لقد عرضنا أول نموذج لثقافة الخلية لعدوى فيروس Cell Polyoma. ويتضمن البروتوكول عزل الخلايا الليفية الجلدية، وإعداد عدوى فيروس MCPyV، والتلطيخ المناعي، والتهجين الفلوري في الموقع. هذا البروتوكول يجعل من الممكن لدراسة دورة MCPyV المعدية والتفاعلات مع الخلايا المضيفة مع تجنب القطع الأثرية المرتبطة بالإفراط في التعبير عن الجينات الفيروسية.
للبدء، استخدمي مقصًا لتقليم الأنسجة الدهنية وتحت الجلد من قبل قلع الأطفال حديثي الولادة. قطع عينة الجلد في النصفين أو أرباع. وضع الأنسجة في 5 ملليلتر من 10 ملليغرام لكل ملليلتر dis-based II NPBS, تكمل مع مضاد المضادات الحيوية.
احتضان في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، استخدم ملقط microdissection لفصل البشرة بعناية من طبقات الجلد في طبق 10 سم. نقل الأنسجة الجلدية الناتجة إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر يحتوي على 5 ملليلتر من 2 ملليغرام لكل ملليلتر الكولاجين من النوع الرابع في المتوسطة خالية من FBS تكملها المضادات الحيوية anitmycotic.
احتضان العينة في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع اهتزاز دورية لمدة أربع إلى ست ساعات، حتى تبقى فقط مجاميع الأنسجة العيانية قليلة. بعد ذلك، استخدم ماصة 10 ملليلتر إلى ماصة حل العينة صعودا وهبوطا بقوة 10 مرات، والإفراج عن خلايا واحدة من الأدمة. جهاز طرد مركزي في 180 غرام لمدة خمس دقائق والتخلص من فائقة.
لوحة الخلايا المتفككة في ملحق DMEM المتوسطة. في وقت متأخر من بعد الظهر أو المساء، بذور 6 ملايين 293TT28 الخلايا في طبق 10 سم تحتوي على مكملة DMEM المتوسطة. احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
في صباح اليوم التالي، تأكد من أن الخلايا هي حوالي 50٪ التقاء، ثم transfect الخلايا مع 66 ميكرولترات من كاشف transfection، 12 ميكروغرام من MCPyV إعادة ربط عزل R17B الحمض النووي، 8.4 ميكروغرام من ST التعبير plasmid pMtB، و 9.6 ميكروغرام من التعبير LT plasmid pADL. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، عندما تكون الخلايا المصابة متشابكة تقريبًا ، تُرقب الخلايا ونقلها إلى طبق طوله 15 سنتيمترًا للتوسع المستمر.
عندما يصبح هذا الطبق اّلكون تقريباً، قم بنقل الخلايا إلى ثلاثة أطباق جديدة طولها 15 سنتيمترًا. عندما تصبح تلك الأطباق الجديدة التقاء تقريبا، حصاد الخلايا كما هو مبين في بروتوكول النص. جهاز طرد مركزي عند 180 غ في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
ثم إزالة فائقة وإضافة حجم خلية واحدة من المغنيسيوم DPBS. إضافة 25 كبريتات الأمونيوم ميكرومولار، تليها 0.5٪ تريتون X-100، 0.1٪ البنزوناس، و 0.1٪ من DNAse المعتمدة على ATP. تخلط جيدا واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي، يبرد الخليط على الجليد لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، إضافة 0.17 حجم كلوريد الصوديوم. مزيج واحتضان على الجليد لمدة 15 دقيقة أخرى.
جهاز طرد مركزي عند 12 ألف غرام عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. إذا كان المُندفع غير واضح، عكس الأنبوب بلطف وكرر الطرد المركزي. بعد هذا، نقل المُندفع إلى أنبوب جديد.
Resuspend بيليه في 1 حجم DPBS تكملت مع 0.8 الشامات من كلوريد الصوديوم. جهاز طرد مركزي عند 12 ألف غرام عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. إذا كان المُندفع غير واضح، عكس الأنبوب بلطف وكرر الطرد المركزي.
الجمع بين اثنين من supernatants والطرد المركزي مرة أخرى في 12 ألف غرام في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. ثم، استخدم ماصة لإيداع تدرجات من iodixanol في رقيقة الجدران خمسة أنابيب بوليلومر ملليلتر كما هو مبين في بروتوكول النص. تحميل 3 ملليلتر من اعلى اعلى من اللوينات المضمن للفيروسات على قمة تدرج الوديكسول المعد.
جهاز طرد مركزي مع دوار SW 55 Ti في 234 ألف غرام و 16 درجة مئوية لمدة 3.5 ساعات، مع التأكد من ضبط التسارع والتباطؤ إلى إبطاء. بعد اكتمال الطرد فائقة التركيز، وجمع 12 كسور في أنابيب سيليكون. بعد الحفاظ على وفصل الخلايا، في 10 ملليلتر من DMEM مكملة وF12 المتوسطة إلى الطبق.
نقل حل الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر. جهاز طرد مركزي عند 180 غرام لمدة دقيقتين. تخلص من الخلايا الفائقة وإعادة تعليقها في DMEM و F12 المتوسطة المكملة في كثافة الخلايا بين 20 ألف و 40 ألف خلية لكل ملليلتر.
ثم، البذور 200 أو 400 ميكرولترات من تعليق الخلية تكمل مع 1 مليغرام لكل ملليلتر من نوع الكولاجين الرابع في كل بئر من 24 أو 96 لوحة جيدا، على التوالي. إزالة المخزون MCPyV فيرون من الفريزر ناقص 80 درجة مئوية ووضع على الجليد للذوبان. إضافة 1 مليار مكافئ الجينوم الفيروسي من فيروس MCPyV لكل ميكرولتر واحد من الوديكسول لكل 2500 إلى 5000 الخلايا التي يمكن أن تكون مصابة.
اضغط على جانب اللوحة بلطف، واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. أولا، إصلاح الخلايا على غطاء زلات مع 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق، ثم غسل الغطاء زلات مرتين مع برنامج تلفزيوني وعلاجها مع 70٪ الإيثانول في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها ل Permeabilize الخلايا. في اليوم التالي، استبدل الإيثانول بمخزن ترطيب المسبار واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة لتهجين العينات مسبقًا.
قبل 30 دقيقة من نهاية الحضانة ما قبل التهجين، تمييع المسابير في حل التهجين التحقيق في تخفيف 1:500 واحتضان في 45 درجة مئوية. عندما تكون الحضانات كاملة، ما يقرب من 10 ميكرولترات من خليط مسبار المخفف على شريحة المجهر لكل زلة الغطاء. ضع كل جانب من جوانب خلية زلة الغطاء لأسفل على قطرة كل منها من مزيج التهجين.
باستخدام كمية ليبرالية من الاسمنت المطاطي، وختم حواف والعودة من كل زلة الغطاء إلى الشريحة. تعيين الشريحة على الجانب المسطح من كتلة الحرارة وتسخينها إلى 94 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك، نقل الشريحة إلى غرفة مرطبة واحتضانها في 45 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي، استخدم ملقط لتقشر بعناية بعيدا الاسمنت المطاطي. وضع غطاء زلات الخلية الجانب حتى في آبار لوحة 24 جيدا وغسلها مع مخزن غسل المسبار ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة. أضف 200 ميكروليترات من عازلة التضخيم إلى كل بئر تحتوي على زلة غطاء وتحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 إلى 60 دقيقة.
وفي الوقت نفسه، الحنجل كل من اثنين من دبابيس الشعر oligonucleotide المسمى الاعتراف المسابير في أنابيب PCR منفصلة عن طريق تسخينها إلى 94 درجة مئوية لمدة 90 ثانية، ومن ثم تبريدها إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. اخلط دبابيس الشعر معًا في مخزن التضخيم عند تخفيف 1:50. المقبل، تمتد فيلم البارافين على الوجه المفتوح لغطاء لوحة 12 جيدا لجعل سطح لتفاعل التضخيم.
Pipette 50-100 قطرات ميكرولتر من خليط دبوس الشعر على فيلم البارافين لكل زلة الغلاف. باستخدام ملقط، وإزالة بعناية كل زلة الغطاء من محلول ما قبل التضخيم ولمس الحافة إلى مسح قابل للتخلص من الثغرات لتجف. ضع كل غطاء جاف جانب الخلية زلة أسفل على قطرة التضخيم.
نقل غطاء لوحة في غرفة مرطبة واحتضان بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام. في اليوم التالي، العودة زلات الغطاء إلى آبار لوحة 24 بئر. أضف 5X SSCT التي تحتوي على DAPI بتركيز 0.5 ميكروغرام لكل ملليلتر إلى كل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
بعد ذلك، قم بغسل العينات مرتين باستخدام 5X SSCT في درجة حرارة الغرفة. قم بتركيب الغطاء المغسول ينزلق على شرائح المجهر، واستخدم مجهر الفلورانس المقلوب لتحليل الخلايا وصورة العينات. في هذه الدراسة ، يتم عزل مجموعة من الخلايا الليفية الجلدية البشرية بشكل شبه متجانس.
Stainscent immunofluorescent يكشف أن ما يقرب من 100٪ من الخلايا الجلدية البشرية معزولة ملطخة بشكل إيجابي لعلامات الخلايا الليفية الجلدية، vimentin، والكولاجين، ولكن سلبية لخلفة الإنسان keratinocyte علامة K14. ثم يتم إنشاء virions MCPyV وبعد تصور الفرقة من virions MCPyV تتركز في قلب التدرج، يتم جمع 500 كسور ميكرولتر ويتم تنفيذ QPCR MCPyV لتحديد الكسور الذروة. تظهر الصور الملطخة بالمناعة من HDFs المصابة بـ MCPyV هنا، حيث تعتبر الخلايا التي تكون موجبة لتي، VP1 إيجابية، أو كل من LT و VP1 إيجابية لتكون إيجابية لعدوى MCPyV.
أكثر من 30٪ من الخلايا هي إيجابية LT، وأكثر من 10٪ هي VP1 إيجابية. يتم الكشف عن جينوم MCPyV المكررة في الخلايا المصابة باستخدام كل من HCR-DNA FISH و Fish immunofluorescent-HCR-DNA FISH. في حين أن HCR-FISH يكشف عن توطين الحمض النووي MCPyV الموجود في مصنع النسخ المتماثل ، فإن طرق Fish Immunofluorescent-HCR-DNA تسمح بالكشف المتزامن لكل من الحمض النووي MCPyV و LT protein شارك في الترجمة في مراكز النسخ المتماثل.
لتحقيق أفضل كفاءة عدوى الفيروس, من المهم جدا أن يتم تركيز MCPyV على الأقل 2 × 10 إلى 8 الجينوم الفيروس في ميكرولتر منذ يودوكسول هو سام للخلايا. بعد عدوى MCPyV من الخلايا الليفية الجلدية، يمكن إجراء العديد من التحليلات البيولوجية الجزيئية، بما في ذلك المناعة، والحجب المناعي، والمناعة، والتشكيل القائم على qPCR. نظام العدوى الذي وصفناه يجعل من الممكن للباحثين دراسة مراحل العدوى MCPyV مثل الاتجار النووي والتعبئة والتغليف الفيروسي.
MCPyV هو فيروس BSL-2 ، ولكن لا يعرف الكثير عن إمكاناته لعلم الأمراض في الكميات التي تحققت في بيئة المختبر. ولذلك، ينبغي للباحثين اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب التعرض للفيروس.
