعد ذلك، أضف عينة من مسحوق وحل Pepsin-HCL إلى أنبوب 15 ملليلتر، وأضف شريطًا صغيرًا ويحرك لمدة 48 ساعة. بعد هذا، ضع الأنابيب على الجليد لمدة خمس دقائق.
إضافة 10X برنامج تلفزيوني لكل عينة، بحيث يكون الحل النهائي تركيز 1X PBS. ثم أضف 10٪ حجم/حجم، 0.1 هيدروكسيد الصوديوم الولي لكل حل، للوصول إلى 7.4 pH، باستخدام ورق pH لاختبار كل حل على حدة. باستخدام محلول هلام 7.4 درجة الH، resuspend gfp بيليه و luciferase المسمى الخلايا 4T1 إلى تركيز إما 500، 000 أو 1، 000، 000 خلية لكل ملليلتر من محلول هلام.
إضافة 16 ميكرولترات من حل الخلايا هلام إلى كل بئر من 16 بئرا شريحة غرفة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، إضافة 100 microliters من وسائل الإعلام دورة ً كاملة لـ RPMI لكل بئر. مواصلة احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
ثم استخدم مجهر الفلوريس لمراقبة الخلايا في الطول الموجي للإثارة من 519 نانومتر وطول موجة انبعاثات من 618 نانومتر. في هذه الدراسة، تتم دراسة الآثار الطبيعية إشعاع الأنسجة، وذلك باستخدام الهيدروجيلات مصفوفة خارج الخلية. يتم استخدام تلطيخ الهماتوسلين واليوسين لتأكيد إزالة الخلايا ، من خلال فقدان النوى وآثار الحمض النووي الأخرى.
في حين يتم استخدام تلطيخ O الزيت لتقييم محتوى الدهون وتأكيد الاحتفاظ مورفولوجيا ديباسيت. يتم تقييم الخصائص الريولوجية للهيدروجيل ECM عند 37 درجة مئوية. معامل التخزين أعلى من معامل الخسارة لجميع الظروف، مما يدل على تشكيل هيدروجيل مستقر.
ثم يتم تغليف GFP و luciferase المسمى 4T1 خلايا سرطان ماماري في الهيدروجيل. يتم فحص انتشار الخلايا عن طريق المجهر المفلور، عن طريق قياسات الإضاءة وتلطيخ القدرة على البقاء، بعد 48 ساعة من التغليف. تظهر الهيدروجيل المشعة اتجاهًا متزايدًا في انتشار الخلايا السرطانية.
Phalloidin conjugate يستخدم لتصور F-Actin في الخلايا المغلفة. تذكر أن تبرد هاون قبل وضع الأنسجة داخل الطاحونة، وقذائف هاون دافئة قد يؤدي إلى الطحن غير مكتملة. توخي الحذر عند التعامل مع ن بروبانال والبيبين، فقط فتح ن بروبانال وغيرها من العوامل ديسيلولارالاريا تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية.
إذا كان ذلك ممكنا ، وزن البيبسين تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية ، كما أن هناك خطر من استنشاق. يمكن تقييم تغيرات تكوين ECM بعد التشعيع و إزالة الخلايا باستخدام قياس الطيف الكتلي و Spectroscopy Raman. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تحليل بنية الألياف الهيدروجيل ECM عن طريق المسح المجهري الإلكترون.
هذه الطريقة لديها القدرة على التوسع في دراسة آثار الإشعاع على الخلايا السرطانية، وليس فقط ولكن أيضا الخلايا المناعية، فضلا عن الأنسجة التي تعاني من أضرار الإشعاع، نتيجة للعلاج. هذه التقنية إزالة الخلايا سوف تسمح للباحثين لتقييم خصائص المصفوفة خارج الخلية من الأنسجة التالية للإشعاع، وهو خيار علاج مهم في معظم أنواع السرطان.
