The authors would like to acknowledge the University of Lille and the Pasteur Institute of Lille, especially Thierry Chassat and Jean-Pierre Decavel, responsible for animal housing breeding safety and husbandry. This work was supported by the "Soci&#233;t&#233; de Pathologies Infectieuses de Langue Fran&#231;aise" (SPILF).

<ol>
	<li>Casadevall, A., Pirofski, L. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+damage-response+framework+of+microbial+pathogenesis.">The damage-response framework of microbial pathogenesis.</a> Nat. Rev. Micro. 1 (1), 17-24 (2003).</li><li>Eddens, T., Kolls, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+defenses+against+bacterial+lower+respiratory+tract+infection.">Host defenses against bacterial lower respiratory tract infection.</a> Curr. Opi. Immunol. , (2012).</li><li>Beck, J. M., Young, V. B., Huffnagle, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiome+of+the+lung.">The microbiome of the lung.</a> Translational research : J. Lab. Clin Med. 160 (4), 258-266 (2012).</li><li>Hogan, D. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas-Candida+interactions:+an+ecological+role+for+virulence+factors.">Pseudomonas-Candida interactions: an ecological role for virulence factors.</a> Science. 296 (5576), 2229-2232 (2002).</li><li>Nseir, S., Ader, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+and+Candida+albicans:+do+they+really+need+to+stick+together.">Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans: do they really need to stick together.</a> Crit. Care Med. 37 (3), 1164-1166 (2009).</li><li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+competition:+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle.">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nat. Rev. Micro. 8 (1), 15-25 (2010).</li><li>Gibbons, D. L., Spencer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+and+human+intestinal+immunity:+same+ballpark,+different+players;+different+rules,+same+score.">Mouse and human intestinal immunity: same ballpark, different players; different rules, same score.</a> Mucosal Immunol. 4 (2), 148-157 (2011).</li><li>Ariffin, J. K., Sweet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+repertoire,+regulation+and+function+of+Toll-like+Receptors+and+inflammasome-forming+Nod-like+Receptors+between+human+and+mouse.">Differences in the repertoire, regulation and function of Toll-like Receptors and inflammasome-forming Nod-like Receptors between human and mouse.</a> Curr. Opi. Micro.. , (2013).</li><li>Slutsky, A. S., Ranieri, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventilator-Induced+Lung+Injury.">Ventilator-Induced Lung Injury.</a> NEJM. 369 (22), 2126-2136 (2013).</li><li>Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medically+important+bacterial-fungal+interactions.">Medically important bacterial-fungal interactions.</a> Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).</li><li>Roux, D., Gaudry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+impairs+macrophage+function+and+facilitates+Pseudomonas+aeruginosa+pneumonia+in+rat.">Candida albicans impairs macrophage function and facilitates Pseudomonas aeruginosa pneumonia in rat.</a> Crit. Care Med. 37 (3), 1062-1067 (2009).</li><li>Mear, J. B., Gosset, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+Airway+Exposure+Primes+the+Lung+Innate+Immune+Response+against+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+through+Innate+Lymphoid+Cell+Recruitment+and+Interleukin-22-Associated+Mucosal+Response.">Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response.</a> Infect. Immun. 82 (1), 306-315 (2013).</li><li>Ader, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+term+Candida+albicans+colonization+reduces+Pseudomonas+aeruginosa+load+and+lung+injury+in+a+mouse+model.">Short term Candida albicans colonization reduces Pseudomonas aeruginosa load and lung injury in a mouse model.</a> Crit. care. , 1-33 (2009).</li><li>Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-drop+anesthesia+for+small+laboratory+animals.">Open-drop anesthesia for small laboratory animals.</a> Can Vet J. 53 (3), 299-302 (2012).</li><li>Stover, C. K., Pham, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1,+an+opportunistic+pathogen.">Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen.</a> Nature. 406 (6799), 959-964 (2000).</li><li>Boutoille, D., Marechal, X., Pichenot, M., Chemani, C., Guery, B. P., Faure, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FITC-albumin+as+a+marker+for+assessment+of+endothelial+permeability+in+mice:+comparison+with+125I-albumin.">FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin.</a> Exp. Lung Res. 35 (4), 263-271 (2009).</li><li>Faure, E., Mear, J. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+type-3+secretion+system+dampens+host+defense+by+exploiting+the+NLRC4-coupled+inflammasome.">Pseudomonas aeruginosa type-3 secretion system dampens host defense by exploiting the NLRC4-coupled inflammasome.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (7), 799-811 (2014).</li><li>Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medically+important+bacterial-fungal+interactions.">Medically important bacterial-fungal interactions.</a> Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

النماذج الحيوانية، وخاصة الثدييات، هي مفيدة لتوضيح الآليات المعقدة للتفاعل المضيف الممرض في مجالات الحصانة. بطبيعة الحال، فإن الحاجة إلى المعلومات التي يمكن الحصول عليها فقط من النماذج الحيوانية يجب أن تكون ضرورية. خلاف ذلك، لا بد من استبدال استخدام الحيوانات عن طريق نماذج في المختبر. يوضح هذا النموذج الحيواني البصيرة التي لا يمكن إلا أن تقدمها نموذج حيواني لأن بوساطة التفاعل بين مسببات الأمراض عن طريق استجابة المضيف متعددة العناصر. الفئران المستخدمة حاليا لدراسة هذا التفاعل المضيف الممرض هم من البالغين الشباب الذين تتراوح أعمارهم بين 6-10 أسابيع مع استجابة مناعية ناضجة ودون تغيير. عندما تركز على الاستجابة المناعية الفطرية، ويفضل C57Bl6 / J الفئران الخلفية. لتجنب تأثير الجنس ودورة الهرمونية (خاصة هرمون الاستروجين) على الاستجابة المناعية، وبالتالي الذكور هي الخيار الأفضل. لتحقيق دلالة إحصائية، يجب أن يكون مجموعة 5 أشخاص على الأقل في نهاية التجربة، ولكن كما اقترح من قبل جميع التجربه الحيوانالمبادئ التوجيهية الكساء، ينبغي خفض عدد الحيوانات المستخدمة وصقلها إلى أدنى حد ممكن. النقل من مربي الحيوانات لتوفير مرفق البحوث يدفع التوتر في الفئران. والنتيجة هي زيادة إفراز السيتوكينات الالتهابية التي يمكن أن تغير التجارب اللاحقة مثل بلدنا. وعلاوة على ذلك، بيئة جديدة والجديد &quot;زملائه في قفص&quot; تساهم في التوتر. ونتيجة لذلك، لا بد من تأقلم الفئران لمدة سبعة أيام على الأقل قبل دراسة في البيئة السكنية الجديدة. تحتوي هذه البيئة السكنية التي تخضع للرقابة، وتوفير الغذاء القياسية والمياه الإعلانية ليب، دورة اليوم / ليلة، والرطوبة المناسبة مستقرة ودرجة الحرارة. كلا استعمار الرئة ونماذج التهاب في الرئتين تتطلب الممارسة والمهارة. تقطير يمكن أن يؤديها داخل أنفيا أو داخل tracheally. هذا الأخير هو أكثر صعوبة ويتطلب المزيد من الخبرة من خلال التدريب بسبب ارتفاع مخاطر السكتة القلبية عوز الأكسجين. في الواقع، والعلاقات العامةيتطلب ocedure لتدخله بنجاح الماوس في أقل من 15 ثانية والتخدير أعمق بالتالي المطلوبة. خيارنا من تقطير داخل الأنف هو أسهل لأداء منذ طريقة التعاطي يمكن الوصول إليه، أقل خطورة تتطلب التخدير أخف وزنا وبالتالي أكثر استنساخه. Boutoille آخرون سبق وصفها لدينا الحاد نموذج إصابة الرئة، وخاصة تقييم إصابة الرئة من خلال قياس-السنخية الشعرية نفاذية حاجز باستخدام الألبومين FITC المسمى 16. للحد من عدد من الفئران في التجربة، وقد تم تكييف هذه الطريقة ويقترن غسل القصبات (BAL). في دراسات Boutoille وآخرون، استخدمنا المقارنة بين مضان الألبومين FITC المسمى في supernatants جناسة الرئة والدم supernatants 17. القيام على الوجه الأكمل هذه المقارنة، ويلزم أيضا مستويات الهيموجلوبين والهيماتوكريت المستويات. وقد تم تكييف هذا الأسلوب لألوث تحليل يصاحب ذلك من استجابة المضيف عن طريق تخصيص رئة واحدة إلى التجانس وتقييم إصابة الرئة والآخر لغسل ودراسة استجابة المضيف. في الواقع، السائل BAL يمكن استخدامها لتقييم مستويات خلوى، إفراز البروتين وتجنيد خلية. يوفر التكيف لدينا المزيد من النتائج من تجربة حيوان واحد، وتقليل التكلفة والعدد المطلوب من الفئران، وخاصة عند استخدام خروج المغلوب الفئران 17 على النحو الموصى به في المبادئ التوجيهية التجارب على الحيوانات. وعلاوة على ذلك، يتم الاحتفاظ جزء من الرئة في -80 ° C لأداء الكلي استخراج الحمض النووي الريبي والكمي تفاعل البلمرة المتسلسل أو تحليل نسيجية. مقارنة بين الطريقة السابقة وطريقة تكيف جديد إلى جانب BAL تظهر نتائج مماثلة (الشكل 3A) لتقييم مؤشر إصابة الرئة. في دراسة مير وآخرون، وذلك باستخدام نفس الإجراءات، وتدفق الكريات تحليل أجريت على الخلايا BAL تم الحصول عليها عن طريق الطرد المركزي من السوائل BAL. مماثلةأجريت nalyses على مجموع الخلايا الرئوية من الرئتين 12. في هذه الحالة، وتقييم إصابة الرئة مع الألبومين FITC المسمى لا يمكن أن يؤديها بصورة متزامنة، بسبب القطع الأثرية التي تحدثها FITC (نفس القناة من البروتين مخضر). لذلك، إذا كنت بحاجة التدفق الخلوي، يجب التخطيط التجارب وفقا لذلك. توقيت القتل الرحيم أمر بالغ الأهمية. ويرد مدار الساعة من نموذج عدوى الرئة الحاد على مدى ساعة 72 الأولى الشكل (3). وفي هذا النموذج، وذروة من إصابة الرئة واستجابة المضيف تحدث ما بين 24 و 36 ساعة (الشكل 3). وهكذا، في لدينا تصميم تم اختيار 24 ساعة نقطة النهاية كما قراءات لمدة 3 أسباب: أولا، فمن السهل أن تنظم في المختبر، والثانية، لتجنب فقدان الفئران بسبب الوفاة بين 24 و 36 ساعة، وأخيرا، لكان رد المضيف القصوى في هذه المرحلة الزمنية. الخطوة الأولى لدراسة التفاعل لدينا هو استعمار مجرى الهواء مع &lt;م&gt; C. البيض. باستخدام تقطير من 10 5 كفو في الماوس، يتم الحصول على نموذج استمرار 4 أيام دون أي إصابة الرئة. في الواقع، اكتسبت وزن الفئران على مدار الساعة لهذه المرحلة. زيادة الوزن هي مؤشر مفيد لعدم وجود إصابات في خط مع الاستعمار بدلا من العدوى. في الواقع، وزيادة الحمل الأولي (أكثر من 10 6 كفو في الماوس) إصابة الرئة الناجم عن (الشكل 2C) واستجابة المضيف الضارة إلى ما هو أبعد فتيلة، والتي فقدت الفئران حالة الوزن (الشكل 2D). على العكس من ذلك، وذلك باستخدام الحمل الأولي أصغر (على سبيل المثال 10 4 CFU في الماوس) لا يمكن الحصول على نموذج استمرار مجرى الهواء. وهكذا، للحصول على فتيلة الملحوظ الحصانة المضيفة التي وصفها مير وآخرون 12 والمعايرة من عبء الفطرية تغرس أمر بالغ الأهمية لنجاح ورصد منحنى الوزن هو مفتاح السيطرة. مطلوب بنفس الدقة لP. الزنجارية </em&gt; للحث على وجود عدوى حادة. واللقاح كافية لا يسبب إصابة الرئة وP. تم مسح الزنجارية بسرعة من الشعب الهوائية من قبل المضيف الاستجابة المناسبة. باستخدام الأولي P. عالية أكثر من اللازم الزنجارية يفوق قدرات دفاع المضيف أو حتى يدفع استجابة غير مناسبة وderleterious مما أدى إلى تحميل يؤدي إلى الإصابة الحادة ضخمة والموت محو كل الخلافات بين المجموعات. قيحة الأمثل للحث على إصابة حادة يعتمد على وجود نوع 3 نظام وظيفي إفراز (T3SS) وإنتاج ذيفان خارجي U، السم translocated من قبل T3SS في سيتوبلازم الخلية المضيفة. هذه الصفات سلالة محددة لهما أن ينظر في اختيار من عبء البكتيرية الأولي. واقترح أعباء البكتيرية الأولية في هذه المقالة كأمثلة على الحدود الدنيا والعليا للحث على إصابة الرئة الحادة مع T3SS سلبية أو سلالة إيجابي، والسلالات المنتجة للذيفان خارجي U أم لا (الجدول 1). عند دراسةمشاركة T3SS، سلالة لابد نمت O / N وأحيت مع متوسط ​​LB الجديد 3 ساعات قبل إعداد اللقاح للحصول على النشاط الأمثل للT3SS. تحديد عبء البكتيريا والفطريات 24 ساعة بعد P. يتطلب التهاب في الرئتين الزنجارية يسببها اعتبارات محددة مناقشتها في هذا القسم. في الواقع، كما هو مبين، عندما تصاب الفئران مع 5 × 10 6 سلالة كفو T3SS إيجابية، وعبء بكتيرية في الرئة في 24 ساعة إرادة انخفضت إلى حوالي 1 سجل (الشكل 3C). يجب إجراء التخفيفات المسلسل من عينات حتى سجل 5 تخفيف ومطلي على لوحات BCP آجار. وفيما يتعلق C. البيض في الرئتين، في 72 ساعة، وانخفض العبء الفطرية إلى حوالي 2 سجل ويجب عينات لمطلي على YPD أجار تستكمل مع الأميكاسين لتسهيل التعرف مستعمرة. وأخيرا، تقرير نشر البكتيري يمكن تقييمها من قبل الطلاء 100 ميكرولتر من عينة الدم على BCP أجار أو الطلاء 100 ميكرولتر من الطحال حomogenates في نفس المتوسطة. وقد تم بالفعل مقارنة الطريقتين ويبدو ثقافة الطحال أن تكون أكثر دقة. في الواقع، والطحال هو العضو الذي &quot;الفلاتر&quot; الدم كله وربما &quot;التركيز&quot; والحفاظ على البكتيريا بعد أن نشر على الدم. وهكذا، الخليط الطحال تعكس نشر البكتيري النظامية خلال عدوى في الرئة الحاد مع حساسية أعلى من الدم. عينات الدم تمثل نشر البكتيري في وقت معين محدد جدا وربما لا تعكس حقا ظاهرة نشر البكتيرية ككل. لذلك يفضل الثقافات جناسة الطحال. مؤشر إصابة الرئة هو تقييم حساسية إصابة الرئة الناجمة عن العدوى و / أو غير لائقة استجابة المضيف وتأثير العلاجات المحتملة على هذه المكونات. بالإضافة إلى ذلك، هذا في فيف س النموذج يسمح جمع عدة عينات مختلفة لدراسة استجابة المضيف. الرئة يمكن استخدامها لاستخراج الحمض النووي الريبي وتحليلمن النسخ الجيني. يمكن أيضا أن توضع عينات الرئة إلى امتصاص العرق (PFA) لمزيد من الملاحظات النسيجية. السائل BAL يمكن استخدامها لتقييم إفراز البروتين مثل السيتوكينات الالتهابية. وأخيرا، كما نوقش أعلاه البروتوكول يمكن تكييفها لتقديم عينات للتحليل التدفق الخلوي. أخيرا، هذا البروتوكول يمكن تكييفها لmodelize C. الميكروبات albicans- تفاعل المشاركين في الالتهاب الرئوي المرتبط التنفس الصناعي مثل المكورات العنقودية الذهبية 18 أو Enterobacteriae. التكيف أخرى يمكن أن تكون الاستعمار مجرى الهواء باستخدام البكتيريا بدلا من C. البيض لmodelize التفاعل البكتيري في أمراض الرئة القيحي المزمن مثل توسع القصبات. وتحقيقا لهذه الغاية، على أن تستخدم الفئران المناعة، لإزالة بكتيريا في الفئران المختصة المناعي لا يسمح الاستعمار الهوائية الثابتة. للتقطير، والموقف من ناحية عقد هذا الحيوان هو CRItical. كما أكدت بالفعل في القسم السابق، عندما غرس داخل أنفيا الماوس، يجب على المشغل ضمان أنه يتم إغلاق الفم تماما لتجنب نخامة من الحل. الإبهام يدعم الفك ويحافظ على الفم مغلقا أثناء إجراء تقطير بأكمله (الشكل 4B). ثم، مع جهة أخرى، وتودع ماصة على الأنف (الشكل 4C) والحل تدريجيا وبلطف تغرس دون الهواء لمنع تشكيل فقاعة. من الواضح، يجب إجراء تقطير في مستوى وزاري 2 في مجال السلامة الأحيائية. جمع العينات يتطلب الحيوانات الصغيرة التدريب الجراحي certifed من المشغل. في كل خطوة، يجب أن توضع العينات في الثلج لتجنب تحلل الخلايا والحفاظ على البروتينات من تمسخ. يرجى ملء الأدوات الجراحية الأساسية (الشكل 4A). يجب عليهم أن تعقيمها بواسطة التعقيم قبل الاستخدام. فمن المستحسن أن مختلف مجموعات أداة جراحية استخدامها لabdominaلتر والخطوات الجراحية الصدرية، وتجنب التلوث المتبادل للعينات الرئة. وتعرض الخطوات الحاسمة مختلفة من تشريح جراحي (الشكل 5A-5E). موقف الماوس أمر بالغ الأهمية. يجب أن يجمد الحيوان شقة على انها الظهر رئيس العكس من مشغل ومباشرة. الإيثانول وينبغي أن تستخدم بحرية لالإعدادية قبل شق الأول لتجنب انتشار الشعر في عينات والتلوث الجرثومي المحتملين من الجلد. الجلد هو أوعية دموية بشكل جيد ويجب أن تراجع بعناية لتجنب النزيف (الشكل 5A). ثم يتم متكأ القفص الصدري بعد شق الصدر الجانبي خلالها القفص الصدري ينبغي الحفاظ باستمرار في قبضة ملاقط لتجنب الإصابة إلى القلب والرئتين خلال شق. تتعرض الرئة والقلب (الشكل 5B). الرئة غير المصابة تظهر بيضاء (الشكل 5B). تشريح للمنطقة عنق الرحم يفضح القصبة الهوائية وخياطة هي سيارةوضعت efully خلف القصبة الهوائية العليا (الشكل 5C). Cannulating القصبة الهوائية يجب أن يؤديها مع الحذر. لا تستخدم قنية ذات الحجم الكبير (الحد الأقصى لحجم 20 G). A شق صغير الأمامي من القصبة الهوائية membraneous بين حلقتين الغضروفية يسمح إدخال قنية. عندما لوحظ قنية بالشفافية من خلال القصبة الهوائية فوق كارينا (الشكل 5D)، ويرتبط الخيط بإحكام حول القصبة الهوائية تأمين حولها قنية (الشكل 5E). يتم توصيل قنية إلى 3 في اتجاه الذكور صمام لور قفل مع 2 الحقن متصلة الموانئ الإناث. يحتوي على واحد حقنة الجليد الباردة PBS لغسل القصبات. والآخر هو فارغ لسحب السائل BAL. يجب chaged هذه الحقن بين المجموعات. في الختام، فتيلة قبل الحاد نموذج إصابة الرئة هو نموذج ذات الصلة وقوية لاستكشاف التفاعلات في الجسم الحي بوساطة المضيفة بين مسببات الأمراض. استخدام الحيوانات هوالقيد الرئيسي، وينبغي أن يكون وزنه بعناية ضد من المعلومات التي يمكن الحصول عليها في المختبر.

<html> النماذج الحيوانية، وخاصة الفئران، وقد استخدمت على نطاق واسع لاستكشاف الاستجابات المناعية ضد المسببات المرضية. على الرغم من الحصانة الفطرية والمكتسبة تختلف بين القوارض والبشر 7، وسهولة في تربية وتنمية بالضربة القاضية للعديد من الجينات، وجعل الفئران نموذجا ممتازا لدراسة الاستجابات المناعية 8. الاستجابة المناعية معقدة والنتائج من التفاعل بين العوامل المسببة للأمراض، والفلورا الميكروبية والعديد من المناعة (الخلايا الليمفاوية، العدلات، الضامة) وغير المناعية (الخلايا الظهارية، وخلايا بطانة الأوعية الدموية) أنواع الخلوية 2. وفي الدراسات المختبرية لا تسمح مراقبة هذه التفاعلات المعقدة وتركز أساسا على فريدة التفاعلات الخلية من مسببات الأمراض. في حين أن النماذج الحيوانية يجب أن تستخدم بحذر وتقتصر على أسئلة محددة للغاية وذات الصلة، ونماذج الماوس توفر نظرة ثاقبة إلى الاستجابة الثدييات المناعة في الجسم الحي، وقد تتناول أجزاء من الأسئلة السريرية المهمة 7. &quot;jove_content&quot;&gt; في الشعب الهوائية، والمجتمع الميكروبي معقد ربط عدد كبير من الكائنات الحية الدقيقة المختلفة 6. في حين أن ما يشكل &quot;العادي&quot; microbiome الهوائية لا يزال يتعين تحديدها والمجتمعات المقيمة هي متعدد المكروبات في كثير من الأحيان، وتأتي من مصادر بيئية متنوعة. المرضى الذين يعانون من القيحي أمراض الرئة المزمنة (التليف الكيسي، bronchectasis) أو المرضى التهوية الميكانيكية تظهر على النباتات معينة بسبب الاستعمار في الشعب الهوائية بواسطة الكائنات الحية الدقيقة المكتسبة بيئيا 9. الزائفة الزنجارية والمبيضات البيض على حد سواء مشكلة مسببات الأمراض 5، في كثير من الأحيان معزولة معا من العينات الرغامية القصبية ، ومسؤولة من العدوى الانتهازية شديد في هؤلاء المرضى، وخاصة في وحدة العناية المركزة (ICU) 4. عزل هذه الكائنات الدقيقة أثناء الالتهاب الرئوي الحاد في نتائج ICU في العلاج المضاد للميكروبات ضد P. الزنجارية بوفي العادة لا تعتبر التحرير الخميرة الممرضة في هذا الموقع 5. في المختبر التفاعلات بين P. الزنجارية وC. تم الإبلاغ على نطاق واسع البيض وأظهرت أن هذه الكائنات الدقيقة يمكن أن تؤثر على نمو وبقاء بعضها البعض ولكن الدراسات لا يمكن أن يستنتج إذا وجود C. البيض هو ضار أو مفيد للمضيف (10). وقد وضعت نماذج الماوس للتصدي لهذا أهمية P. الزنجارية وC. وكان البيض في الجسم الحي، ولكن التفاعل بين الكائنات الحية الدقيقة يست النقطة الرئيسية. في الواقع، تم إنشاء نموذج لتقييم مشاركة C. البيض في الاستجابة المناعية، والنتيجة. A النموذج السابق الذي أنشأه رو وآخرون تستخدم بالفعل الاستعمار الأولي مع C. يتبع البيض من قبل التهاب في الرئتين الحاد الناجم عن P. الزنجارية. عن طريق نموذجهم، وجد الباحثون دورا الضار لصrior C. البيض الاستعمار 11. ومع ذلك تستخدم رو وآخرون حمولة عالية من C. البيض في نموذجهم مع 2 × 10 6 خلية / الماوس خلال 3 أيام متتالية. أنشأنا نموذجا 4 أيام من C. الاستعمار الهوائية البيض، أو على الأقل استمرار دون وقوع إصابات الرئة، وفي هذا النموذج C. تم استرداد البيض تصل إلى 4 أيام بعد تقطير واحد من 10 5 كفو في الماوس (الشكل 2B) 12،13. بعد 4 أيام، لم يكن هناك أي دليل على تجنيد خلية التهابات، وإنتاج السيتوكينات الالتهابية ولا ضرر الظهارية. في 24 - 48 ساعة، في وجود ذروة C. البيض، على الرغم من ولوحظ استجابة المناعية الفطرية الخلوية وخلوى، لم يكن هناك دليل على إصابة الرئة. والمثير للدهشة، وبالتالي الفئران مع المستعمر، C. البيض 48 ساعة قبل الأنف تقطير من P. قد الزنجارية الموهن العدوى مقارنة مع الفئران مع P. العدوى الزنجارية وحدها. أناndeed، أظهرت الفئران أقل إصابة الرئة وانخفاض عبء البكتيرية 12،13. عدة فرضيات يمكن أن يفسر هذا التأثير المفيد للاستعمار مسبق مع C. البيض على P. الزنجارية بوساطة التهاب في الرئتين الحاد. أولا، وهو عبر الحديث بين الأنواع التي تشمل كل الكائنات الحية الدقيقة أنظمة نصاب الاستشعار، وP. القائم على homoserinelactone نظام الزنجارية وC. القائم على فارنيسول نظام البيض، تم تقييمها. ثانيا، C. وقد درس البيض بوصفها هدفا &quot;شرك&quot; لP. الزنجارية تحويل الممرض من الخلايا الظهارية الرئة. تم إبطال كل من الفرضيات (بيانات غير منشورة). كانت الفرضية الثالثة التي ل&quot;فتيلة&quot; للنظام المناعة الفطرية التي كتبها C. البيض مسؤولة عن تعزيز استجابة فطرية لاحقة ضد P. الزنجارية. وقد أكد هذه الفرضية الأخيرة. في الواقع C. أدى البيض الاستعمار إلى فتيلة الحصانة الفطرية throuغ IL-22، يفرز أساسا من الخلايا اللمفاوية الفطرية، مما أدى إلى زيادة إزالة بكتيريا وخفض إصابة الرئة 12. في الختام، المضيف هو الفاعل المركزي في التفاعل بين الكائنات الحية الدقيقة تحوير الاستجابة المناعية الفطرية والتي تشمل أنواع مختلفة من الخلايا الالتهابية. في حين أن هذه التفاعلات المناعية المعقدة يمكن تشريح في المختبر الفرضيات الأولية لا يمكن إلا أن تقدمها مناسبة في النماذج الحية. وينص البروتوكول التالية مثال على الدراسة المجراة من بوساطة المضيف تفاعل العوامل المسببة للأمراض التي يمكن تكييفها لالكائنات الحية الدقيقة الأخرى.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="729">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sevorane, Sevoflurane</td>
			<td style="width:185px;">Abott</td>
			<td style="width:161px;">05458-02</td>
			<td style="width:167px;">250 mL plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluorescence Reader Mithras&#160; LB940</td>
			<td style="width:185px;">Berthold Technologies</td>
			<td style="width:161px;">reference in first column</td>
			<td>no comment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromo-cresol purple agar</td>
			<td style="width:185px;">Biomerieux</td>
			<td align="right" style="width:161px;">43021</td>
			<td>x20 per unit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pentobarbital sodique 5,47%</td>
			<td style="width:185px;">CEVA</td>
			<td align="right" style="width:161px;">6742145</td>
			<td>100 mL plastic bottle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-headed valve&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Distrimed</td>
			<td align="right" style="width:161px;">92831</td>
			<td>no comment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sterile inoculation loop 10 &#181;L</td>
			<td style="width:185px;">Dutscher</td>
			<td align="right" style="width:161px;">10175</td>
			<td>x1000 conditioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insuline syringes 1 mL</td>
			<td style="width:185px;">Dutscher</td>
			<td align="right" style="width:161px;">30003</td>
			<td>per 100 conditioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2 positions Culture tube 8 mL</td>
			<td style="width:185px;">Dutscher</td>
			<td align="right" style="width:161px;">64300</td>
			<td>no comment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultrospec 10&#160;</td>
			<td style="width:185px;">General Electric life sciences</td>
			<td style="width:161px;">80-2116-30</td>
			<td>no comment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hemolysis tubes 13 x 75 mm&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Gosselin</td>
			<td style="width:161px;">W1773X</td>
			<td>per 100</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PBS - Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:185px;">Life technologies</td>
			<td align="right" style="width:161px;">10010023</td>
			<td>packaged in 500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">amikacin 1g</td>
			<td style="width:185px;">Mylan</td>
			<td align="right" style="width:161px;">62516778</td>
			<td>per 10&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Heparin 10 000 UI in 2 mL</td>
			<td style="width:185px;">Pan pharma</td>
			<td align="right" style="width:161px;">9128701</td>
			<td>x 10 per unit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RAL 555 coloration kit</td>
			<td style="width:185px;">RAL Diagnostics</td>
			<td align="right" style="width:161px;">361550</td>
			<td>3 flacons of 100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1,5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:161px;">55.526.006</td>
			<td>x&#160; 1000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Transparent 300 &#181;L 96-well plate</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:161px;">82 1581500</td>
			<td>no comment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yest-peptone-Dextrose Broth</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:161px;">95763</td>
			<td>in powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FITC-albumin</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">A9771</td>
			<td>in powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Luria Bertani Broth</td>
			<td style="width:185px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">L3022</td>
			<td>in powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">25-gauge needle</td>
			<td style="width:185px;">Terumo or unisharp</td>
			<td style="width:161px;">A231</td>
			<td>x100 conditioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">A78300003</td>
			<td>no comment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying microbial communities in vivo: a model of host-mediated interaction between candida albicans and pseudomonas aeruginosa in the airways

دراسة التفاعل المضيف الممرض تمكننا من فهم الآليات الكامنة وراء المرضية خلال العدوى الميكروبية. التكهن المضيف يعتمد على ضلوع الاستجابة المناعية تكييفها ضد الممرض 1. استجابة مناعية معقدة وينتج عن التفاعل بين مسببات الأمراض وعدة أنواع الخلوية المناعية أو غير محصنة 2. وفي الدراسات المختبرية لا يمكن تميز هذه التفاعلات والتركيز على التفاعلات خلية الممرض. وعلاوة على ذلك، في مجرى الهواء 3، وخاصة في المرضى الذين يعانون من مرض الرئة المزمن القيحي أو في المرضى الذين يعانون التهوية الميكانيكية، هي المجتمعات متعدد المكروبات الحالية وتعقد التفاعل المضيف الممرض. الزائفة الزنجارية والمبيضات البيض على حد سواء مشكلة مسببات 4، في كثير من الأحيان معزولة من العينات الرغامية القصبية، و المرتبطة التهابات شديدة، وخاصة في وحدة العناية المركزة 5. التفاعلات الميكروبية لهاتم الإبلاغ بين هذه الجراثيم في المختبر ولكن التأثير الطبي لهذه التفاعلات لا يزال غير واضح 6. لدراسة التفاعلات بين C. البيض وP. الزنجارية، وهذا نموذج الفئران من C. البيض الهوائية الاستعمار، تليها P. تم تنفيذ التهاب في الرئتين الحاد بوساطة aeruginosa-.

كما رأينا سابقا خلال وصف البروتوكول، تحتاج التجربة 5 أيام لاستكمال (الشكل 1: الجدول الزمني التجربة). والتمست مشغل واحد خلال الفترة السابقة كاملة من التجربة ويمكن التعامل مع العمليات تصل إلى حد أقصى قدره 10 الفئران. إذا كانت هناك حاجة إلى المزيد من الحيوانات، وهناك حاجة إلى شخصين بشكل خاص لجمع العينات الجراحية. في الواقع جميع العينات يجب جمعها في أقل من 2 ساعة لتجنب زيادة تسرب السنخية الشعرية السلبي من الألبومين FITC المسمى في الفئران الماضية. الخطوة الأولى هي إعداد C. البيض اللقاح وتقطير داخل الأنف للحصول على الاستعمار الهوائية التي كتبها C. البيض. يتم الحصول على نموذج 4 أيام استمرار كتبها الأنف تقطير 5 × 10 5 كفو من C. البيض في الماوس (الشكل 2B). خلال هذه الأيام 4، الفئران اكتساب الوزن (الشكل 2A) وتقطير من 5X10 5 كفو لا يسبب لإصابة اونج (الشكل 2C). على الرغم من C. البيض قد تستمر حتى 4 أيام في هذا النموذج، ويقلل الحمل بعد 48 ساعة. لذلك، P. وperfomed التهاب في الرئتين الحاد الزنجارية يسببها في 48 ساعة من C. البيض المثابرة. P. سلالة الزنجارية PAO1 هو سلالة المختبر تتسم إلى حد كبير يتألف من عامل الفوعة كبير، نوع نظام ثلاث إفراز (T3SS)، كما هو الحال في 75٪ من الرئة السريرية يعزل 15. لأسباب الأطروحات، PAO1 هو سلالة ذات الصلة في نماذج حيوانية من التهاب في الرئتين الحاد. يتم تقييم إصابة الرئة من خلال الحويصلى-capillar نفاذية تقاس تسرب البروتين من مقصورة الأوعية الدموية في مجرى الهواء التعبير عن مؤشر إصابة الرئة. الرئة يزيد الإصابة مع اللقاح (الشكل 3A). نحن هنا تقرير حركية المكون إصابة الرئة الحاد في نموذجنا الناجمة عن سلالة PAO1 (5X10 6 CFU / الماوس) (الشكل 3B-3F) وحده دون موافقة مسبقةC. albicans- فتيلة بوساطة. اعتمادا على سلالة والوقت بطبيعة الحال من طراز، واختيار P. الأولي ويناقش الزنجارية اللقاح في المقطع التالي ويقترح في الجدول 1. استخدمت خمسة فئران لكل مجموعة. تم تحديد مؤشر الرئة الإصابة (الشكل 3B)، وعبء بكتيرية في الرئة (الشكل 3C)، وعبء البكتيريا في الطحال، مما يعكس نشر البكتيري (الشكل 3D)، BAL الخلوية (الشكل 3E) وعدد خلايا التفاضلية (الشكل 3F) كل 12 ساعة. وكانت إصابة الرئة القصوى بين 24 ساعة و 36 ساعة بعد الإصابة (الشكل 3B). أظهر عبء البكتيرية 1-تسجيل كفو / مل خفض كل 24 ساعة (الشكل 3C). نشر البكتيري التراكمي المقررة من قبل الثقافات جناسة الطحال زاد كل يوم (الشكل 3D). وأخيرا، في حين نال الخلوية في الفئران غير المصابة وتتكون بشكل رئيسي (90٪) سالضامة السنخية واو، في BAL من الفئران المصابة، تم تجنيد العدلات على نطاق واسع وأظهر عدد خلايا التفاضلية 90٪ العدلات و 10٪ الضامة والخلايا اللمفية (الشكل 3E، 3F). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53218/53218fig1.jpg" /> الشكل 1. الجدول الزمني للإصابة الرئة الحادة نموذج لاستكشاف التفاعل بوساطة المضيف بين C. البيض وP. الزنجارية. التمثيل البياني للالإجراء بأكمله. الخطوة الأولى هي التكيف البيئي من الفئران في منشأة سكنية. الخطوة الثانية هي C. البيض بوساطة الاستعمار مجرى الهواء. وأخيرا، فإن الخطوة الثالثة هي عدوى الرئة الحاد بوساطة P. الزنجارية. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53218/53218fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <pالطبقة = &quot;jove_content&quot; FO: المحافظة على together.within صفحة = &quot;1&quot;&gt; <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53218/53218fig2.jpg" /> الشكل 2. C. البيض الهوائية الاستعمار. (A، B) الفئران غرست الأنف مع 10 5 كفو C. البيض (سلالة SC5314). الفئران اكتساب الوزن خلال C. الاستعمار الهوائية البيض بوساطة (A). استعمار مجرى الهواء يمكن أن تطول لمدة 3-4 أيام مع واحد فقط تقطير الأولي. وفي دراسة سابقة، فتيلة الحصانة الفطرية يحدث بين 24 و 48 ساعة. (ن = 5 لكل مجموعة)، تمثل أشرطة الخطأ وسائل ± SD. غرست (C، D) الفئران الأنف 5 × 10 5 أو 5 × 10 6 كفو من C. البيض. مؤشر الرئة إصابة (C) المقررة من قبل السنخية نفاذية جدار الشعيرات الدموية في 24 ساعة. زيادة الوزن (D) أعرب كنسبة مئوية من الوزن الأولي (ن = 5 لكل مجموعة).تمثل أشرطة الخطأ وسائل ± SD. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53218/53218fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53218/53218fig3.jpg" /> الشكل 3. نموذج الحادة إصابة الرئة الناجمة عن P الزنجارية. وداخل أنفيا المصابة (A) C57BL / 6J الفئران مع الأحمال المتزايدة للP. الزنجارية (من 1 × 06 حتي 05 أكتوبر × 10 7 CFU في الماوس) (ن = 5 لكل مجموعة)، تمثل أشرطة الخطأ وسائل ± SD. يصرح باستخدامها الفئران في 24 ساعة. يتم تقييم مؤشر إصابة الرئة السنخية-الشعرية نفاذية الحاجز الذي يزيد بشكل متناسب مع العبء البكتيرية. مقارنة الرقم القياسي لإصابة الرئة التي تم الحصول عليها باستخدام الطريقة القديمة مع الرئة الخليط supernatants (أشرطة سوداء) والجديد جنبا إلى جنب، طريقة استخدام supernatants غسل القصبات (شريط رماديمصابون ق) (BF) الفئران داخل أنفيا مع 5 X10 6 كفو في الماوس. يصرح باستخدامها الفئران كل 12-48 ساعة لحركية نموذج الإصابة الحادة. ويتم تقييم أيضا إصابة الرئة (B)، عبء بكتيرية في الرئة (C)، وعبء البكتيرية الطحال (D)، غسل القصبات (BAL) الخلوية (E) وBAL عدد خلايا التفاضلية (F). (ن = 5) لكل مجموعة، تمثل أشرطة الخطأ وسائل ± SD. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53218/53218fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/53218/53218fig4.jpg" /> الرقم 4. المعدات الجراحية والطريق الأنفي تقطير. (A) &#160; المعدات الجراحية المطلوبة لأداء نموذج الإصابة الحادة وغسل القصبات. هنا قنية القصبة الهوائية (20ترتبط G) واثنين من 1 مل المحاقن إلى لور قفل صمام 3-الطريقة. واحد حقنة لحقن الماء في الرئتين، واحدة لرسم السائل القصبات مرة أخرى للخروج من الرئتين. (B، C) &#160; موقف الماوس في اليد لأداء تقطير داخل الأنف. في هذه الصورة، الإبهام تحت الفك يضمن الفم المغلق خلال تقطير. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53218/53218fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/53218/53218fig5.jpg" /> الرقم 5. الجراحة والغسل النزلة السنخ. يتم فتح الصدر على نطاق واسع (A)، ويتم فتح القفص الصدري أفقيا لتجنب الإصابة إلى القلب (B). وبعد جمع الدم، يتم تشريح منطقة عنق الرحم لفضح القصبة الهوائية (C). يستخدم خيط تنظيف الأسنان باعتبارهايتم تمرير الخيط وراء القصبة الهوائية (C، D). ثم يتم مقنى القصبة الهوائية مع قنية 20-G مجتمعة (D) التي شنت على حقنة وصمام 3-الطريقة. وينبغي تأمين القصبة الهوائية بإحكام حول قنية عن طريق ربط عقدة الجراحية باستخدام الخيط في مكان وراء القصبة الهوائية. وأخيرا 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وتغرس بلطف في الرئتين ومن ثم يتم رسم BAL برفق. (E)، غرست السائل الرئتين. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53218/53218fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> عبء تغرس الحد الأدنى </td><td> القصوى مغروس عبء </td></tr><tr><td> T3SS- </td><td> 5 × 10 7 </td><td> 1 × 10 8 </td></tr><tr><td> T3SS + </td><td> 5 × 10 6 </td><td> 1 × 10 7 </td></tr><tr><td> T3SS + exoU + </td><td> 5 × 10 <suP&gt; 4 </td><td> 1 × 10 5 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. P. الزنجارية قائح المستخدمة في الرئة الحاد العدوى نماذج. تركيزات الأنف المثلى المقترحة قائح للحث على إصابة الرئة الحادة وفقا لسلالات.

Watch this Scientific Journal Video about Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways at JoVE.com

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

دراسة المجتمعات الميكروبية<em&gt; في فيفو</em&gt;: نموذج من التفاعل بوساطة بين المضيف<em&gt; المبيضات البيض</em&gt; و<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; في الخطوط الجوية

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

studying-microbial-communities-vivo-model-host-mediated-interaction

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

8.4K Views.  Université Lille. While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Video: Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

عزل الحمض النووي الريبي الزائفة الزنجارية استعمار الهضمي المسالك الفئران

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

استخدام متوسط ​​البلغم الاصطناعي لاختبار فعالية المضادات الحيوية لمكافحة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; في شروط أكثر ملاءمة لالرئة التليف الكيسي

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

الزائفة الزنجارية المستحثة الرئة الإصابات نموذج

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. Chronic mouse wounds models have been used to understand the underlying interactions between the microorganisms and the host. The models developed to date rely on the use of haired animals and terminal collection of wound tissue for determination of viable bacteria. While significant insight has been gained with these models, this experimental procedure requires a large number of animals and sampling is time consuming. We have developed a novel murine model that incorporates several optimal innovations to evaluate biofilm progression in chronic wounds: a) it utilizes hairless mice, eliminating the need for hair removal; b) applies pre-formed biofilms to the wounds allowing for the immediate evaluation of persistence and effect of these communities on host; c) monitors biofilm progression by quantifying light production by a genetically engineered bioluminescent strain of Pseudomonas aeruginosa, allowing real-time monitoring of the infection thus reducing the number of animals required per study. In this model, a single full-depth wound is produced on the back of STZ-induced diabetic hairless mice and inoculated with biofilms of the P. aeruginosa bioluminescent strain Xen 41. Light output from the wounds is recorded daily in an in vivo imaging system, allowing for in vivo and in situ rapid biofilm visualization and localization of biofilm bacteria within the wounds. This novel method is flexible as it can be used to study other microorganisms, including genetically engineered species and multi-species biofilms, and may be of special value in testing anti-biofilm strategies including antimicrobial occlusive dressings.

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Here we describe a novel diabetic murine model utilizing hairless mice for real-time, non-invasive, monitoring of biofilm wound infections of bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. This method can be adapted to evaluate infection of other bacterial species and genetically modified microorganisms, including multi-species biofilms, and test the efficacy of antibiofilm strategies.

تأتي إلى "جانب الضوء": "في فيفو" الرصد الزائفة الزّنجاريّة بيوفيلم الالتهابات في "الجروح المزمنة" في "نموذج مورين أصلع السكري"

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

الاستخدام التكميلي للتقنيات المجهرية والقراءة الفلورية في دراسة تفاعلات Cryptococcus-Amoeba

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

التصور من المبيضات الbicans في الجهاز الهضمي Murine باستخدام التهجين في الموقع الفلورسنت

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of chronic wound infections in diabetic and hospitalized patients. There is an urgent need for chronic infection models to aid in the investigation of wound pathogenesis and the development of new therapies against this pathogen. Here, we describe a protocol that uses delayed inoculation 24 hours after full-thickness excisional wounding. The infection of the provisional wound matrix present at this time forestalls either rapid clearance or dissemination of infection and instead establishes chronic infection lasting 7&#8211;10 days without the need for implantation of foreign materials or immune suppression. This protocol mimics a typical temporal course of post-operative infection in humans. The use of a luminescent P. aeruginosa strain (PAO1:lux) allows for quantitative daily assessment of bacterial burden for P. aeruginosa wound infections. This novel model may be a useful tool in the investigation of bacterial pathogenesis and the development of new therapies for chronic P. aeruginosa wound infections.

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

We describe a delayed inoculation protocol for generating chronic wound infections in immunocompetent mice.

نموذج التلقيح المتأخر لعدوى الجروح المزمنة الزائفة الجيروجينوسا

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch from yeast-form growth to hyphal growth. Cells initiating this process become adherent to surfaces as well as to each other, with the resulting development of a biofilm colony. This commonly occurs not only on mucosal tissue surfaces in yeast infections, but also on medical implants such as catheters. It is well known that biofilm cells are resistant to antifungal drugs, and that cells that shed from the biofilm can lead to dangerous systemic infections. Biofilms range from heavily translucent to opaque due to refractive heterogeneity. Therefore, fungal biofilms are difficult to study by optical microscopy. To visualize internal structural, cellular, and subcellular features, we clarify fixed intact biofilms by stepwise solvent exchange to a point of optimal refractive index matching. For C. albicans biofilms, sufficient clarification is attained with methyl salicylate (n = 1.537) to enable confocal microscopy from apex to base in 600 &#181;m biofilms with little attenuation. In this visualization protocol we outline phase contrast refractometry, the growth of laboratory biofilms, fixation, staining, solvent exchange, the setup for confocal fluorescence microscopy, and representative results.

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

To view and quantify the internal features of Candida albicans biofilms, we prepare fixed intact specimens that are clarified by refractive index matching. Then, optical sectioning microscopy can be used to obtain three-dimensional image data though the full thickness of the biofilm.

توضيح والتصوير المبيضات ألبيكانس بيوفيم

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important role in the dissemination and pathogenesis of this opportunistic fungal pathogen. However, methods to visualize fungal hyphae in the GI tract in vivo are challenging which limits the understanding of environmental signals in controlling this morphogenesis process. The protocol described here demonstrates a novel ex vivo method for visualization of hyphal morphogenesis in gut homogenate extracts. Using an ex vivo assay, this study demonstrates that cecal contents from antibiotic treated mice, but not from untreated control mice, promote C. albicans hyphal morphogenesis in the gut content. Further, adding back specific groups of gut metabolites to the cecal contents from antibiotic-treated mice differentially regulates hyphal morphogenesis ex vivo. Taken together, this protocol represents a novel method to identify and investigate the environmental signals that control C. albicans hyphal morphogenesis in the GI tract.

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

The ex vivo assay described in this study using gut homogenate extracts and immunofluorescence staining represents a novel method to examine the hyphal morphogenesis of Candida albicans in the GI tract. This method can be utilized to investigate the environmental signals regulating morphogenetic transition in the gut.

مُسَاَنّة مُعَدِيّة سابقة لدراسة المبيضات المبيضات البَيكانسِيّة الواصلة Morphogenesi في الجهاز الهضمي

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic infection. The development of chronic P. aeruginosa infections is associated with a decline in lung function and increased morbidity. Therefore, there is a great interest in elucidating the reasons for the failure to eradicate P. aeruginosa with antibiotic therapy which occurs in approximately 10-40% of pediatric patients. One of many factors that can affect host clearance of P. aeruginosa and antibiotic susceptibility is variations in spatial organization (such as aggregation or biofilm formation) and polysaccharide production. Therefore, we were interested in visualizing the in situ characteristics of P. aeruginosa within the sputum of CF patients. A tissue clearing technique was applied to sputum samples after embedding the samples into a hydrogel matrix to retain the 3D structures relative to host cells. After tissue clearing, fluorescent labels and dyes were added to allow visualization. Fluorescence in situ hybridization was performed for the visualization of bacterial cells, binding of fluorescently labeled anti-Psl-antibodies for the visualization of the exopolysaccharide and DAPI staining to stain host cells to obtain structural insight. These methods allowed for the high-resolution imaging of P. aeruginosa within the sputum of CF patients via confocal laser scanning microscopy.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

This protocol provides methods for visualization of bacterial cells and polysaccharide synthesis locus (Psl) polysaccharide within the sputum of cystic fibrosis patients.