Ce protocole utilise CRISPR-Cas9 pour créer des lignes knock-out ou knock-in. Le principal avantage de cette technique est qu’il est simple et efficace à suivre en particulier pour les chercheurs novices. Pour le passage cellulaire, traiter les cellules de culture pendant la nuit avec deux millilitres de 0,25% trypsine EDTA par plaque à 37 degrés Celsius pendant deux minutes.
Lorsque les cellules se sont levées du fond de la plaque, neutraliser la réaction enzymatique avec deux millilitres de milieu de culture cellulaire, et transférer la suspension cellulaire dans un tube conique. Recueillir les cellules par centrifugation et resuspendre la pastille en cinq millilitres de milieu de culture cellulaire fraîche pour le comptage. Puis semer 1,8 fois 10 à la cinquième cellule dans un puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits pour la culture du jour au lendemain à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Pour la transfection des cellules, ajouter un volume approprié de mélange de transfection contenant la concentration appropriée de plasmide CRISPR au volume approprié de réaccente de transfection, selon la conception expérimentale et les instructions du fabricant. Après avoir incubé le mélange de transfection à température ambiante pendant la période recommandée, ajoutez la solution aux cellules d’une manière goutte-sage. Puis faites pivoter doucement la plaque pour mélanger et placer la plaque dans un incubateur humidifié de 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.
À la fin de la transfection, ajouter 150 microlitres de trypsine-EDTA pour dissocier les cellules comme vient de le démontrer et recueillir les cellules détachées par centrifugation. Resuspendez la pastille dans 2% sérum bovin fœtal dans PBS et filtrez les cellules à travers une passoire en maille de 30 micromètres dans un tri cellulaire activé par fluorescence de cinq millilitres, ou tube FACS. Ensuite, utilisez les cellules non transfected pour définir une barrière de contrôle négative sur le cytomètre d’écoulement et trier les cellules transfected selon le marqueur fluorescent sur le plasmide CRISPR utilisé pour la transfection dans un tube contenant 100 microlitres de milieu de culture cellulaire.
Lorsque toutes les cellules transfectées ont été collectées, pelleter les cellules par centrifugation à vitesse maximale et résuspendre la pastille dans 300 microlitres de milieu de culture cellulaire. Ensemencer 200 microlitres de cellules dans un puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits et permettre aux cellules de récupérer pendant quelques jours dans un incubateur de 37 degrés Celsius. Pelleter les 100 microlitres restants des cellules triées à vitesse maximale pendant cinq minutes et extraire l’ADN génomique de la pastille résultante selon les protocoles standard d’extraction de l’ADN.
Ensuite, ajoutez 10 microlitres de tampon de réaction en chaîne de polymésase, un microlitre de mélange de désoxynucléotide, 2,5 microlitres d’amorce inverse définie par l’utilisateur, 0,5 microlitres de polyméthère d’ADN, deux à cinq microlitres du modèle d’ADN génomique extrait et suffisamment d’eau double-distillée pour apporter la réaction à un volume final de 50 microlitres. Exécutez le mélange sur un cycleur thermique et résolvez la réaction sur un gel d’agarose de 2% utilisant le tampon 1X TAE selon les protocoles standard. Utilisez un scalpel propre et pointu pour exciser le produit réagir à la chaîne de polymésase et purifier l’ADN à l’aide d’un kit d’extraction de gel selon les instructions du fabricant.
Mesurer la concentration du produit à l’aide d’un spectrophotomètre à 260 nanomètres d’absorption. Préparez un mélange d’analyse contenant 200 nanogrammes de l’ADN isolé, deux microlitres de tampon de réaction T7 endonuclease I, et suffisamment d’eau double-distillée pour porter le volume final du mélange à 19 microlitres. Reanneal le produit de réaction en chaîne de polymése dans un cycleur thermique aux paramètres indiqués et mélanger cinq unités d’endonuclease I de T7 avec le produit réannealed pour une incubation de 50 minutes à 37 degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, résoudre l’ADN digéré sur un gel agarose de 2,5% à l’aide du tampon 1X TAE, et l’image du gel sur un système d’imagerie gel approprié. Ouvrez l’image de gel dans ImageJ et dessinez une boîte rectangulaire autour de la bande aussi près que possible de sa limite. Cliquez sur Analyser et définir les mesures, confirmant que la zone, la valeur grise moyenne et les options de densité intégrées sont vérifiées.
Cliquez sur OK, et sélectionnez Analyser et mesurer. La valeur moyenne, ou valeur de densité d’intensité brute, est indicative de l’intensité de la bande. Lorsque les cellules transfectées par la culture commencent à devenir confluentes, détachez-les avec de la trypsine-EDTA, comme démontré, et ensemencez les cellules de façon clairsemée dans un plat de culture tissulaire de 100 millimètres pour permettre aux colonies individuelles de croître avant de retourner les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire.
Lorsque les colonies commencent à se former, utilisez un microscope avec un grossissement de quatre X pour choisir les colonies individuelles pour le transfert dans les puits individuels d’une plaque de 24 puits contenant 500 microlitres de milieu de culture cellulaire par puits. Faites en sorte que votre pointe ne touche pas les colonies environnantes pour empêcher le mélange des colonies à l’intérieur de puits individuels ou de cueillir dans une zone de croissance de colonie clairsemée. Lorsque tous les clones ont été cueillis, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire jusqu’à ce que les cultures deviennent confluentes.
Comme les plasmides non digérés sont super-bobines, ils ont tendance à courir plus vite que leurs homologues linéarisés. Pour déterminer si les oligonucléotides ont été clonés avec succès dans l’épine dorsale plasmide CRISPR, la PCR de la colonie est effectuée et les clones positifs sont inoculés avant que les plasmides ne soient extraits et envoyés pour le séquençage sanger. Le signal fluorescent peut être facilement visualisé au microscope lors d’une livraison réussie des plasmides, permettant aux cellules transfectées d’être triées par cytométrie d’écoulement.
Un test T7 endonuclease I est effectué pour vérifier l’efficacité du clivage de l’ADN génomique, tel que calculé à partir des intensités des bandes observées sur un gel d’agarose. En outre, si une expérience basée sur la réparation dirigée par homologie est conçue pour incorporer un site de restriction au locus cible, un test de polymorphisme de longueur de fragment de restriction peut être exécuté avec une enzyme de restriction correspondante. Pour valider davantage qu’un gène codant protéique a été inactivé avec succès, une tache occidentale peut être effectuée pour s’assurer qu’aucune protéine ciblée n’est présente.
Le tri des cellules après la transfection élimine les cellules sans plasmides incorporés, augmentant ainsi le pourcentage de cellules examinées à des stades ultérieurs comme ayant un gène knock-out ou knock-in. Avec le développement de cette technique, nous sommes maintenant en mesure de produire des lignées cellulaires knock-out pour étudier la fonction génétique et knock-in lignes cellulaires pour modéliser des maladies spécifiques pour comprendre leur mécanisme.
