هذه هي الورقة الأولى التي تعالج المشاكل التقنية في تسلسل الحمض النووي الرنا الصغيرة المستمدة من الخلايا خارج الخلية من الخلايا. تتطلب عينات NGS إعدادًا صارمًا ومراقبة الجودة. ونظرا لطبيعة المركبات الكهربائية، فإن عملية مراقبة الجودة لعينات EV تنحرف عن القاعدة.
وميزة هذا البروتوكول هي خطوات مراقبة الجودة في ذلك للمستخدمين لأول مرة. إثبات الإجراء سيكون (جويني سو) مساعد باحث من مختبري للبدء، لوحة الخلايا الجذعية mesenchymal الإنسان في 2،000 خلية لكل سنتيمتر مربع في وسائل الإعلام MSC الطازجة في خمس قارورة T175.
ثم تنمو الخلايا في 37 درجة مئوية في بيئة ثاني أكسيد الكربون 5 ٪ واستبدال وسائل الإعلام كل يومين إلى ثلاثة أيام، حتى يتم الحصول على خمس قارورة من 90٪ من الخلايا التقاء. بعد ذلك ، اغسل الخلايا ثلاث مرات مع 20 ملليلتر من PBS لكل قارورة. إضافة 20 ملليلتر من وسائل الإعلام مجموعة EV في كل قارورة.
واحتضان لهم في 37 درجة مئوية في بيئة 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة. جمع وسائل الإعلام والطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 300 غرام و أربع درجات مئوية. ثم جمع المابير، وأجهزة الطرد المركزي وسائل الإعلام لمدة 20 دقيقة في 2،000 غرام و أربع درجات مئوية.
جمع الماسخ مرة أخرى، وأجهزة الطرد المركزي وسائل الإعلام لمدة 30 دقيقة في 15، 500 غرام و أربع درجات مئوية. جمع ناظر للمرة الأخيرة. بعد ذلك، نقل وسائل الإعلام إلى أنابيب فائقة التركيز.
ويستخدم 60Ti زاوية ثابتة الدوار هنا، وسوف تكون راسية بيليه إلى جانب الأنبوب. وضع علامة على جانب الغطاء حيث من المتوقع بيليه، ورسم دائرة على جانب الأنبوب حيث من المتوقع بيليه. و بيليه exRNAs لمدة 90 دقيقة في 100، 000 غرام وأربع درجات مئوية.
بعد الطرد المركزي النهائي، إزالة ناطور. استخدم قطع صغيرة من الورق الماص لتجفيف داخل الأنبوب دون لمس الجزء السفلي من الأنبوب. ثم عكس الأنبوب على ورقة ماصة.
لإعادة بناء بيليه، إضافة 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني في كل أنبوب، ودوامة الأنبوب لمدة 30 ثانية. الماصات صعودا وهبوطا 20 مرة. ثم تقييم الخلايا خارج الخلية والجزيئات الحيوية الأخرى مع تحليل تتبع الجسيمات النانوية.
وتخزين بيليه في ناقص-80 درجة مئوية حتى مزيد من التجارب. بعد ذوبان العينات، استخدم طقم عزل RNA لاستخراج الحمض النووي الريبي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. Elute الجيش الملكي النيبالي من العمود المقدمة في طقم العزل RNA في 100 ميكرولترات من المياه RNAse خالية.
لتركيز الحمض النووي الريبي من خلال هطول الأمطار الإيثانول، إضافة ميكرولتر واحد من الجليكوجين، 10 ميكرولترات من اثنين من حمض نووي مولار-5.5 خلات الصوديوم، و 250 ميكرولترات من قبل المبردة 99٪ الإيثانول في 100 ميكرولترات من الحمض النووي الريبي المنقى. ثم احتضان العينات في ناقص 20 درجة مئوية بين عشية وضحاها لتسريع الجيش الملكي النيبالي. ل بيليه الجيش الملكي النيبالي، الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 16، 000 غرام وأربع درجات مئوية.
بعد ذلك، إزالة ناظر، وغسل بيليه الجيش الملكي النيبالي مع ملليلتر واحد من 75٪ الإيثانول. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة خمس دقائق في 16،000 ز و 4 درجات مئوية إلى بيليه الجيش الملكي النيبالي. إزالة الإيثانول، وترك غطاء أنبوب RNA مفتوحة لمدة خمس إلى 10 دقائق لتجفيف الهواء بيليه الحمض النووي الريبي.
Resuspend بيليه الجيش الملكي النيبالي في سبعة ميكرولترات من المياه RNAse خالية، واستخدام آلة الكهرباء الشعرية القائمة على رقاقة للكشف عن جودة الحمض النووي الريبي والتركيز. لبدء بناء المكتبة، ماصة خمسة ميكروليترس من الجيش الملكي النيبالي في أنبوب PCR قبل المبردة 0.2 ملليلتر. بعد ذلك، تمييع محولات 3'في المياه RNAse خالية بنسبة حجم واحد إلى 10.
إضافة 0.5 ميكرولترات من محول المخفف في أنبوب RNA، والماصات الخليط صعودا وهبوطا ثماني مرات. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة لجمع كل السائل في الجزء السفلي من الأنبوب. احتضان خليط محول الحمض النووي الريبي في 70 درجة مئوية لمدة دقيقتين في دورة حرارية مسخنة مسبقا.
ثم ضع العينة مرة أخرى على الكتلة المبردة. بعد ذلك، إضافة ميكرولتر واحد من العازلة الربط، 0.5 ميكرولترات من مثبطات RNAse، و 0.5 ميكرولترات من T4 الحمض النووي الريبي في خليط محول الحمض النووي الريبي. الماصات صعودا وهبوطا ثماني مرات، والطرد المركزي لفترة وجيزة.
ثم احتضان الأنبوب في 28 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في الدورة الحرارية المسخّن مسبقا. بعد ذلك، إضافة 0.5 ميكرولترات من محلول التوقف في أنبوب العينة، مع أنبوب البقاء في دورة الحرارية. الماصات صعودا وهبوطا ثماني مرات، والاستمرار في احتضان في 28 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
تخفيف 5'محولات في المياه RNAse خالية بنسبة حجم واحد إلى 10. أضف 0.5 ميكرولترات من المحول المخفف إلى أنبوب PCR منفصل 0.2 ملليلتر. سخني المحول 5'في 70 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
ثم ضع العينة على الكتلة المبردة. إضافة 0.5 ميكرولترات من 10 نانومول ATP و 0.5 ميكرولترات من T4 RNA ligase إلى أنبوب 5'محول. الماصات صعودا وهبوطا ثماني مرات.
وطرد مركزي لفترة وجيزة لجمع كل السوائل في القاع. بعد ذلك، إضافة 1.5 ميكرولترات من خليط 5'محول في عينة RNA. الماصات ثماني مرات بلطف شديد، واحتضان العينة في 28 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
للحصول على cDNA، تمييع التمهيدي النسخ العكسي في المياه الخالية من RNAse بنسبة حجم واحد إلى 10. إضافة 0.5 ميكرولترات من التمهيدي المخفف في عينة الحمض النووي الريبي، ماصة ثماني مرات بلطف شديد، والطرد المركزي لفترة وجيزة. ثم احتضان الحمض النووي الريبي وخليط التمهيدي في 70 درجة مئوية لمدة دقيقتين في دورة الحرارية المسخّن مسبقا.
ثم ضع العينة على كتلة مبردة. المقبل, إضافة ميكرولتر واحد من 5X أول ستراند العازلة, 0.5 ميكرولترات من 12.5 ملليمتر DNTP خليط, 0.5 ميكرولترات من 100 ملليمولار DTT, 0.5 ميكرولترات من مثبطات RNAse, و 0.5 ميكرولترات من النسخ العكسي في أنبوب عينة. الماصات ثماني مرات بلطف شديد.
وطرد مركزي لفترة وجيزة. احتضان العينة في 50 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في دورة الحرارية المسخّن مسبقا. بعد ذلك، إضافة 4.25 ميكرولترات من المياه فائقة الpure، 12.5 ميكرولترات من مزيج PCR، واحد ميكرولتر من التمهيدي مؤشر، وميكر واحد من التمهيدي العالمي في عينة cDNA.
الماصات صعودا وهبوطا ثماني مرات، والطرد المركزي لفترة وجيزة. وأخيراً، ضع العينة في دورة حرارية، و إعداد الدراجات وفقاً للمخطوطة. لتنقية مكتبة RNA، استخدم جزء حجم الحمض النووي الآلي لتكهين الأشرطة بين 140 و160 زوجًا أساسيًا.
تشغيل المكتبة المستخرجة على عمود القائمة على مجموعة تنقية PCR، وeute المكتبة في 10 ميكرولترات من المياه RNAse خالية. للتحقق من حجم المكتبة، قم بتحميل ميكرولتر واحد من المكتبة المنقاة على رقاقة الحمض النووي، واتبع بروتوكول الشركة المصنعة. لتحديد تركيز المكتبة، أولاً تخفيف ميكرولتر واحد من المكتبة المنقية في 10 ملليمولار pH-8.0 تريس-Hcl مع 0.05٪ بوليسوربات 20 بمعدل حجم واحد إلى 1، 000.
ثم قم بتشغيل QPCR باستخدام معايير الحمض النووي طقم القياس الكمي للمكتبة التجارية. وأخيراً، تجمع كميات متساوية من المكتبات وفقا لمتطلبات آلة التسلسل، وتسلسل على نظام تسلسل عالية الإنتاجية. وشمل المخطط الكهربائي للرنا خارج الخلية مجموعة واسعة من الحمض النووي الريبي الريبي.
وعلى النقيض من ذلك، أظهر الحمض النووي الخلوي قمم متميزة جدا، المقابلة ل5STRNA، 5.8SRRNA، 18SRRNA، و 28SRRNA. وكانت الجودة الناتجة عن ذلك للمكتبتين عالية وقابلة للمقارنة. وأظهر توزيع طول المكتبتين ذروة واحدة عند 22 نوكليوتيدات، مع ارتباطها بالمغذيات الريبة.
وعلى النقيض من ذلك، كانت المكتبات من الرنا الرنا خارج الخلية أكثر تجانساً، واحتوت على قمتين أكثر ترتبطان بالذرات الـ RNAs، أو النصفين والشظايا، أو الـ piRNAs. تم تعيين 65٪ من القراءات من الحمض النووي الريبي الخلوي إلى microRNAs البشرية ، وكل من الحمض النووي الريبي الصغير الآخر يمثل جزءًا صغيرًا من القراءات المعينة. وعلى النقيض من ذلك، فإن 8٪ فقط من الرنا الرنا خارج الخلية تتطابق مع الرنا الصغير البشري.
وكان الجيش الملكي النيبالي الصغيرة الأكثر وفرة التي كانت قراءات تعيين tRNAs، ويطابقها في وقت لاحق لا مثيل لها لتسلسلات بكتيرية. وتشير مقارنة مع جينوم الأبقار إلى أن FBS لم تكن مصدرا للتلوث. وبالتالي، RNAs خارج الخلية يحمل لمحة غير نمطية بالمقارنة مع الحمض النووي الريبي الخلوي العادي.
وتعد المكتبة جزءاً حاسماً من هذا البروتوكول. يجب أن يتم خلط بلطف شديد لتجنب فقاعات من تشكيل. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة للتحقيق في ملف تعريف exRNAs من أنواع أخرى من الخلايا، مما يساعد على دراسة وظيفة exRNAs.
