Этот модифицированный протокол ATAC-seq вводит новый буфер лиза, который уменьшает загрязняющие митохондриальные считывания с 50% до менее чем 3%Снижение митохондриального загрязнения позволит исследователям выполнять более эффективные ATAC-seq с 50%снижением затрат на секвенирование. Мы проверили этот новый протокол ATAC-seq в первичных ПХМР человека, первичных моноцитах человека, дендритных клетках мыши и линиях клеток меланомы. Мы считаем, что он будет эффективен в широком диапазоне типов клеток.
Минимизация потери выборки в процессе активации и отбора клеток имеет решающее значение для получения высококачественных результатов с помощью ATAC-seq. Мы продемонстрируем, как обрабатывать небольшое количество клеток из драгоценных образцов с помощью основного лабораторного оборудования. Для начала оттайте один флакон ранее изолированных клеток CD4-T в 37-градусной водяной бане по Цельсию до тех пор, пока лед только не растает.
Затем аккуратно перенесите клетки в 15-миллилитровую коническую трубку, содержащую девять миллилитров предварительно разогретой полной RPMI. Центрифуга клеток в 1500 раз G, и четыре градуса по Цельсию, в течение шести минут. Затем отбросьте супернатант и аккуратно повторно посовелите гранулы в два миллилитров полного RPMI.
После повторения центрифугации, отбросить супернатант, и осторожно повторного перерасхода клеток в 0,5 миллилитров полного RPMI. Используйте гемоцитометр для подсчета клеток. Используя полный RPMI, отрегулируйте плотность подвески ячейки до пластины 50 000 CD4-клеток в 200 микролитров на колодец 96-хорошо круглой нижней пластины.
Затем, чтобы подготовить магнитные бусы, aliquot 12,5 микролитров человека T-Activator CD3/CD28 шарики на ATAC-seq образца 1,5 миллилитров трубки. Добавить один миллилитр 1x PBS в трубку, и поместите его на магнит в течение одной минуты, чтобы вымыть бисер. Аккуратно удалите и отбросьте чистый супернатант, и удалите трубку из магнита.
Перепробовать бисер в 13 микролитров полного RPMI в ATAC-seq образца. Чтобы активировать клетки CD4'T с скорректированной концентрацией, соберите 500 000 ячеек в 2,1 миллилитров полной среды RPMI в 15-миллилитровой конической трубке. Добавьте 12,5 микролитров бусинок человека T-Activator, приготовленные и вымытые в предыдущих шагах, и аккуратно перемешайте трубку.
Затем аккуратно перенесите клетки с бисером в стерильный резервуар. Использование многоканальные пипетки, пластины 200 микролитров клеток с бисером на колодец круглого дна 96-хорошо пластины, и инкубировать в 37-градусный по Цельсию, 5%CO2 инкубатор в течение 48 часов. После полной инкубации центрифуга пластины в 423 раза G, и комнатная температура, в течение восьми минут.
Удалите 100 микролитров среды из каждой колодец, и собрать его в конической трубе перед отбрасывания, с тем чтобы подтвердить не потери бисера. Затем повторно помеская клеточная гранула в оставшиеся 100 микролитров среды, и собрать все в 1,5-миллилитровую трубку. Чтобы изолировать клетки CD4, добавьте 50 микролитров предварительно вымытых конъюгированных бусин CD4 в 500 000 ячеек в один миллилитр полного RPMI и инвертируйте для смешивания.
Инкубировать в течение 20 минут при четырех градусах по Цельсию, в то время как руки стряхивая каждые шесть минут, чтобы смешать. Поместите трубку на магнит в течение двух минут, пока супернатант не будет ясен, а затем удалить и выбросить. Снимите трубку с магнита.
Вымойте клетки, связанные бисером, повторно помыв их в один миллилитр PBS, плюс 2%FCS, и поместите трубку обратно на магнит в течение одной минуты. Откажитесь от явного супернатанта и повторите этот процесс в общей сложности три моет. После окончательной стирки поместите трубку на магнит на одну минуту.
Удалите его, отбросьте супернатант и поместите гранулы на лед. Далее, чтобы выполнить изоляцию ядер, перерасход бисера и клеток в 50 микролитров холодного буфера лиза, и центрифуга сразу при 500 G, четыре градуса по Цельсию, в течение 10 минут. Удалите и отбросьте супернатант.
Для выполнения реакции транспозазы, повторно использовать изолированные ядра гранулы с 50 микролитров Tn5 транспозазы смеси. Инкубировать в термоциклер в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию, с крышкой установить до 40 градусов по Цельсию, а затем провести при четырех градусах по Цельсию, когда завершена. Сразу же после термоциклов, выполнить быстрый скамейке верхней центрифуги спин-вниз.
Поместите трубку на магнит в течение одной минуты, чтобы удалить бисер из продукта. Не удаляя трубку из магнита, перенесите четкий супернатант в колонку для очистки ДНК. Вымойте столбец один раз с 250 микролитров буфера ПБ, и дважды с 750 микролитров буфера PE.
Затем добавьте 10 микролитров буфера elution, чтобы утехать образец. Настройка первоначальной реакции усиления ПЦР в трубке ПЦР без нуклеазы. Поместите трубку ПЦР в термоциклер и запустите программу усиления ПЦР.
Затем завершите окончательное усиление ПЦР оставшихся 45 микролитров реакции ПЦР, как описано в рукописи. Поместите трубку ПЦР в термоциклер и запустите программу. После полного усиления очистите библиотеки с помощью комплекта очистки PCR, следуя протоколу производителя, утеря в 25 микролитров буфера elution.
Последовательность подготовленных библиотек на секвенсоре следующего поколения со средней глубиной чтения 42 миллиона считых на образец. Этот улучшенный протокол ATAC-seq подготовил окончательную библиотеку с более чем одним нанограммом на микролитер для секвенирования. Контроль качества показал фрагменты ДНК между 200 и 1000 базовых пар, и дальнейшее секвенирование было выполнено с этими высококачественных библиотек.
Библиотеки, подготовленные по этому протоколу, показали лишь 3%митохондриального загрязнения. Высокий процент годных к использования считых материалов достаточно постоянн в биологических репликациях. Этот протокол обеспечил весьма воспроизводимые результаты по техническим репликациям, а также биологическим репликациям.
Кроме того, этот протокол занял 48 часов, а не одну неделю или более, как описано ранее, что привело к последовательной и эффективной активации, о чем свидетельствуют воспроизводимые результаты последовательности. Кроме того, прогнозируемые пики ATAC-seq были точно вызваны аналитическим конвейером. Анализ результатов секвенирования выявил явные изменения в состоянии хроматина во время активации Т-клеток человека.
Дифференциально доступные области открытого хроматина были выявлены между шестью образцами до и через 48 часов после активации. Убедитесь, что реакция лиза ядер выполняется с охлажденными реагентами и материалами, чтобы максимизировать восстановление нетронутых ядер. Наш модифицированный буфер лиза ядер мягче на клетках, и сводит к минимуму загрязнение митохондриальной ДНК.
Мы с нетерпением ожидаем, что этот модифицированный буфер лиза будет применяться и к одноядерным ATAC-seq. Мы знаем, что этот протокол позволит исследователям производить высококачественные данные ATAC-seq по сниженным затратам, помогая продвигать эпигенетическое поле. Протокол прост, быстр и не требует каких-либо опасных реагентов или инструментов, что делает его легко доступным для тех, кто является новым для ATAC-seq.
