المبيضات هو السبب الأكثر شيوعا للعدوى الفطرية نشر في المضيفين المناعة. فشل العوامل العلاجية لاختراق بيو فيلم تماما بسبب المصفوفة هو أحد الأسباب التي تجعل بيو فيلم مقاومة للعلاجات التقليدية. بروتوكولنا يقيم كيف العلاج بالضوء، وذلك باستخدام الضوء الأحمر، ويتداخل مع نمو وترتيب الأغشية الحيوية المبيضات ألبيكانس.
الأساليب المطبقة راسخة ، لأن السلالة المستخدمة في هذه الدراسة كانت مصفوفة خارج الخلية تتميز والجهاز الخفيف تم تطبيقه بنجاح على غيرها من المعلقات الكائنات الحية الدقيقة planktonic والأغشية الحيوية. أكبر ميزة لهذا الجهاز هو الحد من وقت العلاج، مما يجعله أكثر وضوحا للتطبيقات السريرية. عندما زراعة المبيضات albicans تكون على علم بأن الأجسام المضادة يمكن الحصول عليها.
لذلك ، من المهم عدم استخدام المستعمرات التي يزيد عمرها عن سبعة أيام ، وعدم بدء تشغيل اللوحات عند أربع درجات مئوية ، وعدم إعادة الخلايا المتتالية من اللوحات الموجودة. وبالمثل، ينبغي استخدام سلالة قبل 18 ساعة من النمو بين عشية وضحاها. عند استخدام مقياس الطيفي لأول مرة من المهم الحصول أولاً على مزرعة مستعمرة في عدد الوحدات ، للربط مع قيم الكثافة البصرية.
لذلك، سوف تبدأ التجارب باستخدام منتصف مرحلة النمو في تركيز الخلايا الأولية من 10 إلى 7 خلايا لكل ملليلتر. وقد تبين أن تركيز الخلية هذا يوفر الأغشية الحيوية الأكثر اعتماداً واستقراراً. لتبدأ, تعليق 65 غراما من SDA, تستكمل مع 50 ملليغرام لكل لتر من الكلوراففينيكول, في 1,000 ملليلتر من الماء المقطر في منقار.
وضع القارص على سخان ليغلي، من أجل حل المتوسطة تماما. ثم نقل وسائل الإعلام إلى زجاجة. وضع الغطاء على الزجاجة، ولكن لا المسمار عليه تماما لضمان زجاجة قادرة على تنفيس.
ضع الزجاجة في الأوتوكلاف لتعقيم المحلل عند 15 PSI و 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تبريد الحل إلى حوالي 45 درجة مئوية. استخدام ماصة يمكن التخلص منها، العقيمة، لخلط جيدا، والماصات 20 ملليلتر من SDA في لوحات بيتري العقيمة.
لإعداد ينب المتوسطة، وتستكمل مع الجلوكوز 100 ملليمولار، مزيج 6.7 غرام من YNB و 18 غراما من دكستروز إلى 1،000 ملليلتر من الماء النقي جدا في كوب. ضعي بارًا مُحرّكًا في القارق وضعي القارب على لوحة حركية لخلطه. تصفية المتوسطة من خلال نظام تصفية فراغ 0.22 ميكرومتر لتعقيم.
إعداد دورة في الدقيقة المتوسطة عن طريق خلط 10.4 غرام من RPMI-1640 و 34 غراما من MOPS، إلى 1،000 ملليلتر من المياه النقية جدا. مزيج في مُحرك بدون حرارة وضبط PH إلى سبعة بإضافة هيدروكسيد الصوديوم العادي واحد. تعقيم المتوسطة باستخدام نظام تصفية فراغ 0.22 ميكرومتر.
أولا، إذابة الكائنات الحية الدقيقة المبيضات ألبيكانس SN 425 في درجة الحرارة المحيطة. بذور 10 microliters من ثقافة وقف على أطباق بيتري أعدت سابقا تحتوي على SDA، وتستكمل مع الكلورافينيكول. احتضان أطباق بيتري الهوائية في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
لpre-inoculum استخدام تزليق معقمة لاختيار 10 مستعمرات المبيضات ألبيكان من أطباق بيتري ووضعها في أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على 10 ملليلتر من المتوسط YNB، تستكمل مع الجلوكوز. احتضان أنبوب الهوائية في 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. ثم، وإعداد inoculums عن طريق إضافة هذه الثقافة بداية في المتوسطة ينب الطازجة، وتستكمل مع الجلوكوز، في نسبة 1-10 لتخفيف.
استخدم مقياس الطيف لقياس الأوزون الأولي عند 540 نانومتر. احتضان inoculums الهوائية في 37 درجة مئوية لمدة ثماني ساعات، وقياس OD النهائي في 540 نانومتر. طرح OD النهائي من OD الأولي للتحقق مما إذا كان OD من inoculums هي على مرحلة النمو منتصف السجل.
للحصول على inoculum مع 10 إلى الخلايا السبع لكل ملليلتر، والطرد المركزي inoculum لمدة خمس دقائق في 5،500 مرة G.Pour الماحتوم في كوب يحتوي على هيبوكلوريت الصوديوم وإضافة ينب الطازجة لتركيز inoculum إلى نصف الحجم السابق. إضافة ملليلتر واحد من inoculum إلى كل بئر من 24 لوحة البوليسترين جيدا. احتضان الهوائية في 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة للسماح التصاق الخلية إلى أسفل الآبار.
علاج الأغشية الحيوية لمدة دقيقة واحدة مع ملليلتر واحد من 0.12٪ الكلورهيكسيدين ل biofilms التحكم الإيجابي. للسيطرة السلبية، وعلاج الأغشية الحيوية لمدة دقيقة واحدة مع ملليلتر واحد من العقيمة، 0.89٪ كلوريد الصوديوم. في وقت لاحق، وغسل الآبار مرتين، دقيقة واحدة لكل منهما، مع ملليلتر واحد من كلوريد الصوديوم العقيم 0.89٪ لإزالة الخلايا غير المنضمة.
ثم قم بتشغيل ضوء أحمر غير متماسك واستخدم عداد طاقة لقياس كثافة الطاقة للضوء. تحديد وقت التعرض على أساس متطلبات كثافة الطاقة من 87.6 جول لكل سنتيمتر مربع. ضع الصحن تحت الضوء الأحمر.
الحفاظ على المسافة بين مصدر الضوء وbiofilm إلى خمسة ملليلتر لتجنب ارتفاع درجة حرارة العينة. بعد التعرض لمدة دقيقة واحدة، إضافة ملليلتر واحد من عقم RPMI المتوسطة لكل بئر، واحتضان لوحات في 37 درجة مئوية خلال الليل. في الصباح، كرر نفس الغسيل، والعلاج الخفيف، وعلاجات التحكم الإيجابية والسلبية، والحضانة لمدة ست ساعات مع متوسطة RPMI.
مرة أخرى، وغسل الأغشية الحيوية مرتين، ويعرض لهم الضوء الأحمر، وتنفيذ علاجات التحكم الإيجابية والسلبية. استلهم الحل في الآبار وأضف متوسط RPMI. كرر الحضانة والغسيل والعلاج الخفيف وعلاجات التحكم الإيجابية والسلبية ، حتى تحقيق 48 ساعة من تطوير البيوفيلم.
لبدء المعالجة، والتخلص من المتوسطة وإضافة ملليلتر واحد من العقيمة، 0.89٪ كلوريد الصوديوم إلى البئر، واستخدام تلميح ماصة لخدش بيو فيلم من البئر. نقل بيو فيلم إزالة إلى أنبوب معقمة. إضافة ملليلتر واحد آخر من العقيمة، 0.89٪ كلوريد الصوديوم إلى البئر.
خدش مرة أخرى وإضافة تعليق إلى نفس الأنبوب، لحجم إجمالي 2 ملليلتر. دوامة بقوة تعليق بيو فيلم لمدة دقيقة واحدة. بالنسبة لتحليل CFU، نقل aliquot من 0.1 ملليلتر من تعليق الغشاء الحيوي إلى أنبوب جهاز طرد مركزي صغير يحتوي على 900 ميكرولترات من محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.89٪لكل تخفيف.
تمييع محلول بيو فيلم من 10 إلى واحد سلبي، إلى 10 إلى الأربعة السلبية، في محلول ملحي. بذور 50 ميكرولترات من كل تخفيف للوحات SDA، واحتضان لوحات في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. عد المستعمرات وتطبيق الصيغة.
لتحليل الوزن الجاف، الوزن أولاً وتسمية أنابيب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة. إضافة 0.1 ملليلتر من تعليق بيو فيلم ومليلتر واحد من الإيثانول المطلق في الأنابيب، وتخزينها في درجة مئوية سلبية 20 لمدة 18 ساعة. ثم، الطرد المركزي 10، 000 مرات G لمدة 10 دقائق.
تخلص من المنافق ووضع الأنابيب في مجفف لتجفيف العينات لمدة أسبوع واحد. وزن أنابيب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة مرة أخرى، والقيام الطرح للحصول على وزن الكتلة الحيوية. في هذه التجربة، بعد العلاجات لكل يوم يومي مع الضوء الأحمر لمدة دقيقة واحدة إلى الأغشية الحيوية المبيضات ألبيكانس، تم تخفيض CFU، بالمقارنة مع السيطرة السلبية المعالجة مع كلوريد الصوديوم.
نتائج الكتلة الحيوية من المبيضات البيكانز الأغشية الحيوية بعد العلاجات اليومية، وتظهر مجموعة معالجة الضوء الأحمر قدمت انخفاض مماثل من الكتلة الحيوية لتلك التي لوحظت في مجموعة التحكم الإيجابية، تعامل مع الكلورهيكسيدين. كما أظهرت المجموعتان تشابها إحصائيا مع بعضهما البعض. في حين أنها أظهرت كل من انخفاض الكتلة الحيوية، مقارنة مع التحكم السلبي تعامل مع كلوريد الصوديوم.
ولوحظت كميات أدنى من المبيضات ألبيكانس قابل للذوبان وغير قابلة للذوبان EPS, في السيطرة الإيجابية, مقارنة مع السيطرة السلبية. على الرغم من أن لا ذات دلالة إحصائية، فإن كل تطبيق يومي للضوء الأحمر قلص عددياً كميات EPS القابلة للذوبان وEPS غير قابلة للذوبان. أظهرت السيطرة السلبية ومجموعة الضوء الأحمر المعالجة تشابهًا إحصائيًا.
قياس كثافة الطاقة للضوء، باستخدام عداد الطاقة قبل بدء المعالجة لتحديد الفترات الدقيقة للتطبيق. وتؤكد الخطوات أن كثافة الطاقة ستكون دائما 87.6 جول لكل سنتيمتر مربع. استخدم الصيغة المذكورة سابقاً.
يتم القياس باستخدام نفس من الضوء إلى زجاجة من لوحات، خمسة ملليمترات. ويمكن دراسة العلاقة بين العلاج بالضوء والأدوية المضادة للفطريات للتحقق مما إذا كان العلاج المسبق مع الضوء الأحمر ، يليه تطبيق الدواء ، يحسن من اختراق المخدرات في البيوفيلم. للعلاج مرتين يوميا قمنا بتكييف بروتوكولات مختبرنا، وتوفير نموذج بيو فيلم سهل، ويمكن استنساخه، الذي يقدم إجابات بشأن الجدوى، والوزن الجاف، وكميات السكريات خارج الخلايا بعد العلاج بالضوء الأحمر.
البروتوكول هو عام ويمكن استخدامه لاختبار العلاجات الأخرى، بالإضافة إلى الضوء الأحمر، بما في ذلك الأدوية، وغيرها من الأضواء، أو مزيج من الضوء والأدوية. يتطلب العمل مع الكائنات الحية الدقيقة معدات خاصة، مثل نظارات السلامة، ومعطف مختبر الأزرار، وقفازات نيترو.
