زراعة الخلايا الليفية في أنسجة الورم spheroid استبداد أفضل بكثير من نظام 2D المستخدمة على البلاستيك قاسية. يسمح لدراسة التمايز الخلايا الليفية في بيئة تشبه الورم. في هذه الطريقة ، فإن صلابة عمل البلاستيك ثقافة الخلية لا يؤثر بشكل أثري التمايز الخلايا الليفية.
بدلا من ذلك، يمكن تحليل تأثير تفاعل مصفوفة الخلية على الورم المُستحث من التمايز من الخلايا الليفية في المختبر. لبدء هذا الإجراء، والحصول على وسائل الإعلام ثقافة الخلية، والتي هي MEM تستكمل مع 1٪ تنشيط FBS الحرارة و 1٪ البنسلين ستريبتوميسين. أيضا، الحصول على ستة مليغرام لكل مليلتر ميثيل سيللوز الحل.
اخلط جزء واحد من ميثيل سيلولوز مع ثلاثة أجزاء من وسائط ثقافة الخلية لإعداد حل تشكيل الزفير. Resuspend حديثا ذاب خلدت الخلايا الليفية العادية أو أنواع الخلايا الأخرى كما هو مبين في بروتوكول النص في حل تشكيل spheroid. إذا تم تضمين السيتوكينات أو مثبطات integrin في الدراسة، إضافة هذه المركبات إلى تعليق الخلية من أجل مُجَرَّد لهم في الـ spheroids أثناء تشكيلها.
عند الاقتضاء، إضافة مركبات مثبطات جنبا إلى جنب مع 10 نانوغرام لكل ملليلتر من بيتا TGF واحد لتحريك التمايز في الخلايا الليفية العادية خلدت. توزيع 100 ميكرولترات من حل تشكيل spheroid في كل بئر من أسفل جولة 96 لوحة متعددة جيدا. الماصات الحل في كل بئر صعودا وهبوطا عدة مرات لخلط.
ثم، احتضان لوحة في حاضنة ثقافة الخلية في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة للسماح واحد spheroid أن تتشكل في كل بئر. أولا، قطع نهاية طرف ماصة لتكبير الفوهة. بعد اكتمال الحضانة، استخدم هذه الماصات المقزّصة لجمع الـ spheroids في أنبوب رد فعل واحد 1.5 ملليلتر لكل حالة تجريبية أو لكل بروتين يتم تحليله.
الطرد المركزي spheroids في 1000 مرات G لحوالي 30 إلى 60 ثانية. إزالة بعناية الميثيلcellulose التي تحتوي على عظمى عن طريق pipetting التأكد من عدم إزعاج spheroids بيليه. وينبغي اتخاذ عناية خاصة عند نقل الزفيرويدات إلى أنابيب التفاعل.
تأكد من أنك لم يكن لديك القوى الانجراف القص عن طريق قطع طرف. من المهم أيضا أن تقوم بجمع جميع الـ spheroids. أثناء عملية الغسيل، تأكد من عدم فقدان الـ spheroids بواسطة الطموح.
لغسل spheroids إضافة 50 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني X واحد. أجهزة الطرد المركزي في 1000 مرة G لمدة 30 إلى 60 ثانية. ثم إزالة بعناية برنامج تلفزيوني عن طريق الأنابيب.
اعتمادا على البروتين أن تكون ملطخة، إصلاح spheroids إما مع 50 ميكرولترات من 4٪ شبهفورمالدهيد وبرنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. غسل spheroids مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح سابقا. Permeabilize الخلايا مع 0.1٪ تريتون X وBBS لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ثم، غسل spheroids في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات كما هو موضح سابقا. إضافة برنامج تلفزيوني يحتوي على 5٪ FBS و 2٪ BSA إلى spheroids واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة لمنع مواقع التفاعل البروتين غير محددة. الآن، احتضان spheroids مع 30 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية وبرنامج تلفزيوني مع 2.5٪ FBS و 1٪ BSA في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي، غسل spheroids في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات كما هو موضح سابقا. بعد ذلك، احتضان spheroids مع 30 ميكرولترات من الأجسام المضادة الثانوية وبرنامج تلفزيوني مع 2.5٪ FBS و 1٪ BSA في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة. اغسل الـ spheroids في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات كما سبق وصفه.
المقبل، احتضان الخلايا مع 30 ميكروليترس من حل تلطيخ Dappy لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل الـ spheroids في برنامج تلفزيوني مرة واحدة كما هو موضح سابقاً. باستخدام ماصة باستور الزجاج، وضع spheroids على شريحة زجاجية وإسقاطة من برنامج تلفزيوني.
استخدام مجهر الليزر المسح الضوئي لتصوير spheroids عن طريق المجهر الفلوريسنس في تكبير 10 مرات. خذ المقطع البصرية العرضية المختلفة من spheroid في السهول البصرية المختلفة من المكدس Z. صورة تمثيلية من تلطيخ الفلورسنت من spheroids homo من الخلايا الليفية العادية البنكرياس مقارنة مع spheroids homo من السرطان الخالدة الليفية المرتبطة يظهر إشارة زيادة لوثة ألفا ثلاثة فرعية في الخلايا المتمايزة.
ثم يتم تحديد كمية إشارة الفلوريسنس للخلايا في الزفيريد مع صور المكدس Z من 3D spheroid ومستويات النسخ من الجين ألفا ثلاثة فرعية الوحدة الفرعية المحددة من قبل qPCR. كل هذه النتائج تثبت أن ألفا ثلاثة integrin هو أعلى تنظيما في سرطان خلد المرتبطة الخلايا الليفية بالمقارنة مع نظيره العادي. وهذا يثبت أن integrin ألفا ثلاثة بيتا واحد يمكن اعتباره علامة للتمايز الخلايا الليفية البنكرياس.
هذا الأسلوب هو مناسبة بشكل مثالي ل capitulate الأنسجة الذاتية الموجودة عموما في الأجهزة والكتل السرطانية حيث صلابة مصفوفة الخلية اضافية يحدد مصير الخلية. ثقافة Spheroids هو نموذج متعدد الاستخدامات التي يمكن دمجها مع غيرها من المقايسات التحليلية بعد تفكك spheroid مثل كمية في الوقت الحقيقي PCR وكامل القياسات. Paraformaldehyde المستخدمة لتثبيت الزفيرويدات هو عامل كيميائي خطير.
يجب ارتداء القفازات وارتداء العينين للحماية.
