هذا البروتوكول تعديل ATAC-seq يقدم عازلة تحلل جديدة أن يقلل من تلويث يقرأ الميتوكوندريا من 50٪ إلى أقل من 3٪، وسوف انخفاض التلوث الميتوكوندريا يسمح للباحثين لأداء أكثر كفاءة ATAC-seq مع انخفاض 50٪ في تكاليف التسلسل. لقد تم التحقق من صحة هذا البروتوكول الجديد ATAC-seq في PBMCs الأساسية البشرية، monocytes الإنسان الأولية، الخلايا الماوس تقشر، وخطوط خلايا سرطان الجلد. ونحن نعتقد أنه سيكون فعالا في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا.
التقليل من فقدان العينة أثناء تنشيط الخلية وعملية الاختيار أمر بالغ الأهمية للحصول على نتائج عالية الجودة مع ATAC-seq. سوف نبين كيفية التعامل مع أعداد صغيرة من الخلايا من عينات ثمينة باستخدام معدات المختبرات الأساسية. للبدء، ذوبان قارورة واحدة من خلايا CD4 + T المعزولة سابقا في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى يذوب الجليد للتو.
ثم نقل بلطف الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر يحتوي على تسعة ملليلتر من دورة RPMI كاملة قبل تسخينها. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 1،500 مرة G، وأربع درجات مئوية، لمدة ست دقائق. ثم تجاهل فائقة، وإعادة بلطف بيليه في مليلتر اثنين من دورة في الدقيقة كاملة.
بعد تكرار الطرد المركزي، والتخلص من عظمى، وبلطف إعادة تعليق الخلايا في 0.5 ملليلتر من دورة في الدقيقة كاملة. استخدم مقياس الدم لحساب الخلايا. باستخدام دورة في الدقيقة كاملة، ضبط كثافة تعليق الخلية إلى لوحة 50، 000 CD4 + الخلايا في 200 ميكرولترات لكل بئر من 96 جيدا جولة أسفل لوحة.
ثم, لإعداد الخرز المغناطيسي, aliquot 12.5 ميكرولترات من الإنسان T-المنشط CD3/CD28 الخرز لكل ATAC-seq عينة إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. إضافة ملليلتر واحد من 1X PBS إلى الأنبوب، ووضعها على المغناطيس لمدة دقيقة واحدة لغسل الخرز. إزالة بعناية وتجاهل نابيرانت واضحة، وإزالة أنبوب من المغناطيس.
Resuspend الخرز في 13 ميكرولترات من دورة في الدقيقة كاملة لكل ATAC-seq عينة. لتنشيط خلايا CD4 + T مع التركيز المعدل، وجمع 500،000 خلية في 2.1 ملليلتر من متوسطة كاملة RPMI في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. إضافة 12.5 ميكرولترات من الخرز T-Activator الإنسان، أعدت وغسلها في الخطوات السابقة، ومزيج بلطف عن طريق عكس الأنبوب.
ثم نقل بلطف الخلايا، مع الخرز، إلى خزان معقمة. باستخدام ماصة متعددة القنوات، لوحة 200 ميكرولترات من الخلايا مع الخرز في بئر من لوحة 96-جيدا الجولة القاع، واحتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون حاضنة لمدة 48 ساعة. بعد الحضانة كاملة، الطرد المركزي لوحة في 423 مرات G، ودرجة حرارة الغرفة، لمدة ثماني دقائق.
إزالة 100 ميكرولترات من المتوسط من كل بئر، وجمعها في أنبوب مخروطي قبل التخلص منها، من أجل تأكيد عدم فقدان الخرز. ثم إعادة تعليق بيليه الخلية في 100 ميكرولترات المتبقية من المتوسطة، وجمع كل شيء في أنبوب 1.5 ملليلتر. لعزل CD4 + الخلايا، إضافة 50 ميكرولترات من الخرز CD4 مترافق غسلها مسبقا إلى 500، 000 خلية في ملليلتر واحد من دورة في الدقيقة كاملة، وعكس لمزيج.
احتضان لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية، في حين نفض الغبار باليد كل ست دقائق لخلط. ضع الأنبوب على المغناطيس لمدة دقيقتين ، حتى يكون فائق الوضوح واضحًا ، ثم قم بإزالةه وتجاهله. إزالة أنبوب من المغناطيس.
غسل الخلايا مرتبطة حبة عن طريق إعادة تعليق لهم في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني، بالإضافة إلى 2٪ FCS، ووضع أنبوب مرة أخرى على المغناطيس لمدة دقيقة واحدة. تجاهل اضحة فائقة، وتكرار هذه العملية لما مجموعه ثلاثة يغسل. بعد الغسيل النهائي، ضع الأنبوب على المغناطيس لمدة دقيقة واحدة.
إزالته، والتخلص من عظمى، ووضع بيليه على الجليد. بعد ذلك ، لأداء عزل النواة ، resuspend الخرز والخلايا في 50 ميكرولترات من عازلة التحلل البارد ، والطرد المركزي على الفور في 500 G ، أربع درجات مئوية ، لمدة 10 دقائق. إزالة وتجاهل ناظر.
لأداء رد فعل transposase، resuspend بيليه نوى معزولة مع 50 ميكرولترات من مزيج تراباسي Tn5. احتضان في دراجة الحرارة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، مع غطاء تعيين إلى 40 درجة مئوية، ومن ثم عقد في أربع درجات مئوية عند الانتهاء. مباشرة بعد الدراجات الحرارية، تنفيذ سريع مقاعد البدلاء أعلى جهاز طرد مركزي تدور إلى أسفل.
وضع أنبوب على المغناطيس لمدة دقيقة واحدة لإزالة الخرز من المنتج. دون إزالة الأنبوب من المغناطيس، نقل فائقة واضحة إلى عمود تنقية الحمض النووي. غسل العمود مرة واحدة مع 250 ميكرولترات من المخزن المؤقت PB، ومرتين مع 750 ميكرولترات من المخزن المؤقت PE.
ثم إضافة 10 ميكروليترس من عازلة elution ل elute العينة. قم بإعداد تفاعل التضخيم الأولي لل PCR في أنبوب PCR خال من النوى. ضع أنبوب PCR في الدراجات الحرارية، وتشغيل برنامج تضخيم PCR.
ثم أكمل التضخيم النهائي لل PCR لل45 ميكرولترات المتبقية من تفاعل PCR، كما هو موضح في المخطوطة. ضع أنبوب PCR في الدراجات الحرارية وتشغيل البرنامج. بعد التضخيم الكامل، تنقية المكتبات باستخدام مجموعة تنظيف PCR، بعد بروتوكول الشركة المصنعة، والفرز في 25 ميكروليترس من العازلة elution.
تسلسل المكتبات المعدة على التسلسل الجيل التالي إلى متوسط عمق القراءة من 42 مليون يقرأ لكل عينة. وقد أدى هذا البروتوكول المحسن ATAC-seq إلى إنتاج مكتبة نهائية تزيد عن نانوغرام واحد لكل ميكرولتر من أجل التسلسل. وأظهرت مراقبة الجودة شظايا الحمض النووي بين 200 و 1،000 زوج قاعدة، وتم إجراء مزيد من التسلسل مع هذه المكتبات عالية الجودة.
المكتبات المعدة بعد هذا البروتوكول أظهرت سوى 3٪ من التلوث الميتوكوندريا. نسبة عالية من يقرأ قابلة للاستخدام ثابتة بما فيه الكفاية عبر النسخ المتماثلات البيولوجية. وقد وفر هذا البروتوكول نتائج قابلة للاستنساخ إلى حد كبير عبر النسخ المتماثلة التقنية، فضلاً عن النسخ المتماثلة البيولوجية.
بالإضافة إلى ذلك، استغرق هذا البروتوكول 48 ساعة، بدلاً من أسبوع واحد أو أكثر كما هو موضح سابقاً، مما أدى إلى تنشيط متسق وفعال، كما هو موضح من خلال نتائج التسلسل القابلة للتكرار. وعلاوة على ذلك، فإن ذروة ATAC-seq المتوقعة كانت تسمى بدقة من قبل خط التحليل. كشف تحليل النتائج التسلسلية عن تغييرات واضحة في حالة الكروماتين أثناء تنشيط الخلايا T البشرية.
تم تحديد مناطق يمكن الوصول إليها بشكل متمايز من الكروماتين المفتوحة بين ست عينات قبل و 48 ساعة بعد التنشيط. تأكد من أن يتم تنفيذ تفاعل الانوية مع الكواشف والمواد المبردة ، من أجل تحقيق أقصى قدر من استعادة النوى السليمة. لدينا العازلة تحلل نويات معدلة هو ألطف على الخلايا، ويقلل من الحمض النووي الميتوكوندريا الملوثة.
ونحن نتطلع إلى تطبيق هذا العازل المعدل للتحلل على نظام النيوية الواحدة ATAC-seq أيضا. ونحن نعلم أن هذا البروتوكول سيسمح للباحثين بإنتاج بيانات أعلى جودة من ATAC-seq بتكلفة مخفّض، مما يساعد على إعادة توجيه المجال اللاجيني. البروتوكول هو واضح وسريع، ولا يتطلب أي الكواشف أو الصكوك الخطرة، مما يجعلها في متناول هذه الجديدة من ATAC-seq.
