La cándida es la causa más frecuente de infección por hongos diseminada en huéspedes inmunocomprometidos. El fracaso de los agentes terapéuticos para infiltrarse completamente en la biopelícula debido a la matriz es una de las razones por las que las biopelículas resisten a las terapias tradicionales. Nuestro protocolo evalúa cómo la fototerapia, utilizando luz roja, interfiere con el crecimiento y la disposición de las biopelículas Candida albicans.
Los métodos aplicados están bien establecidos, ya que la cepa utilizada en este estudio tenía su matriz extracelular caracterizada y el dispositivo de luz se ha aplicado con éxito a otras suspensiones de microorganismos planctónicos y biopelículas. La mayor ventaja de este dispositivo es la reducción del tiempo de tratamiento, lo que lo hace más visible para aplicaciones clínicas. Al cultivar Candida albicans tenga en cuenta que se pueden adquirir anticuerpos.
Por lo tanto, es importante no utilizar colonias que tienen más de siete días de edad, no iniciar placas a cuatro grados celsius, y no volver a rayar las células de las placas existentes. Del mismo modo, se debe utilizar una cepa antes de 18 horas de crecimiento durante la noche. Cuando se utiliza un espectrofotómetro por primera vez es importante obtener primero la granja de colonias en recuentos de unidades, para correlacionar con los valores de densidad óptica.
Por lo tanto, los experimentos comenzarán a utilizar la fase media de crecimiento en la concentración celular inicial de 10 a siete células por mililitros. Se ha demostrado que esta concentración celular proporciona las biopelículas de materia más dependientes y estables. Para empezar, suspender 65 gramos de ASD, complementado con 50 miligramos por litro de cloramphenicol, en 1.000 mililitros de agua destilada en un vaso de precipitados.
Coloque el vaso de precipitados en un calentador para hervir, con el fin de disolver el medio por completo. A continuación, transfiera el medio a una botella de vidrio. Coloque la tapa en la botella, pero no la atornille completamente para asegurarse de que la botella pueda ventilar.
Coloque el frasco en un autoclave para esterilizar la solución a 15 PSI y 121 grados Celsius durante 30 minutos. Enfríe la solución a unos 45 grados centígrados. Utilice una pipeta desechable y estéril, para mezclar bien, y pipetee 20 mililitros de ASD en placas petri estériles.
Para preparar el medio YNB, complementado con 100 milivolares de glucosa, mezclar 6,7 gramos de YNB y 18 gramos de dextrosa a 1.000 mililitros de agua ultra pura en un vaso de precipitados. Coloque una barra de agitación en el vaso de precipitados y coloque el vaso de precipitados en un plato de agitación para mezclar. Filtrar el medio a través de un sistema de filtro de vacío de 0,22 micrómetros para esterilizar.
Preparar el medio RPMI mezclando 10,4 gramos de RPMI-1640 y 34 gramos de MOPS, a 1.000 mililitros de agua ultra pura. Mezclar en un agitador sin calor y ajustar el PH a siete añadiendo un hidróxido de sodio normal. Esterilice el medio con un sistema de filtro de vacío de 0,22 micrómetros.
En primer lugar, descongelar el microorganismo Candida albicans SN 425 a temperatura ambiente. Semilla 10 microlitros del cultivo de parada en platos Petri previamente preparados que contienen ASD, complementados con cloramphenicol. Incubar los platos Petri aeróbicamente a 37 grados centígrados durante 48 horas.
Para el pre-inóculo utilizar un lubricante esterilizado para recoger 10 colonias de Candida albicans de los platos petri y colocarlos en un tubo centrífugo que contiene 10 mililitros de medio YNB, complementado con glucosa. Incubar el tubo aeróbicamente a 37 grados centígrados durante 16 horas. A continuación, preparar los inóculos mediante la adición de este cultivo de arranque en medio YNB fresco, complementado con glucosa, en una proporción de uno a 10 para la dilución.
Utilice el espectrofotómetro para medir el OD inicial a 540 nanómetros. Incubar los inóculos aeróbicamente a 37 grados centígrados durante ocho horas, y medir la OD final a 540 nanómetros. Restar el OD final del OD inicial para comprobar si el OD de los inóculos está en la fase de crecimiento del registro medio.
Para obtener un inóculo con 10 a las siete células por mililitro, centrifugar el inóculo durante cinco minutos a 5.500 veces G.Vierta el sobrenadante en un vaso de precipitados que contenga hipoclorito de sodio y agregue YNB fresco para concentrar el inóculo a la mitad del volumen anterior. Añadir un mililitro del inóculo a cada pocódulo de una placa de poliestireno de 24 pocillos. Incubar aeróbicamente a 37 grados centígrados durante 90 minutos para permitir la adhesión celular al fondo de los pozos.
Tratar las biopelículas durante un minuto con un mililitro de 0,12% de clorhexidina para las biopelículas de control positivo. Para el control negativo, tratar las biopelículas durante un minuto con un mililitro de cloruro estéril, 0,89%sódico. Posteriormente, lavar los pozos dos veces, un minuto cada uno, con un mililitro de cloruro de sodio estéril 0,89% para eliminar las células no adherentes.
A continuación, encienda una luz roja no coherente y utilice un medidor de potencia para medir la densidad de potencia de la luz. Determinar el tiempo de exposición basado en el requisito de densidad de energía de 87,6 julios por centímetro cuadrado. Coloque la placa debajo de la luz roja.
Mantenga la distancia entre la fuente de luz y el biofilm a cinco mililitros para evitar calentar la muestra. Después de la exposición durante un minuto, agregue un mililitro del medio RPMI esterilizado a cada pozo, e incubar las placas a 37 grados centígrados durante la noche. Por la mañana, repita el mismo lavado, tratamiento ligero, tratamientos de control positivos y negativos, e incubación durante seis horas con medio RPMI.
Una vez más, lave las biopelículas dos veces, exponga a la luz roja y realice tratamientos de control positivos y negativos. Aspirar la solución en los pozos y añadir el medio RPMI. Repita la incubación, lavado, tratamiento ligero y tratamientos de control positivos y negativos, hasta lograr 48 horas de desarrollo de biopelículas.
Para comenzar a procesar, deseche el medio y agregue un mililitro de cloruro de sodio estéril, 0,89% al pozo, y utilice una punta de pipeta para rascar la biopelícula del pozo. Transfiera el biofilm eliminado a un tubo estéril. Añadir otro mililitro de cloruro estéril, 0,89% de sodio al pozo.
Rascalo de nuevo y añade la suspensión al mismo tubo, para un volumen total de 2 mililitros. Vórtice vigorosamente la suspensión del biofilm durante un minuto. Para el análisis de la CFU, transfiera una alícuota de 0,1 mililitros de la suspensión del biofilm a un tubo de micro centrífuga que contenga 900 microlitros de 0,89% de solución de cloruro de sodio para cada dilución.
Diluir la solución de biopelícula de 10 a la negativa, a 10 a la cuatro negativa, en solución salina. Siembra 50 microlitros de cada dilución a placas ASD, e incuba las placas a 37 grados Celsius durante 48 horas. Cuente las colonias y aplique la fórmula.
Para el análisis de peso seco, primero pese y etiquete los tubos de micro centrífuga. Añadir 0,1 mililitros de la suspensión del biofilm y un mililitro de etanol absoluto en los tubos, y almacenarlos a 20 grados Celsius negativos durante 18 horas. Luego, centrífla 10.000 veces G durante 10 minutos.
Deseche el sobrenadante y coloque los tubos en un desecador para secar las muestras durante una semana. Pesar los tubos de micro centrífuga de nuevo, y hacer la resta para obtener el peso de biomasa. En este experimento, después de tratamientos de viáticos con luz roja durante un minuto a las biopelículas de Candida albicans, la UFC se redujo, en comparación con el control negativo tratado con cloruro de sodio.
Los resultados de la biomasa de las biopelículas de Candida albicans después de los tratamientos diarios, muestran que el grupo tratado con luz roja presentó una reducción similar de la biomasa a la observada en el grupo de control positivo, tratada con clorhexidina. Los dos grupos también mostraron similitud estadística entre sí. Mientras que ambos mostraron una reducción de la biomasa, en comparación con el control negativo tratado con cloruro de sodio.
Se observaron cantidades inferiores de EpS solubles e insolubles de Candida albicans, en control positivo, en comparación con el control negativo. Aunque no es estadísticamente significativa, la aplicación por viáticos de la luz roja disminuyó numéricamente las cantidades de EPS soluble e EPS insoluble. El control negativo y el grupo tratado con luz roja mostraron similitud estadística.
Medición de la densidad de potencia de la luz, utilizando un medidor de potencia antes de iniciar el tratamiento para determinar los períodos exactos de aplicación. Los pasos aseguran que la densidad de energía siempre será de 87,6 julios por centímetros cuadrados. Utilice la fórmula anteriormente citada.
La medida se realiza utilizando la misma de la luz a la botella de las placas, cinco milímetros. Se puede estudiar una asociación entre la fototerapia y los medicamentos antifúngicos para comprobar si el pretratamiento con luz roja, seguido de la aplicación del fármaco, mejora la penetración del fármaco en el biofilm. Para el tratamiento dos veces al día adaptamos los protocolos de nuestro laboratorio, proporcionando un modelo de biofilm fácil y reproducible, que ofrece respuestas sobre viabilidad, peso seco y cantidades de polisacáridos extracelulares después del tratamiento de luz roja.
El protocolo es genérico y se puede utilizar para probar otras terapias, además de la luz roja, incluyendo medicamentos, otras luces, o la combinación de luz y medicamentos. Trabajar con microorganismos requiere equipo especial, como gafas de seguridad, capa de laboratorio de botones y guantes de nitro.
