يوضح هذا البروتوكول أسلوباً جديداً لتحرير الجينوم المتعدد من Saccharomyces cerevisiae عن طريق إدخال أشرطة متعددة التعبير على loci مختلفة في خطوة تحويل واحدة. هذا الاستنساخ الحرة plasmid نهج التجميع للتعبير عن مجموعة كررنا واحد ، يؤدي إلى بروتوكول تحرير الجينوم سريعة وفعالة ومرنة. سوف نهندس خلايا الخميرة من النوع البري، لإنتاج الكاروتينات من خلال إدخال جينات غير متغايرة مجانية على لُوَس الجينومية الحرة.
مجموعة crRNA واحد يتكون من crRNAs الفردية الحرة التي أعرب عنها من RNA البوليميراز المروج الحرة. Cas12a العمليات في الجسم الحي مجموعة crRNA في crRNAs الفردية. دليل crRNAs Cas12a إلى loci الهدف على الحمض النووي الجينومي حيث Cas12a يقدم فواصل حبلا مزدوجة.
شظايا الحمض النووي إلى الأسفل إعادة الدمج في إعادة الدمج في الجسم الحي والاندماج في الحمض النووي الجينومي. وسيكون إثبات البروتوكول كلاوديا سيوروكوت، طالبة دكتوراه. جيفري فان Wijk، عالم مشارك.
و (بريندا فونك) عالمة مساعدة كبيرة من مختبرنا بعد الحصول على صفيفة crRNA واحدة لتجارب تحرير الجينوم متعددة من الحمض النووي الاصطناعية، وإعداد مزيج التضخيم PCR، وتحميل الصفيف في الدراجات الحرارية للتضخيم. لتحليل منتجات PCR بواسطة الكهرباء، قم بتشغيل العينات على جل agarose بنسبة 0.8٪في 5 V/cm لمدة 40 دقيقة.
تحميل سلم الحمض النووي مع شظايا الحمض النووي تتراوح بين 100 10000 أزواج قاعدة ثم تنقية المنتجات PCR باستخدام مجموعة تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لتحويل الخميرة، تبدأ قبل زراعة الخميرة نوع البرية في قارورة 100 مل تحتوي على 20 مل من الخميرة استخراج dextrose الببتون أو YEPD المتوسطة. لاحتضان بين عشية وضحاها، في 30 درجة مئوية، و 250 التناوب في الدقيقة الواحدة في صباح اليوم التالي، تلقيح 20 مل من YEPD المتوسطة الطازجة مع حجم محسوب من الخميرة ما قبل الثقافة بين عشية وضحاها.
ضع الثقافة في حاضنة الهز حتى يتم الوصول إلى كثافة بصرية قدرها 1.0، تقاس عند 600 نانومتر. حصاد خلايا الخميرة عن طريق الطرد المركزي. غسل بيليه خلية الخميرة في 20 مل من درجة حرارة الغرفة demineralized المياه، تليها طرد مركزي إضافية.
Resuspend بيليه في 100 ميكرولترات من محلول ليثيوم خلات تريس EDTA ، ونقل الخميرة إلى أنبوب microcentrifuge. مزيج خمسة ميكرولترات من الحمض النووي الناقل واحد الذين تقطعت بهم السبل وميكروغرام واحد من psmid pCSN067 مع تعليق خلية الخميرة. ثم مزيج 600 ميكروليتر من البولي ايثيلين جلايكول LIAc-TE حل مع العينة.
احتضان خلايا الخميرة وplsmid لمدة 30 دقيقة في 30 درجة مئوية و 450 prm في كتلة الحرارة أعلى الجدول. في نهاية الحضانة، اخلط 70 مل من سلفوكسيد ثنائي الميثيل مع محلول التحويل. سخني الخليط لمدة 15 دقيقة في حمام مائي 42 درجة مئوية.
نقل الخليط إلى أنبوب أسفل جولة 15 مل. إضافة 10 مل من YEPD إلى أنبوب لاحتضان ليلة وضحاها في 30 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة. في صباح اليوم التالي، وجمع الخلايا المحولة عن طريق الطرد المركزي، وpirate جميع ما عدا 200 ميكرولترات النهائي من عظمى.
Resuspend بيليه خلية الخميرة المحولة في الماسخ المتبقية. لوحة 150 ميكرولترات من مزيج التحول، و 150 ميكرولترات من 20 مرة تخفيف المتبقية 50 ميكرولترات من مزيج التحول في YEPD، على YEPD أجار لوحات، تستكمل مع 0.2 غرام لكل لتر من G418. بعد 48 إلى 72 ساعة في 30 درجة مئوية، واختيار محول واحد لإعادة streaking على لوحة جديدة YEPD أجار تكملها 0.2 غرام / لتر من G418.
للتحول الثاني، تنمو الثقافة إلى كثافة بصرية في 600 نانومتر من 1.0، كما هو موضح للتو. وإضافة 20 ميكرولترات من الخلايا إلى أنبوب microcentrifuge. بعد الطرد المركزي، resuspend بيليه الخلية في 100 ميكرولترات من حل LIAc-TE، وإضافة SsDNA.
في أنبوب منفصل، والجمع بين ميكروغرام واحد من مجموعة كررنا واحد، ميكروغرام واحد من بلازميد المتلقي الخطي لمصفوفة كررنا، ميكروغرام واحد من كل الحمض النووي المانح، وم ميكروغرام واحد من كل منطقة الجناح. ثم نقل خليط الحمض النووي إلى أنبوب من خلايا الخميرة المختصة واستكمال التحول الثاني كما هو موضح للتحول الأول. في صباح اليوم التالي، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في aliquot صغيرة من supernatant.
ثم لوحة 150 ميكرولترات من مزيج التحول، و 150 ميكرولترات من 20 مرة تخفيف مزيج التحول في YEPD المتوسطة، على YEPD لوحات أجار تكملها 0.2 غرام / ل G418 ، و 0.2 غرام / ل nourseothricin بعد 48 إلى 72 ساعة ، في 30 درجة مئوية ، واختيار محول واحد الملونة لإعادة streaking على لوحة جديدة YEPD للحصول على المستعمرات الملونة واحدة. لتحديد كفاءة تحرير الجينوم ، عد عدد المستعمرات الملونة والبيضاء على لوحات التحول ، وتقسيم عدد المستعمرات الملونة على العدد الإجمالي للمستعمرات. لإنشاء خميرة بكسل الفن، تلقيح الفردية 500 مل يهز قارورات تحتوي على 100 مل من YEPD المتوسطة مع ثلاثة كاروتينويد الملونة بشكل مختلف إنتاج سلالات S.cerevisiae، والبرية نوع CEN.
PK113-7D سلالة. احتضان الثقافات بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع اهتزاز في 250 دورة في الدقيقة. نقل 0.5 مل من كل ثقافة بين عشية وضحاها إلى أنابيب الفردية التي تحتوي على 0.5 مل من العقيمة، غير الأيونية الانحدار المتوسطة لكل أنبوب، وخلط الحلول لفترة وجيزة من خلال دوامة.
نقل تعليق الخلية إلى خزان فردي مؤهل 2 بنسبة 3 آبار. استخدام ملف csv مع ضبط معايرة السوائل 6RES_AQ_GPSA2 على أداة معالج السائل الصوتية بقعة 25 نانولترس من كل سلالة S.cerevisiae من لوحة مصدر خزان مؤهل المناسبة على 6144 جيدا الوجهة microplate التي تحتوي على 50 مل من YEPD أجار. عندما تم رصد جميع الآبار، احتضان microplate في 30 degressss مئوية لمدة 48 ساعة.
لتكثيف ألوان السلالات، وتخزين لوحات أجار في 4 درجات مئوية لمدة 72 ساعة على الأقل. ظهرت صورة لروزاليند فرانكلين على اللوحة. كما هو موضح، يمكن تجميع المروج، إطار القراءة المفتوحة، المنهي، ومسلسلين متجاورين موصل 50 BP في شريط تعبير عبر تفاعل استنساخ البوابة الذهبية، والتحقق من قبل PCR.
بعد التضخيم من صفيفة crRNA واحد من قبل PCR، يتم الخطية بلازميد المتلقي لصفيف crRNA واحد كما أكده الكهرباء. ويمكن حساب كفاءة تحرير الجينوم المتعدد من خلال النسبة المئوية للمستعمرات الملونة بعد التحول، ومن خلال نتائج تحليلات PCR التي تؤكد تكامل الحمض النووي للمتبرع في مواقع الحمض النووي الجينومي المقصود. على سبيل المثال ، بدءا من صورة بالأبيض والأسود لروزاليند فرانكلين ، تم إنشاء صورة ملونة أربعة وقائمة اكتشاف تم استخدامها بعد ذلك لاكتشاف سلالات الخميرة الأربعة المختلفة على لوحة صغيرة أجار عبر معالج سائل صوتي ، كما هو موضح ، مما أدى إلى لوحة خميرة عالية الدقة للعالم.
لهذا التحول، واستخدام حلول حديثة الإعداد وشظايا الحمض النووي ذات جودة عالية. ويمكن أيضاً تطبيق هذه الطريقة لإدخال الحذفات المحددة والطفرات المحددة في الطفرات في الحمض النووي الجينومي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء تجارب تنظيم CRISPR.
يمكن تعديل هذا الأسلوب لإدخال أكثر من crRNAs الحرة داخل صفيف لزيادة عدد التعديلات المتزامنة التي يمكن إجراؤها.
