ونود أن نعترف جورج الصليب للحصول على المشورة العامة في الأحياء المثقبيات. وأيد هذا العمل أيضا من قبل مؤسسة بيل وميليندا غيتس الحملة العالمية للتعليم منحة لDS، وجبهة الخلاص الوطني العليا زمالة أبحاث (DGE-1325261) لMRM والمعاهد الوطنية للصحة / NIAID (منحة # AI085973) إلى FNP. نشكر Galadriel الكوخ، مينر للاستخدام من سلالة يحتوي على موقع الجين والاعتراف I-SCEI.

ملاحظة: في جميع أنحاء الداخلي، فمن الضروري للحفاظ على الخلايا على الجليد. وينبغي أيضا أن تستخدم وسائل الإعلام في جميع أنحاء الباردة. حصاد 1. عينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو معلن 427 المثقبيات سلالة الدم إلى كثافة ،5-1٬000٬000 / مل. فمن الأفضل أن تبدأ الثقافات مع عدد قليل من الطفيليات. تدور باستمرار 50 × 10 6 خلايا / عينة لمدة 10 دقيقة في 1500 ز س. تأكد من ترك 1 × 10 6 خلايا في الثقافة في وقت لاحق استخدام عناصر التحكم كما الإيجابية والسلبية الأضداد. ملاحظة: يمكن أيضا أن هذا البروتوكول استخدامها على المثقبيات معزولة من دم الحيوانات (انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة أو صب من أكثر من طاف (ترك حوالي 750 ميكرولتر). نقل الخلايا إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور الخلايا في 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق في 5200 x ج في microcentrifuge وإزالة طاف. </li></ol> 2. وضع العلامات المغناطيسي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في 150 مستنبت ميكرولتر (HMI-9 وايمصل عشر مثلا) + الأساسي الأجسام المضادة لمكافحة VSG في التخفيف المناسبة. ملاحظة: يرصد-VSG مكافحة الأجسام المضادة في المنزل واستخدامها في التخفيف من 01:50. من المهم أن استخدام الأجسام المضادة الأولية لمكافحة VSG التي لم يتم المسمى مع fluorophore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا دوامة باستخدام دوامة محول-60 بسرعة 6-8 في غرفة باردة عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. يغسل مع 800 - 1000 ميكرولتر الباردة HMI-9 مع المصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق في 5200 x ج ونضح طاف. تغسل مع 1 مل HMI-9 مع المصل وتدور على النحو الوارد أعلاه. نضح طاف. بيليه resuspend في 100 ميكرولتر من HMI-9 مع المصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 110 ميكرولتر من خلية المغناطيسي تنشيط الفرز (MSC) ميكروبيدات. استخدام لمكافحة فأر، المضادة للأرنب، أو حبات مكافحة البيوتين بما يتناسب مع الأجسام المضادة لمكافحة VSG الأساسي. اخلط جيدا. خلايا دوامة في غرفة باردة عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما الخلايا vortexing ل، مجموعة واحدة المغناطيسي تنشيط فصل العمود / عينة على المغناطيس الانفصال. يجب التأكد من أن إعادةceptacle (نستخدم أنبوب الطرد المركزي 15 مل) تحت العمود لجمع التدفق من خلال. إعداد جهاز في غرفة باردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل من HMI-9 مع المصل إلى العمود الوزراء. بعد فتيلة مكان أنبوب الطرد المركزي 15 مل تحت العمود لجمع التدفق من خلال من كل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حضانة 10 دقيقة في الخطوة 2.4، إضافة 800-1،000 ميكرولتر الباردة HMI-9 مع المصل. تدور في 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق في 5200 x ج وإزالة طاف لإزالة الأجسام المضادة غير منضم. تغسل مع 1 مل من HMI-9 مع المصل وتكرار ترك 100 ميكرولتر من طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نفض الغبار أنبوب الطرد المركزي بقوة وفحص أنبوب للتأكد من أن بيليه هو معلق تماما. إضافة 1 مل من HMI-9 مع المصل وماصة صعودا وهبوطا للتأكد من أن الخلايا معلق أيضا. </li></ol> 3. الفصل المغناطيسي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمان تستعد الأعمدة كما هو موضح أعلاه. تطبيق الخلايا إلى العمود. جمع التدفق من خلال بخلايا معربا عن VS غير المهيمنج 1 مل من المتوسط ​​+ المثقبيات وعادة ما يستغرق 6-7 دقيقة لتدفق من خلال العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 2X مع 1 مل من HMI-9 مع المصل وجمع التدفق عن طريق الأنبوب نفسه كما في الخطوة 3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفجوة التدفق من خلال (3 مل) في اثنين من 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. ملاحظة: هذه يمكن أن تكون مجتمعة في وقت لاحق أو نصف يمكن استخدامها لعزل الحمض النووي الريبي، الخ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عمود من المغناطيس. إضافة 3 مل من HMI-9 مع المصل إلى عمود وعمود يغرق في أنبوب 15 مل الطرد المركزي للحصول على خلايا التي تعبر عن الانطلاق، المهيمن VSG. إزالة 300 ميكرولتر من المواد مزال لتحليلها لاحقا. تبقى هذه الخلايا على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاستخدامها بوصفها إيجابية ومراقبة سلبية، واتخاذ ما يقرب من 1 مليون خلية من ثقافة ابتداء من خلايا سيطرة متزايدة على 37 درجة مئوية (التي لا يتوقع أن التبديل في كثير من الأحيان) وماصة لهم في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. ملاحظة: سوف تكون ملطخة الخلايا السيطرة الإيجابية مع الأجسام المضادة المسمى fluorophore في الخطوة 4.1. سلبي الخلايا السيطرة ريمافي غير ملوثين خلال الفترة المتبقية من البروتوكول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات تدور التدفق من خلال وإيجابية العينة الضابطة الأجسام المضادة عند 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق في 5200 x ج وإزالة طاف. ملاحظة: آخر قسامة 300 ميكرولتر من خلايا مزال يمكن استخدامها كوسيلة لمراقبة إيجابية لمكافحة VSG تلطيخ. </li></ol> 4. تلطيخ في التعرف على الملوثات والتي تتيح أفضل طريقة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات التدفق من خلال و resuspend والخلايا السيطرة الإيجابية في 100 ميكرولتر من HMI-9 مع المصل + الابتدائي، وصفت fluorophore، الأجسام المضادة لمكافحة VSG في التخفيف المناسبة. ملاحظة: يرصد المسمى مكافحة VSG الأجسام المضادة في المنزل واستخدامها في التخفيف من 1: 1000. وصفت fluorophore، ويمكن مكافحة VSG يكون من المصدر نفسه والأضداد توضيحها في الفصل بالاعمال step.There يجب أن يكون 3 مل من عينة التدفق من خلال في اثنين من أنابيب microcentrifuge التالية خطوة 3.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل كل من التدفق من خلال التدفق الخلوي، والجمع بين الكريات في أنابيب microcentrifuge اثنين حين إعادة سوس-بانتظار العينات في 100 ميكرولتر من HMI-9 مع المصل + مكافحة VSG الأجسام المضادة. اخلط جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا دوامة في غرفة باردة عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. إضافة 800 - 1000 ميكرولتر الباردة HMI-9 مع المصل. عينات تدور في 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق في 5200 x ج وإزالة طاف لإزالة الأجسام المضادة غير منضم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع 1 مل من HMI-9 مع المصل. عينات تدور في 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق في 5200 x ج وإزالة طاف. خلال هذه تدور الماضي، وتدور أسفل-عينات مزال من الخطوة 3.4 وعينة السيطرة السلبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend كل التدفق من خلال عينات مزال في: 148.5 ميكرولتر HMI-9 مع المصل، 25 ميكرولتر الخرز العد المطلق و 1.5 ميكرولتر التأيد Propidium تلطيخ حل (175 ميكرولتر المجموع). و resuspend العينات الإيجابية والسلبية مراقبة الأجسام المضادة في 175 ميكرولتر HMI-9 مع المصل. تأكد من تسجيل عدد من الخرز العد المطلقة / 25 ميكرولتر من أجل الكثير معين المستخدمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل جميع العينات من خلال قياس التدفق الخلوي وجمع البيانات. الخلايا الميتة وصمة عار كما PI <sup&gt; +. الملوثات وصمة عار كما PI - VSG +. المحولات وصمة عار كما PI - VSG - 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب تبديل الترددات باستخدام التدفق الخلوي البيانات. ملاحظة: للحصول على إرشادات حول كيفية حساب الترددات التحول، يرجى الرجوع إلى ملف إضافي <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54715/Flow_Cytometry_Calculations.docx" target="_blank">التدفق الخلوي Calculations.docx</a> والجدول 1. </li></ol>

<ol>
	<li>Horn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+variation+in+African+trypanosomes.">Antigenic variation in African trypanosomes.</a> Molecular &amp; Biochemical Parasitology. 195 (2), 123-129 (2014).</li><li>Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+antigen+switching+rates+in+Trypanosoma+brucei.">Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 92 (Pt 2), 355-367 (1986).</li><li>Rudenko, G., McCulloch, R., Dirks-Mulder, A., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+exchange+can+be+an+important+mechanism+of+variant+surface+glycoprotein+gene+switching+in+Trypanosoma+brucei.">Telomere exchange can be an important mechanism of variant surface glycoprotein gene switching in Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 80 (1), 65-75 (1996).</li><li>Turner, C. M., Barry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei+rhodesiense+infections.">High frequency of antigenic variation in Trypanosoma brucei rhodesiense infections.</a> Parasitology. 99 (Pt 1), 67-75 (1989).</li><li>Miller, E. N., Turner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+antigenic+types+appearing+in+first+relapse+populations+of+clones+of+Trypanosoma+brucei.">Analysis of antigenic types appearing in first relapse populations of clones of Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 82 (1), 63-80 (1981).</li><li>Horn, D., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Trypanosoma+brucei+vsg+expression+site+switching+in+vitro.">Analysis of Trypanosoma brucei vsg expression site switching in vitro.</a> Mol Biochem Parasitol. 84 (2), 189-201 (1997).</li><li>Figueiredo, L. M., Janzen, C. J., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+histone+methyltransferase+modulates+antigenic+variation+in+African+trypanosomes.">A histone methyltransferase modulates antigenic variation in African trypanosomes.</a> PLoS Biol. 6 (7), e161 (2008).</li><li>Boothroyd, C. E., Dreesen, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast-endonuclease-generated+DNA+break+induces+antigenic+switching+in+Trypanosoma+brucei.">A yeast-endonuclease-generated DNA break induces antigenic switching in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 459 (7244), 278-281 (2009).</li><li>Engstler, M., Pfohl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+Flow-Mediated+Protein+Sorting+on+the+Cell+Surface+of+Trypanosomes.">Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes.</a> Cell. 131 (3), 505-515 (2007).</li><li>Mugnier, M. R., Cross, G. A. M., Papavasiliou, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+dynamics+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei.">The in vivo dynamics of antigenic variation in Trypanosoma brucei.</a> Science. 347 (6229), 1470-1473 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

وفيما يتعلق تقنية تجريبية، وأهم عنصر من البروتوكول هو الحفاظ على جميع العينات البرد. المثقبيات استيعاب بسرعة كبيرة الأجسام المضادة بد أن سطحها 9، ولكن هذه العملية هو الحركة التي تعتمد، ولا تؤثر على فحص طالما يتم الاحتفاظ الخلايا في 4 درجات مئوية. وينبغي دائما أن تبقى جميع العينات على الجليد، وينبغي أن يتم pipetting لبسرعة للحد من التعرض إلى 25 ° C بيئة المختبر. يجب أن تكون باردة HMI-9 مع المصل متوفر في بداية التجربة ويجب أن تبقى على الجليد طوال الوقت. ويجب أن يتم بمعزل عن المثقبيات عن طريق تشغيل بينهم أكثر من العمود في غرفة باردة، لأنه يأخذ 5-7 دقيقة لتشغيل عينة 1 مل من خلال العمود. إذا كان هناك مزيد من العينات من وحدات الفصل المغناطيسي المتاحة، والعزلة المغناطيسي يمكن القيام به في تسلسل، طالما يتم الاحتفاظ العينات لا يتم فصل بنشاط على الجليد. ومن الأهمية بمكان أيضا أن العينات تكون جيدا بالعربية مختلطةثالثا غسل الماضي بعد الحضانة مع ميكروبيدات وقبل العزلة على مغناطيس. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق عبها العدواني للأنبوب الطرد المركزي أو vortexing لضوء. لا بيليه أو كتل من الخلايا يجب أن تكون واضحة قبل إضافة العينة إلى عمود الفصل، والتي يمكن التحقق من خلال النظر في مستوى المجهر الضوئي. إذا كتل موجودة، ومستوى التلوث في العينة التدفق من خلال الخلايا معربا عن VSG المهيمن عادة ما يكون أعلى بكثير مما هو مطلوب. عند تنفيذ العملية الحسابية لعدد من المحولات في العينة في نهاية البروتوكول، فمن المهم أن نأخذ في الاعتبار ما إذا كان استخدام كافة التدفق من خلال لتحليل تدفق cytometric، أو ما إذا كان يستخدم نصف. إذا تم استخدام نصف فقط، يجب أن تضاعف إجمالي عدد المحولات تحسب بنسبة 2. عند إزالة طاف خلال خطوات غسل، فإنه ليس من الضروري ماصة من كل قطرة الماضي، وعادة 15-25 ميكرولتر همغادر المحيطة بيليه من الخلايا. هذا أمر بالغ الأهمية خصوصا خلال المراحل النهائية من تلطيخ والغسيل، لأنه في هذه المرحلة نادرا ما ينظر إلى الكريات في عينات التدفق من خلال لأن هناك عدد قليل جدا من تحول الخلايا. بينما عادة ما يتم تنفيذ وصمة عار مكافحة VSG النهائية مع النقى المسمى fluorophore مكافحة VSG الأجسام المضادة، وهي أول وصمة عار مكافحة VSG قبل العزلة المغناطيسية يمكن القيام به مع الأجسام المضادة النقي أو المصل. وقد استخدمنا أيضا طاف مفاعل حيوي مشتق من الهجينة معربا عن أضداد VSG. بغض النظر، والمواد المستخدمة لوصمة عار الأولية يجب أن تكون معاير لضمان فصل جيد من الخلايا التي تفعل أو لا تعبر عن السائد، VSG البدء. ومن المعتاد بالنسبة للسكان من الخلايا في التدفق من خلال أن تكون ملوثة بخلايا معربا عن VSG المهيمن. في حين أن هذا التلوث يجب أن يكون الحد الأدنى، في تجربتنا أنه من النادر للسكان أن يكون خاليا تماما من الخلايا التعبيرجي في VSG المهيمن. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن الخلايا التي مرت على إجراء العزل لا وصمة عار كما الزاهية مع مكافحة VSG الأجسام المضادة لتلك التي لم تكن من خلال هذا الإجراء. نحن نفترض أن شيئين يمكن أن تفسر هذا الاختلاف. الأول هو أن الغزل المثقبيات يؤدي إلى سفك VSG، وهناك العديد من يدور يشارك في إجراء العزل. ومن المتوقع هذا للتقليل من شدة إشارة لوصمة عار مكافحة VSG النهائية. والثاني هو أن الخطوة الأولى من البروتوكول ينطوي تلطيخ مع الأجسام المضادة لمكافحة VSG الأساسي. إذا كان الحواتم معترف بها من قبل الأجسام المضادة المستخدمة في هذه الخطوة الأولى هي نفس أو تسد الحواتم معترف بها من قبل الأجسام المضادة في وصمة عار النهائية، يتوقع المرء من شدة إشارة إلى أن تكون أقل مما لو استخدمت الأجسام المضادة واحد فقط. لهذا السبب من المهم أن يعاير الأجسام المضادة التي يتم استخدامها في الخطوة النهائية، بحيث الإشارة من خلية الملون بشكل إيجابي هو ما يقرب من اثنينأوامر من حجم أعلى من خلية ملطخة سلبا. بهذه الطريقة، حتى لو انخفضت كثافة إشارة من خلية تلطيخ إيجابيا في الخلايا التي خضعت لإجراء العزل، وهذه الخلايا إيجابية ستظل فصل جيد من الخلايا سلبية على مؤامرة التدفق الخلوي. إذا كان يتم استخدامها لصناعة السيارات في التعويض، ينبغي إعداد عينات السيطرة وصمة عار واحدة. متاحة للشراء من منشأة الأجسام المضادة سلون مركز التذكاري للسرطان monocolonal الأجسام المضادة التي كنا قد ولدت. لقد كان لدينا أفضل نجاح باستخدام الخالي من الملصقات وحيدة النسيلة مفتش الأضداد. وقد قمنا بتنفيذ بروتوكول مع الأجسام المضادة VSG بولكلونل، ولكن يمكن أن الأجسام المضادة تعترف أحيانا VSGs البعض يفضل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ذلك. هوية VSG يمكن تحديد كدنا] تسلسل VSG الناتجة عن التضخيم من متواليات المحفوظة في VSG 3&#39;UTR وزعيم تقسم. والأجسام المضادة خاص يمكن اختبارها للخصوصية في السابق معزولة تحولوقد تم تحديد الخلايا الذي هو هوية VSG كما هو موضح فقط. بروتوكول المعروضة هنا لديها عدد من المزايا. ويمكن استخدامه على حد سواء لعزل المحولات لتحليلها لاحقا وتحديد عدد من المحولات في عدد معين من السكان. فإنه يمكن أيضا أن تستخدم لعزل متغير معين من الفائدة، طالما تتوفر لهذا البديل الأجسام المضادة. ومن الممكن أيضا لتنفيذ هذا البروتوكول باستخدام المثقبيات معزولة عن الحيوانات، شريطة أن خلايا الدم الحمراء وخرج باستخدام الخرز مكافحة Ter119 المغلفة المغناطيسية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. نحن لم اختبار الحد الأدنى لعدد من المثقبيات مطلوب، ولكن نحن نفذت بنجاح بروتوكول باستخدام 2،5-10٬000٬000 المثقبيات من 250 ميكرولتر من الدم. وأخيرا، فإن بروتوكول يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع تحليل التذبذب للحصول على وتيرة التحول في عدد معين من السكان. الإجراء العزلة هو F جداأست، مع 3-4 ساعة من البداية الى النهاية وفقا لعدد من العينات، وبالتالي هو أكثر فعالية من الأساليب السابقة التي تتطلب تحصين مسبق من الفئران أو السلالات المتخصصة التي تحتوي على علامات مقاومة المخدرات. يقتصر أسلوب من حقيقة أن الأجسام المضادة ضد VSG بدءا مطلوبة، ولكن. وبدون هذه الكواشف، قد يكون أسلوب بديل مثل VSG وما يليها اختيار الأنسب لقياس الذي يجري أعرب VSGs في عدد معين من السكان 10.

وطفيلي، المثقبيات البروسية، هو العامل المسبب للأمراض التي تصيب الإنسان (عبر المثقبية البروسية الغامبية والمثقبية البروسية الروديسية) والحيوانات (عبر المثقبية البروسية البروسية) في جميع أنحاء أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى. وينتقل المرض إلى المضيف الثدييات عن طريق اللعاب من ناقلات ذبابة التسي تسي. كل من الإنسان وداء المثقبيات الأفريقي الحيوانية تسبب عبئا اقتصاديا كبيرا في المناطق الموبوءة، وقليلة الأدوية المتاحة أو في مجال التنمية لعلاج إما المرض. فهم آليات التهرب المناعة أمر بالغ الأهمية لتطوير عقاقير لداء المثقبيات. تباين الأنتيجين للكثيفة، سطح البديل البروتين السكري (VSG) معطف الذي يغطي الطفيلي هو إحدى الوسائل الرئيسية التي T. البروسية يتهرب استجابة الأجسام المضادة الثدييات. وجود ما يقرب من 2000 أنواع من الجينات VSG في الجينوم المثقية، ولكن كتب واحد فقط في أي وقت من الأوقات من أحد ~ 15 مورينداتاهيتيانونيمواقع سيون. &quot;التبديل&quot; من VSG أعرب يمكن أن يحدث إما عن طريق نسخ الجين VSG في الموقع التعبير النشط، أو عن طريق تفعيل النسخي من موقع تعبير صامت سابقا (إعادة النظر في 1). على الرغم من الكثير من العمل وقد كرس لفهم الاختلاف الأنتيجين في T. البروسية، والعوامل التي تؤثر على تردد التبديل لا تزال غير مفهومة. تعرقلت الدراسات حتى الآن من حقيقة أنه في حين أن يحدث التحول عشوائيا في المختبر، ترددات التحول منخفضة جدا، بناء على أمر من 1 في حوالي 10 6 خلايا 2. وهذا يجعل من الصعب قياس ما إذا كان إعطاء زيادة عامل أو تنخفض وتيرة التحول، منذ التحول من الصعب كشف في المقام الأول. قبل عام 2009، كانت طرق لعزل المحولات في عدد معين من السكان طويلة وكثيفة العمالة. هذه الركض المثقبيات من خلال الفئران تحصين ضد VSG المهيمن ومن ثم حصاد الخلايا شملتفي اليوم التالي 3، أو عد مئات من الخلايا المناعي 4،5. وتعتمد استراتيجية أخرى في الاختيار لمقاومة المخدرات لعزل المحولات 6. لأن المثقبيات الأفريقي نمت في المختبر يتم عادة تتكون من عدد كبير من السكان معربا عن البديل رئيسي واحد، ويبلغ عدد سكانها أقل بكثير من المحولات التعبير عن المتغيرات بديلة، نشير إلى البديل الرئيسي في هذه الورقة باعتبارها المهيمنة، بدءا VSG. في القيام بذلك، ونحن في أي وسيلة ترغب في الإيحاء بأن هذا البديل الرئيسي لديه لياقة بدنية أكبر من المتغيرات الأخرى في عدد السكان. نحن هنا تصف طريقة التي يمكن قياس موثوق عدد المثقبيات تعبر عن VSG غير المهيمن في عدد معين من السكان في 3-4 ساعة. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لعند واحد يريد التأكد ما إذا كان التلاعب الجيني معين أو العلاج من تعاطي المخدرات يزيد من عدد الخلايا تحولت في عدد السكان. بدلا من تخليص السكان من الخلايا معربا عن افعلminant، بدءا VSG من خلال العقاقير أو عن طريق المناعية، يتم التخلص من هذه الخلايا عن طريق طلاء لهم أولا مع حبات مغناطيسية بالإضافة إلى الأجسام المضادة ضد VSG المهيمن ومن ثم عزلهم على عمود المغناطيسي. السكان تحولت بعد ذلك جمع في التدفق من خلال وملطخة مرة أخرى مع fluorophore المسمى الأجسام المضادة لمكافحة VSG لتحديد الملوثات. ويتحقق الكمي من خلال إضافة عدد محدد من الخرز العد المطلقة على كل عينة بحيث نسبة من الخرز إلى خلايا يمكن تحديد وتستخدم لتحديد عدد من المحولات في عدد السكان 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="644">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">unlabeled anti-VSG antibody</td>
			<td style="width:143px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:167px;">VSG antibody is made in house</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">fluorophore labeled anti-VSG antibody</td>
			<td style="width:143px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:167px;">VSG antibody is made in house</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HMI-9 media</td>
			<td style="width:143px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:167px;">HMI-9 is made in house</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:143px;">BD Pharmingen</td>
			<td>556463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CountBright absolute counting beads</td>
			<td style="width:143px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LD columns</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MACS magnet</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MACS magnetic separator</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">vortex adapter-60</td>
			<td style="width:143px;">ThermoFisher scientific</td>
			<td>AM10014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">flow cytometer</td>
			<td style="width:143px;">Coulter</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">flow cytometer analysis software</td>
			<td style="width:143px;">FloJo</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of trypanosoma brucei variant surface glycoprotein switching by magnetic activated cell sorting and flow cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

تم استخدام أسلوب الموصوفة هنا لإثبات أن فواصل المزدوج حبلا داخل الموقع التعبير VSG زيادة عدد المحولات في عدد سكانها 8. هنا، وتبين لنا نتائج ممثل من سكان المثقبيات التي تم بفعل مماثل لتوليد مزدوج الجديلة في موقع التعبير. قارنا هذه المثقبيات إلى تلك التي لم يحملوا على توليد مزدوج الجديلة. ويبين الشكل 1 تدفق التمثيلي الخلوي المؤامرات من خلايا الامم المتحدة والتي يسببها والتي يسببها التي تم جمعها في التدفق من خلال المغناطيسي خلية تنشيط العمود الفرز. لهذه التجربة خاصة أن VSG بدءا المهيمن VSG2. وتظهر لوحات اليسار مباشرة من الشكل 1A إلى الأمام والجانب مبعثر، والذي يسمح البوابات التي يمكن استخلاصها حول الخرز العد المطلقة والخلايا التي تظهر إلى الأمام والجانب مبعثر التوقيع الذي هو سمة من الخلايا الحية. لاحظ أنه يمكن البواباتيمكن استخلاصها لتشمل المزيد من الخلايا وذلك لأن الخلايا الميتة يمكن القضاء عليها مع PI تلطيخ. ومع ذلك، يجب أن تظل البوابة الشيء نفسه بالنسبة لجميع العينات. لوحات الأيمن من الشكل 1A تظهر فقط تلك الخلايا التي تقع ضمن بوابة &quot;لايف&quot; على لوحات الأيسر. الخلايا التي صمة عار إيجابيا لPI (Q1 و Q2) هي الخلايا الميتة. الخلايا التي صمة عار إيجابيا لVSG المهيمن وسلبا لPI في Q3 والملوثات. الخلايا التي صمة عار سلبا على حد سواء PI وVSG المهيمن في Q4 هي الخلايا الحية التي تحولت. يمكن للمرء أن يلاحظ أن نسبة الملوثات في Q3 أقل عن تلك الخلايا حيث تم يسببها كسر مزدوج الجديلة. ومع ذلك، فإن النسب في Q3 لا يمكن أن تستخدم لتتعرف ما إذا كانت هناك المزيد من المحولات في عدد معين من السكان. ما هي الا من خلال مقارنة نسبة عدد الخلايا في Q4 لعدد من الخرز التي تم جمعها يمكن للمرء أن حساب الترددات التبديل. ويبين الجدول 1 الأرقام التي تم الحصول عليها من فلوقطع الخلوي ث وطريقة لحساب المحولات في المئة في هؤلاء السكان. وقد أجريت هذه الحسابات في 3 عينات بيولوجية للحصول على ترددات التحول لوحظ ظهور في الشكل 1B. مستوى التحول العشوائية في المختبر منخفضة جدا، كما يحسب هنا بمعدل 9.53 × 10 -5، بينما الأمر الذي أدى إلى نتائج كسر في 1-6 × 10 -3 الخلايا التي تحولت إلى VSG غير المهيمن. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54715/54715fig1.jpg" /> الشكل 1. عزل النوعي والكمي للسكان المثقبيات مبدلة. (A) التدفق الخلوي تظهر أجزاء من المثقبيات في جزء التدفق من خلال اتباع مجموعة من غير المحولات-على المغناطيسي خلية تنشيط العمود الفرز. تتم مقارنة مجموعة من الخلايا مع I-SCEI مزدوج الجديلة التي يسببها لمجموعة من الخلايا دون الف يسببهاحزب العدالة والتنمية. (ب) المحسوبة تبديل الترددات للخلايا التي لديها أو لم يسببها مع I-SCEI كسر المزدوج تقطعت بهم السبل. الرقم على مؤامرة يمثل نتائج الذيل اثنين، اختبار T أونبايريد. أشرطة الخطأ تمثل SD. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54715/54715fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> الملف التكميلي 1. حسابات التدفق الخلوي. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54715/Flow_Cytometry_Calculations.docx" target="_blank">يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.</a> <img alt="الجدول 1" src="/files/ftp_upload/54715/54715tbl1.jpg" /> الجدول 1. حساب ترددات التبديل. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54715/54715tbl1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry at JoVE.com

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

الكشف عن<em&gt; المثقبية البروسية</em&gt; التبديل البديل البروتين السكري السطح بواسطة المغناطيسي خلية المنشط فرز والتدفق الخلوي

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

detection-trypanosoma-brucei-variant-surface-glycoprotein-switching

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

8.7K Views.  Rockefeller University. African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

Video: Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known phenotype.  Other bulk methods of purification include panning, complement depletion and magnetic bead separation.  However, FACS has several advantages over other available methods.  FACS is the preferred method when very high purity of the desired population is required, when the target cell population expresses a very low level of the identifying marker or when cell populations require separation based on differential marker density.  In addition, FACS is the only available purification technique to isolate cells based on internal staining or intracellular protein expression, such as a genetically modified fluorescent protein marker.  FACS allows the purification of individual cells based on size, granularity and fluorescence.  In order to purify cells of interest, they are first stained with fluorescently-tagged monoclonal antibodies (mAb), which recognize specific surface markers on the desired cell population (1).  Negative selection of unstained cells is also possible.  FACS purification requires a flow cytometer with sorting capacity and the appropriate software.  For FACS, cells in suspension are passed as a stream in droplets with each containing a single cell in front of a laser.  The fluorescence detection system detects cells of interest based on predetermined fluorescent parameters of the cells.  The instrument applies a charge to the droplet containing a cell of interest and an electrostatic deflection system facilitates collection of the charged droplets into appropriate collection tubes (2).  The success of staining and thereby sorting depends largely on the selection of the identifying markers and the choice of mAb.  Sorting parameters can be adjusted depending on the requirement of purity and yield.  Although FACS requires specialized equipment and personnel training, it is the method of choice for isolation of highly purified cell populations.

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

For many scientific studies requiring a biological and chemical analysis of cell populations the cells must be in a high state of purity. Fluorescence activated cell sorting (FACS) is a superior method in which to obtain pure cell populations.

تنقية سكان خلية معينة من قبل الإسفار الفرز الخلية المنشط (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate for telomerase for de novo telomere DNA synthesis and is therefore important for telomere maintenance. T. brucei is a protozoan parasite that causes sleeping sickness in humans and nagana in cattle. Once infected mammalian host, T. brucei cell regularly switches its surface antigen to evade the host's immune attack. We have recently demonstrated that the T. brucei telomere structure plays an essential role in regulation of surface antigen gene expression, which is critical for T. brucei pathogenesis. However, T. brucei telomere structure has not been extensively studied due to the limitation of methods for analysis of this specialized structure. We have now successfully adopted the native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension methods for examination of the telomere G-overhang structure and an adaptor ligation method for determination of the telomere terminal nucleotide in T. brucei cells. Here, we will describe the protocols in detail and compare their different advantages and limitations.

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Telomeres are essential for chromosome stability and the telomere G-overhang structure is essential for telomerase-mediated telomere maintenance. We have recently adopted two methods for detecting the telomere G-overhang structure in Trypanosoma brucei, which are native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension, which will be described.

النظر في هيكل G - المتراكمة في التيلومير المثقبية البروسية</em

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

تحليل التدفق الخلوي للخلايا المناعية وفي الفئران Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the T cell receptor (TCR) &alpha; and &beta; loci generates a T cell repertoire with vast diversity in antigen specificity, both to self and foreign. Selection of the repertoire during development in the thymus is critical for generating safe and useful T cells. Defects in thymic selection contribute to the development of autoimmune and immunodeficiency disorders1-4. 
T cell progenitors enter the thymus as double negative (DN) thymocytes that do not express CD4 or CD8 co-receptors. Expression of the &alpha;&beta;TCR and both co-receptors occurs at the double positive (DP) stage. Interaction of the &alpha;&beta;TCR with self-peptide-MHC (pMHC) presented by thymic cells determines the fate of the DP thymocyte. High affinity interactions lead to negative selection and elimination of self-reactive thymocytes. Low affinity interactions result in positive selection and development of CD4 or CD8 single positive (SP) T cells capable of recognizing foreign antigens presented by self-MHC5.
Positive selection can be studied in mice with a polyclonal (wildtype) TCR repertoire by observing the generation of mature T cells. However, they are not ideal for the study of negative selection, which involves deletion of small antigen-specific populations. Many model systems have been used to study negative selection but vary in their ability to recapitulate physiological events6. For example, in vitro stimulation of thymocytes lacks the thymic environment that is intimately involved in selection, while administration of exogenous antigen can lead to non-specific deletion of thymocytes7-9. Currently, the best tools for studying in vivo negative selection are mice that express a transgenic TCR specific for endogenous self-antigen. However, many classical TCR transgenic models are characterized by premature expression of the transgenic TCR&alpha; chain at the DN stage, resulting in premature negative selection. Our lab has developed the HYcd4 model, in which the transgenic HY TCR&alpha; is conditionally expressed at the DP stage, allowing negative selection to occur during the DP to SP transition as occurs in wildtype mice10.
Here, we describe a flow cytometry-based protocol to examine thymic positive and negative selection in the HYcd4 mouse model. While negative selection in HYcd4 mice is highly physiological, these methods can also be applied to other TCR transgenic models. We will also present general strategies for analyzing positive selection in a polyclonal repertoire applicable to any genetically manipulated mice.

We present a flow cytometry-based method to examine T cell development in vivo using genetically manipulated mice on a wildtype or T cell receptor transgenic background.

دراسة التوتة اختيار الإيجابية والسلبية من قياس التدفق الخلوي

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

الكشف عن جسيمات متناهية الصغر نيون التفاعل مع مجموعات سكانية فرعية خلية المناعة الأولية من قبل التدفق الخلوي

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

الإنتاجية العالية جين توصيف في<em&gt; المثقبية البروسية</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

مضان تنشيط الفرز الخليوي لتنقية الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل من الفأر نخاع العظم

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal of immunosuppression. The mixed leukocyte reaction (MLR), limiting dilution assays, and trans-vivo delayed-type hypersensitivity (DTH) assay have all been applied to this question, but these methods have limited predictive ability and/or significant practical limitations that reduce their usefulness. Imaging flow cytometry is a technique that combines the multiparametric quantitative powers of flow cytometry with the imaging capabilities of fluorescent microscopy. We recently made use of an imaging flow cytometry approach to define the proportion of recipient T cells capable of forming mature immune synapses with donor antigen-presenting cells (APCs). Using a well-characterized mouse heart transplant model, we have shown that the frequency of in vitro immune synapses among T-APC membrane contact events strongly predicted allograft outcome in rejection, tolerance, and a situation where transplant survival depends on induced regulatory T cells. The frequency of T-APC contacts increased with T cells from mice during acute rejection and decreased with T cells from mice rendered unresponsive to alloantigen. The addition of regulatory T cells to the in vitro system reduced prolonged T-APC contacts. Critically, this effect was also seen with human polyclonally expanded, naturally occurring regulatory T cells, which are known to control the rejection of human tissues in humanized mouse models. Further development of this approach may allow for a deeper characterization of the alloreactive T-cell compartment in transplant recipients. In the future, further development and evaluation of this method using human cells may form the basis for assays used to select patients for immunosuppression minimization, and it can be used to measure the impact of tolerogenic therapies in the clinic.

This paper describes a method for measuring alloreactivity in a mixed population of T cells using imaging flow cytometry.

قياس T خلية Alloreactivity عن طريق التصوير التدفق الخلوي

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. Setup of a classic multicolor panel requires high-end instruments, custom labeled antibodies, and careful study design to minimize spectral overlap. We developed a multiparametric analysis to identify major human immune populations (CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes) in peripheral blood by combining seven lineage markers using only two fluorochromes. Our strategy is based on the observation that lineage markers are constantly expressed in a unique combination by each cell population. Combining this information with a careful titration of the antibodies allows investigators to record five additional markers, expanding the optical limit of most flow cytometers. Head-to-head comparison demonstrated that the vast majority of immune cell populations in peripheral blood can be characterized with comparable accuracy between our method and the classic &#34;one fluorochrome-one marker approach&#34;, although the latter is still more precise for identifying populations such as NKT cells and &#947;&#948; T cells. Combining seven markers using two fluorochromes allows for the analysis of complex immune cell populations and clinical samples on affordable 6-10 fluorochrome flow cytometers, and even on 2-3 fluorochrome field instruments in areas with limited resources. High-end instruments can also benefit from this approach by using extra fluorochromes to accomplish deeper flow cytometry analysis. This approach is also very well suited for screening several cell populations in the case of clinical samples with limited number of cells.

Here, we present a flow cytometric protocol to identify CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes in human peripheral blood by using only two fluorochromes instead of seven. With this approach, five additional markers can be recorded on most flow cytometers.

التمييز من سبع مجموعات فرعية الخلايا المناعية قبل يومين-fluorochrome التدفق الخلوي

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...