هذا العمل تدعمه أبحاث المعاهد الوطنية للصحة (A1R03AI120027 (RN) و 1R21AI20012 (RN)) ومنح البحوث المؤسسية (RN)، بدء منح (RN)، ومنح البذور MD أندرسون وزارة الجنسية والهجرة (RN).

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة تكساس MD أندرسون في مركز السرطان.
1. إعداد الببتيد للقاح
<ol><li>حل الببتيد المجففة بالتبريد مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) بتركيز مناسب ودوامه لمدة 30 ثانية. ملاحظة: ل hgp10025–33، يكون التركيز النهائي 1 ملغ/مل والبويضات257–264، تركيز النهائي 0.5 ملغ/مل. إعادة تشكيل الببتيد قبل الحقن. لا تقم بتخزين بعد إعادة تشكيل.</li>
</ol>2-عزل سبلينوسيتيس من الماوس المحورة وراثيا
ملاحظة: يجب إجراء عزل الخلية من الطحال بطريقة عقيمة.
<ol><li>
Euthanize الماوس المعدلة وراثيا OT-1 استخدام أسلوب الخنق2 CO المعتمدة وإزالة الطحال. ملاحظة: يستخدم الماوس المعدلة وراثيا ملائمة في هذه الخطوة المحددة ببتيد الاختيار.<ol>
<li>وضع الماوس على الجانب الأيمن. رذاذ الجانب الأيسر للماوس مع 70% إيثانول (EtOH). سحب الجلد باستخدام الملقط، وقطع الجلد باستخدام مقص الجراحية؛ ستكون مرئية داخل التجويف الصفاقى الطحال. بلطف قص فتح التجويف الصفاقى الوصول إلى الطحال. إزالة الطحال باستخدام الملقط.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
تصنيف الطحال بوضعه في عامل تصفية 70 ميكرومتر في طبق بتري مع متوسط 2 مل (برنامج تلفزيوني مع 1% مصل بقرى الجنين (FBS)) وتحطيم الطحال مع نهاية المكبس.
	<ol>
<li>جمع في سبلينوسيتيس من صحن بيتري ومكان في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. أغسل صحن بيتري مع 5 مل متوسطة مرتين إلى جمع كافة الخلايا. إضافة المتوسطة يصل إلى 25 مل والطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في 475 x ز.</li>
	</ol>
</li>
	<li>نضح الخلايا وريسوسبيند في 1 مل/لكل المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) الطحال. احتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 إضافة 10 مل من متوسط وأجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة في غ. س 475 ريسوسبيند بيليه في 10 مل متوسط وإزالة الأنقاض بتصفية تعليق خلية من خلال عامل تصفية 70 ميكرومتر إلى تنظيف 50 مل مخروطية الشكل.</li>
	<li>
حساب عدد الخلايا باستخدام تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير. ريسوسبيند الخلايا في برنامج تلفزيوني لتركيز نهائي 106 -1006 خلايا/مل. للبويضات257–قتل، ريسوسبيند264 محددة في 106 خلايا/مل وعلى hgp100 مما أسفر عن مصرع، ريسوسبيند25–33 محددة في 1006 خلايا/مل.
	<ol>
<li>زيادة ونقصان الخلايا المتبقية في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في 475 x زاي نضح المادة طافية وريسوسبيند في برنامج تلفزيوني الباردة 15 مل لغسل الخلايا. كرر الخطوة يغسل مرة أخرى. زيادة ونقصان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في 475 x زاي نضح المادة طافية وريسوسبيند في برنامج تلفزيوني الباردة وفقا لحجم النهائي تحديد في الخطوة 2، 4.</li>
		<li>نقل تعليق خلية مفردة إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل والحفاظ على الجليد حتى الحقن إلى المستلم C57/BL6 الماوس.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3-حقن سبلينوسيتيس من الفئران المحورة وراثيا
<ol><li>ضع الماوس C57/BL6 المستلم في ريسترينير مع الجانب الظهرية أعلى. رذاذ حقن المنطقة قاعدة الذيل مع كحول الأيزوبروبيل 70%. إدارة 100 ميليلتر من تعليق خلية مفردة (الباب 2) عن طريق الوريد الوريد ذيل باستخدام إبرة ز 27 مع الجانب مجسم مشطوف الحواف متقابلة لأعلى.</li>
</ol>4-كوفاكس الإدارة
ملاحظة: إذا كان يتم حقن الخلايا في فترة ما بعد الظهر، كوبا ينبغي أن تدار في صباح اليوم التالي ضمن ح 18 من حقن الخلايا.
<ol><li>ضع الماوس في مربع تخدير واضحة مع إيسوفلوراني 1-3%. بعد أن يتم تخديره تماما من الفئران، نقل الفئران إلى المخروطات يعلق على المتشعبة في قاعة التخدير. الحفاظ على ضبط النفس مع الجانب الظهرية حتى الفئران. ملاحظة: يؤكد قرصه إصبع قصيرة للتحقق من استجابة انسحاب هو لم تحظ أنيسثيتيزيشن. القانون الاتحادي بتقييد استخدام isoflurane بناء على أمر الطبيب بيطري المرخص لها.</li>
	<li>رذاذ حقن المنطقة قاعدة الذيل مع كحول الأيزوبروبيل 70%. حقن 100 ميليلتر من حل الببتيد (من القسم 1) تحت الجلد باستخدام إبرة ز 27 مع المحاقن اختراق 4-5 مم في منطقة قاعدة الذيل، الجانب المشطوف إبرة مواجهة. ملاحظة: يتم تحصين الفئران في الجناح واحد بالحقن تحت الجلد عند القاعدة الذيل10.</li>
	<li>حقن 100 ميليلتر CD40 مكافحة الأجسام المضادة (0.5 ملغ/مل الأسهم) الجانبي إلى موقع حقن اللقاحات.</li>
	<li>بعناية تطبيق imiquimod كريم 50 ملغ/الماوس على مواقع التطعيم. فرك كريم imiquimod على السطح حتى الكريم لم تعد مرئية ويتم امتصاصه تماما.</li>
	<li>حقن 100 ميليلتر من البروتين رحيل-2 100,000 وحدة دولية/مل إينترابيريتونيلي (القائمة) في منطقة البطن السفلي. مراقبة الفئران لمدة 5 دقائق بعد ما يتعافى تماما من التخدير. ملاحظة: التجربة توقفت عند هذه النقطة لمدة 3 أيام.</li>
</ol>5-عزل سبلينوسيتيس المستهدفة لوضع العلامات مع كفسي
ملاحظة: يجب إجراء عزل الخلية من الطحال بطريقة عقيمة.
<ol><li>Euthanize الفئران C57BL/6 وفقا لأسلوب الخنق2 CO المعتمدة. إزالة spleen(s) كما في الخطوة 2.1.1. تصنيف الطحال وتغسل سبلينوسيتيس كما هو الحال في الخطوات 2.2.1-2.2.3. خلايا الدم الحمراء كما هو الحال في الخطوات 2، 3-2.3.2.</li>
	<li>إزالة الخلايا لعد استخدام هيموسيتوميتير وحساب لتركيز نهائي للخلايا في 106 خلايا/مل في حل كفسي العلامات (كما هو موضح في الخطوة 7). تدور الخلايا المتبقية في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في 475 × المادة زاي أسبيراتي طافية.</li>
</ol>6-الببتيد النبض للهدف سبلينوسيتيس
ملاحظة: الببتيد النبض يجب إجراء بطريقة عقيمة.
<ol><li>ريسوسبيند الخلايا في 106 خلايا/مل في وسائط كاملة (RPMI 1640 وسائل الإعلام مع 10% FBS، 1% لالجلوتامين (L-جلن)، 1% البنسلين/ستربتوميسين (القلم/بكتيريا)). تقسيم الخلايا في أنابيب 2 (15 مل كونيكالس). قم بتسمية كل أنبوبة كنابض أو أونبولسيد.</li>
	<li>
إضافة الببتيد إلى الأنبوبة المسماة نابض. للبويضات257–264 النبض، إضافة 1 ميكروغرام/مل و hgp10025–33 النبض، إضافة 2 ميكروغرام/مل. ملاحظة: تخضع الخلايا أونبولسيد في الحضانة نفسها كخلايا نابض فقط دون إضافة الببتيد.<ol>
<li>احتضان خلايا + الببتيد في 37 درجة مئوية ح 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إضافة 10 مل وسائط كاملة (RPMI 1640 وسائل الإعلام مع 10% FBS، 1% L-الجلوتامين (L-جلن)، 1% البنسلين/ستربتوميسين (القلم/بكتيريا)) لكل أنبوبة لغسل كل نابض وأونبولسيد الخلايا المستهدفة. تدور الخلايا المتبقية في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في 475 × المادة زاي أسبيراتي طافية.</li>
</ol>7-إعداد كفسي لوسم سبلينوسيتيس الهدف
<ol><li>
تعد العلامات كفسي الحل خلال الخلية الغسيل في خطوة 6.3؛ سوف يكون المسمى الخلايا نابض كفسيمرحبا وأونبولسيد ككفسيلو. إعداد 1 مل من محلول وسم كفسي 106 خلايا. ملاحظة: كفسي هي حساسة للضوء، وينبغي أن تكون محمية من الضوء في جميع الأوقات.<ol>
<li>إعداد كفسيمرحبا -تسمية الوسائط بإضافة 1 ماي/مل كفسي (حل الأسهم 5 مم) لتركيز نهائي من 5 ميكرومتر/مل في الإعلام RPMI 1640 مع 2% FBS.</li>
		<li>إعداد كفسيلو -وسم وسائل الإعلام عن طريق إضافة 1 ماي/مل كفسي (0.5 مم حل الأسهم) لتركيز نهائي من 0.5 ميكرومتر/مل ربمي الوسائط 1640 مع 2% FBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8-وضع العلامات للهدف سبلينوسيتيس مع كفسي
ملاحظة: الوسم كفسي يجب إجراء بطريقة عقيمة.
<ol><li>ريسوسبيند الخلايا الهدف نابض وأونبولسيد (من الخطوة 6.3) في 106 خلايا/مل كفسي تسمية الوسائط. ريسوسبيند الخلايا نابض مع استعداد كفسيمرحبا-تسمية الوسائط والخلايا أونبولسيد مع إعداد كفسيلو-وصف وسائل الإعلام.</li>
	<li>مزيج الخلايا والعلامات كفسي وسائل الإعلام بانعكاس لطيف أو دوامات. لا تخلط فورتيكسينج. احتضان خلايا والعلامات كفسي وسائل الإعلام في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 15 ريمكس الخلايا كل 5 دقائق.</li>
	<li>إضافة 10 مل من وسائل الإعلام كاملة لكل الخلايا خلية تعليق وتدور في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في غ س 475.</li>
	<li>نضح المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في برنامج تلفزيوني الباردة 10 مل. تدور الخلايا عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في 475 x ز.</li>
	<li>كرر الخطوة 8، 4.</li>
	<li>عد الخلايا ومزيج الببتيد-نابض، كفسيمرحبا-المسمى مع أونبولسيد، كفسيلو-تسمية الخلايا بنسبة 1:1 للحقن في الفئران المستفيدة. الاحتفاظ قاسمة 1 × 106 مختلطة الخلايا استخدامها لتقييم خط أساس تدفق الخلوي (المادة 11). ملاحظة: هو الحجم النهائي لحقن 100 ميليلتر للماوس. العد النهائي خلية من خلايا 10e6. يجب أن يؤخذ في الاعتبار فقدان وحدة التخزين في المحاقن والإبر وينبغي أن تكون المقدرة بمبلغ 500 ميليلتر.</li>
</ol>9-الحقن بالخلايا الهدف
ملاحظة: الاحتفاظ الخلايا المسماة كفسي محمية من الضوء قبل وأثناء الحقن بقدر الإمكان.
<ol><li>ضع المتلقية الفئران C57BL/6 في ريسترينير مع الجانب الظهرية أعلى. رذاذ حقن المنطقة قاعدة الذيل مع كحول الأيزوبروبيل 70%. إدارة 100 ميليلتر من تعليق خلية واحدة فقط عن طريق الوريد الوريد الذيل مع الجانب مجسم مشطوف الحواف متقابلة لأعلى.</li>
</ol>10-إعادة عزل الخلايا الهدف
ملاحظة: توقيت هذه الخطوة الحاسمة وتعتمد على سيتوتوكسيسيتي CTL وقوة مستضد التحفيز. تقييم لقتل البويضات257–264 هدف النبضي، يلزم الخلايا المقطوع 4-6 ح بعد الحقن. حيث تكون الخلايا المسماة كفسي الطحال الحساسة، وعملية الضوء في الظلام.
<ol><li>Euthanize الفئران C57BL/6 المستفيدة وفقا لطريقة الخنق2 CO المعتمدة.</li>
	<li>إزالة spleen(s) كما في الخطوة 2.1.1. تصنيف الطحال وتغسل سبلينوسيتيس كما هو الحال في الخطوات 2.2.1-2.2.3. خلايا الدم الحمراء كما هو الحال في الخطوات 2، 3-2.3.2.</li>
	<li>ريسوسبيند الخلايا في 1 مل fluorescence تنشيط الخلية الفرز المخزن المؤقت (الأصول) (1% جيش صرب البوسنة + برنامج تلفزيوني) للتقييم بالتدفق الخلوي.</li>
</ol>11-النابضة المنطق لتحديد نشاط CTL بالتدفق الخلوي
<ol><li>
إجراء تقييم لنشاط CTL باستخدام بروتوكول قياسي تدفق الخلوي. الحصول على الخلايا باستخدام قناة فيتك في سيتوميتير تدفق مع ليزر 488 نانومتر للإثارة11.
	<ol>
<li>بوابة على العيش لمفاوية استخدام معلمات مبعثر (SSC) الجانب مقابل المبعثر إلى الأمام (FSC). سوبجيت داخل بوابة اللمفاويات الحية لمجموع السكان كفسي إيجابية. ملاحظة: حقن الخلايا المسماة كفسي سوف يشكلون مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا اللمفية الإجمالي الحالي في الطحال. يجب أن تظهر الخلايا إيجابية كسفي اثنين من السكان متميزة بمقياس سجل.</li>
		<li>استخدام تنسيق الرسم بياني لتحديد النسبة المئوية من أونبولسيد (اليسار الذروة، كفسيلو) ونابض (حق الذروة، كفسيمرحبا) السكان. فقدان كفسيمرحبا الخلايا يشير إلى نشاط CTL مستضد على حدة.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+quantification+of+T+cell-mediated+cytotoxicity+using+cell-permeable+fluorogenic+caspase+substrates.">Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates.</a> Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).</li><li>Wherry, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+relationship+and+protective+immunity+of+memory+CD8+T+cell+subsets.">Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets.</a> Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+flow+cytometry-based+cytotoxic+T-lymphocyte+assay+through+detection+of+cleaved+caspase+3+in+target+cells.">A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells.</a> J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).</li><li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells.">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).</li><li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescent+target+arrays+for+assessment+of+T+cell+responses+in+vivo.">The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo.</a> J Vis Exp. (88), e51627 (2014).</li><li>Johansson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+education+in+mice+with+single+or+multiple+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules.">Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules.</a> J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).</li><li>Hailemichael, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+antigen+at+vaccination+sites+induces+tumor-specific+CD8(+)+T+cell+sequestration,+dysfunction+and+deletion.">Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion.</a> Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).</li><li>Overwijk, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+regression+and+autoimmunity+after+reversal+of+a+functionally+tolerant+state+of+self-reactive+CD8++T+cells.">Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells.</a> J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).</li><li>Cho, H. I., Celis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+peptide+vaccines+eliciting+extensive+CD8+T-cell+responses+with+therapeutic+antitumor+effects.">Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects.</a> Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).</li><li>Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+for+pre-clinical+study+of+human+cancer+immunotherapy.">Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy.</a> Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li><li>Durward, M., Harms, J., Splitter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+specific+killing+assay+using+CFSE+labeled+target+cells.">Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

في حين أن هذا البروتوكول مباشرة، وهناك بعض الخطوات الحاسمة التي يجب أن يتم بعناية. فتيلة كوبا عقب حقن محددة مستضد تي-خلية يجري اختبار ضروري لمعرفة أي قتل الأهداف نابض. وفي حين أنه من الممكن أن التطعيم ضد كوبا المستندة إلى الماء يخلق حالة التهابات حادة، لمرحلة التهاب مزمن، الاستعاضة عن وضع المياه على أساس قصير الأجل مع نهج القائم على النفط مستضد بطء الإفراج قد تنتج أفضل نتائج7،12.
وبالإضافة إلى ذلك، كفسي تسمية الخلايا المستهدفة بعد مستضد النبض يجب أن يكون موحدا لقراءات قياس تدفق مثالي. تم العثور على العلامات كفسيمرحبا مع 5 ميكرومتر وكفسيلو مع 0.5 ميكرومتر يكون مثاليا في هذا النظام لتوفير سجل فرق في المجموعات السكانية التي يمكن تمييزها بسهولة.
هذا البروتوكول بسيط لتعديل نظام مستضد محدد يجري اختبارها. أولاً، ينبغي تأكيد تركيز الببتيد تدار كجزء من كوبا. هو طريقة بسيطة لتحديد هذا التركيز المناسب تلقيح وتتبع التوسع في خلايا تي محددة مستضد وحقن الدم. في هذه الحالة، يتطلب مستضد ضعيفة (hgp10025-33) ضعفي الببتيد مستضد قوية (257–البويضات264). تم التحقق من صحتها التركيزات المستخدمة في هذا البروتوكول سيكون نقطة انطلاق معقولة لاختبار مولدات أخرى تستند إلى قوة التحفيز. وسيكون نقطة واحدة للتعديل لتحصين ببساطة الماوس البرية من نوع مع مستضد الاهتمام تليها الببتيد نابض أهدافا لتقييم دالة CTL. غير أن هذا التعديل سوف تعتمد على تنشيط وتوسيع نطاق الاستجابات محددة مستضد الذاتية وحتى توقيت نقل الخلية الهدف سيحتاج يرجح أن تحدث 7-14 يوما بعد التحصين. وباﻹضافة إلى ذلك، قتل محددة مستضد قد كثيرا خفض المستوى ومقارنة بمراعاتها عند نقل الخلايا المحورة وراثيا. تحذير مع هذا التعديل أن مستوى استجابة CTL للهدف قد يكون منخفض جداً الكشف عنها.
بالإضافة إلى مقدار مستضد المطلوبة فتيلة تي خلية، يجب أن يكون توقيت إعادة عزل الخلايا المسماة كفسي الهدف الأمثل لفرضية معينة. تعديلات ليجري تي خلية اختبار تلك النتيجة في فرق قتل قدرات قد تتطلب تعديلات في التوقيت إعادة العزلة. تي خلية مع دالة قتل المحسن ستحتاج إلى أهداف تقييم أسرع بكثير من نظيرتها البرية من نوع. وينبغي استكشاف هذه الشخصية الحركية بعناية لتحديد تيميبوينت الأمثل للتصدي لاختبار الفرضية. بشكل عام، وقد وجدنا هذا تتفاوت بين 4 و 24 ساعة بعد حقن الخلايا المستهدفة.
واحد الحد من المقايسة أن خلايا المستجيب لا تحفز مزمن للحث على إقامة دولة منهكة. ولذلك، الدالة CTL مقيد إلى خلايا المستجيب تفعيلها مؤخرا. فمن الممكن أن يمكن تعديل هذا الأسلوب لتقييم دالة استدعاء قدرة السكان أو قتل الذاكرة من مجموعة فرعية، مزمن تنشيط خلية T حدة مستضد التي ستكون مثيرة للاهتمام لتطبيقات في المستقبل.
يسمح هذا الأسلوب لاختبار CTL الدالة في فيفو للكشف السريع في فيفو قتل أن يتغلب على بعض أوجه القصور في في المختبر وضع. نظام المناعة سليمة في مكان وفتيلة الخلايا T المنقولة عبر طريقة كوبا تعتمد على العرض الببتيد والتحفيز المشارك بخلايا مستضد تقديم الذاتية. خلافا لغيرها في فيفو قتل فحوصات، لا يتطلب هذا الأسلوب بعدوى أو وجود ورم هدفا. ومع ذلك، إضافة هدفا الورم سيتيح المقارنة إضافية ويمكن أن يضاف إلى الفحص قبل حقن الخلايا T مستضد على حدة والإدارة كوبا للتطبيقات المستقبلية لهذا الأسلوب.

توجد بروتوكولات متعددة تقييم إمكانات CD8 (CTL) عن+ أو خلايا CD4+ تي خلية. يمكن أن يتم هذا التقييم سهولة في المختبر تحت ظروف خاضعة للرقابة1،،من23. وبالإضافة إلى ذلك، نماذج الأمراض المعدية، مثل لكمف، درست كلاسيكي CTL وظيفة عن طريق استخدام خلطات كفسي (إستر سوكسينيميديل اسيتات-(and 6) 5-كاربوكسيفلوريسسين) المسماة الخلايا المستهدفة حيث كفسيمرحبا-الخلايا المسماة نابض الببتيد وكفسيلو-المسمى المستهدفة يتم ترك الخلايا أونبولسيد. الخلايا ثم حقنها بنسبة 1:1 وتقييم للخسائر كفسيمرحبا-وصفت الأهداف نابض بالتدفق الخلوي4. واستخدمت نماذج اللقاح ورفض أيضا استراتيجيات مماثلة لتقييم في فيفو قتل بكلا CD8+ وخلايا CD4 خلايا+ T، فضلا عن ناغورني كاراباخ الخلايا5،6. هذا هو مقايسة قوية، ولكن يتطلب استخدام العوامل المعدية رئيس الجهاز المناعي قبل الحقن المستهدف.
هذا البروتوكول، من ناحية أخرى، يتطلب أي عدوى مسبقة من البلد المضيف، ويستخدم بدلاً من ذلك استراتيجية تطعيم رئيس الجهاز المناعي قبل الحقن المستهدف. يتكون هذا التطعيم من وضع المياه على أساس لقاح الببتيد الذي يتطلب توفير immunostimulatory كوكتيل دعا كوبا7، تتألف من مستقبلات مثل عدد القتلى 7 (TLR7) مؤثر (إيميقويمود كريم)، ومكافحة-CD40 ناهضة الأجسام المضادة، و interleukin-2 (إيل-2) مما يؤدي إلى التآزري مزيج من العوامل إيمونوستيمولاتوري للاستثارة فتيلة محددة الببتيد واستجابة مناعية قوية. على هذا النحو، يوفر هذا التحليل قراءات سريعة للدالة CTL كما تدار اللقاح جنبا إلى جنب مع الخلايا لتقييم الدالة إلا ثلاثة أيام قبل حقن الخلايا المستهدفة. وباﻹضافة إلى ذلك، فتيلة كوبا قوية بما يكفي أن قدرة قتل الخلية تي محددة مستضد معبي يمكن أن يرى بين ح 4 و 24 بعد الحقن.
هو تحديد القيد الرئيسي لهذا البروتوكول الجدول الزمني في فيفو للكشف عن القتل المستهدف غير الملائمة إلى antigen والفرضية يجري اختبارها. يجب إجراء تقييم دقيق، كالتغيرات في قوام مستضد، فضلا عن التعديلات الوراثية يجري اختبارها في خلايا تي يمكن أن يؤدي وظيفة CTL التفاضلية التي تتطلب الكشف عن توقيت مختلف للقتل المستهدف. وبالإضافة إلى ذلك، في حين تركيز مناسب من الببتيد للتلقيح قد تم الأمثل لسرطان الجلد البشرية مستضد glycopeptide 100 (hgp10025-33) و ovalbumin257-264 (البويضات257-264)8،9 ، استخدام نموذج مستضد آخر قد يكون أكثر ملاءمة لدراسة معينة تتطلب مزيدا من التحقق من الصحة. بسبب الاختلافات المتوقعة في المستضدات المستهدفة القدرة على حفز CTL المستجيب الدالة في تركيبة مع كوبا وصفها adjuvant، قد يكون الأمثل لايل-2 جرعة التركيز والجرعة التردد ضروري لتحقيق الهدف المنشود. وعموما، هذا البروتوكول يسمح بإجراء تقييم سريع لقتل الدالة في فيفو ويمكن تكييفها مع أي مستضد معين.

<table style="border-collapse:collapse;width:523pt" width="697">
	<colgroup>
		<col style="width:199pt" width="265" />
		<col style="width:110pt" width="146" />
		<col style="width:89pt" width="119" />
		<col style="width:125pt" width="167" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">6- to 12-week old female C57BL/6 mice&#160;</td>
			<td class="xl69" style="width:110pt" width="146">Charles River</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">027</td>
			<td style="width:125pt" width="167">C57 Black 6 mice</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">OT-1 6-12-week old female mice&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Jackson Labs</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">003831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24" style="height:18.0pt">
			<td height="24" style="height:18.0pt">hgp10025&#8211;33&#160;</td>
			<td class="xl69">CPCScientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">834139</td>
			<td>KVPRNQDWL</td>
		</tr>
		<tr height="24" style="height:18.0pt">
			<td height="24" style="height:18.0pt">OVA 257&#8211;264&#160;</td>
			<td class="xl69">CPCScientific</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">MISC-012</td>
			<td>SIINFEKL</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">Imiquimod cream 5%&#160;</td>
			<td class="xl69">Fougera</td>
			<td class="xl73">51672-4145-6</td>
			<td>Aldara Cream</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">CD40-specific mAb&#160;</td>
			<td class="xl69">BioXcell</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">BE0016-2</td>
			<td>clone FGK4.5</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">rhIL-2 protein&#160;</td>
			<td class="xl69">Hoffman LaRoche Inc</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">136</td>
			<td>Recombinant human IL-2 protein</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">70% isopropyl alcohol Prep&#160;</td>
			<td class="xl69">Kendall</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">S-17474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td height="20" style="height:15.0pt">PBS</td>
			<td class="xl69">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">10010-023</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">FBS</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">26140-079</td>
			<td>fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">RBC lysis buffer&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">A10492-01</td>
			<td>red blood cell lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">RPMI 1640 Media</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">L-Glutamine&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">Pen/Strep</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">15140122</td>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">CFSE</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">C34554</td>
			<td>5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Sigma&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">1.5 mL MCT graduated natural&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Fisher</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">05-408-129</td>
			<td>microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">70% ethanol</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Fisher</td>
			<td class="xl73">BP8201500</td>
			<td>EtOH</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">Trypan blue solution, 0.4%&#160;&#160;</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Life Technologies</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">Hemocytometer</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">Fisher</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">27 gauge needle</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">BD</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl71" height="20" style="width:199pt;height:15.0pt" width="265">1 mL syringe</td>
			<td class="xl70" style="width:110pt" width="146">BD</td>
			<td class="xl70" style="width:89pt" width="119">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo assay for detection of antigen-specific t-cell cytolytic function using a vaccination model

المنهجيات الحالية لقتل محددة مستضد محدودة للاستخدام في المختبر أو تستخدم في نماذج الأمراض المعدية. ومع ذلك، هناك لا بروتوكول خصيصا لقياس محددة مستضد القتل دون عدوى. تم تصميم هذا البروتوكول ويصف أساليب للتغلب على هذه القيود بالسماح للكشف عن حدة مستضد قتل الخلية المستهدفة واسطة CD8+ تي الخلايا في فيفو. ويتم ذلك عن طريق دمج نموذج تطعيم بهدف المسمى كفسي تقليدية مما أسفر عن مصرع المقايسة. يسمح هذا المزيج الباحث لتقييم إمكانات CTL محددة مستضد مباشرة وبسرعة كما المقايسة لا يتوقف على نمو الورم أو الإصابة. وبالإضافة إلى ذلك، قراءات يرتكز على التدفق الخلوي وهكذا ينبغي أن تكون متاحة لمعظم الباحثين. يتم تحديد القيد الرئيسي للدراسة المخطط الزمني في فيفو غير الملائمة إلى الفرضية يجري اختبارها. الاختلافات في قوة مستضد والطفرات في خلايا تي التي قد تسفر عن الدالة عن فرق بحاجة إلى أن يقيم بعناية لتحديد الوقت الأمثل للحصاد الخلية والتقييم. وقد تم تحسين تركيز مناسب من الببتيد للتطعيم hgp10025-33 والبويضات257-264، ولكن كذلك أنه يلزم التحقق من الصحة الببتيدات الأخرى التي قد تكون أكثر ملاءمة لدراسة معينة. وعموما، هذا البروتوكول يسمح بتقييم سريع لقتل الدالة في فيفو ويمكن تكييفها مع أي مستضد معين.

قبل حقن الخلايا المسماة كفسي المستهدفة، يتم تشغيل الخليط خلية 1:1 على سيتوميتير تدفق لتحديد الترددات الأساس وعلى السواء كفسيمرحبا كفسيلو الخلايا المستهدفة. الشكل 1 A يوضح استراتيجية النابضة للكشف عن التغيرات في السكان كفسي، بوابة أولية باستخدام معلمات منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب. ثم يتم سوبجاتيد مجموع الخلايا كفسي الإيجابية قبل تقييم التغيرات في التردد، كما هذا السكان صغيرة نسبيا بالمقارنة مع سبلينوسيتيس الذاتية غير مسمى. التواتر النسبي كفسيمرحبا كفسيلو السكان وهو المحسوب بتحديد مجموع السكان كفسي إيجابية 100%. هذا التحليل يمكن أن يتم استخدام تنسيق ارسم المدرج التكراري أو نقطة. ويرد مثال على التواتر النسبي للسكان كفسي قبل الحقن في الشكل 1ب. هذه النسبة نادراً ما سيكون بالضبط 1:1 ولكن ينبغي أن تكون معقولة إغلاق. ضرورة فتيلة كوبا يرد في الشكل 1ج حيث لا قتل antigen نابض، يلاحظ كفسيمرحبا الخلايا المستهدفة في 24 ساعة بعد الحقن. الشكل 1 يوضح د قتل الفعال للمستضد نابض، كفسيمرحبا-وصفت الخلايا المستهدفة كما الذروة الذي لوحظ قبل الحقن تقريبا غير مكتشفة وتحول النسبة كبيرة من 50% للكشف عن 1%. ويوضح الشكل أيضا حركية مستضد نابض، كفسيمرحبا-المسمى قتل الخلية المستهدفة بتقييم الخسائر في هذه الفئة من السكان في ح 6 و 24 ساعة بعد الحقن.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56255/56255fig1.jpg"> رقم 1: مقارنة بين الخلايا المسماة في الأساس وبعد حقن الخلايا الهدف المسمى كفسي. (أ) يظهر استراتيجية النابضة لتقييم دالة CTL. باختصار، هي بوابات لمفاوية يعيش استخدام مبعثر إلى الأمام (FSC) مقابل الجانب مبعثر (SSC) معلمات. يتم سوبجاتيد مجموع كسفي-إيجابية الخلايا داخل بوابة الخلية الحية. نسبة كفسيمرحبا وكفسيلو يستند على تواترها كل منهما ضمن مجموع كفسي إيجابية. كفسي التالية (ب) وضع العلامات، تمتزج 1:1 الخلايا الهدف وتقييم لنسبة كفسيمرحبا ولو الخلايا كفسي بالتدفق الخلوي. الأرقام تشير إلى تردد قمم كل منهما في كل من الرسم بياني (يسار) ومقابل كفسي SSC دوت الأرض تنسيقات (يمين). (ج) وهذا يدل على عدم وجود الخلايا الهدف قتل دون التطعيم السابقة مع نظام كوبا. وكانت سبلينوسيتيس المقطوع 24 ساعة بعد الحقن. (د) وهذا يدل على قتل نابض مستضد كفسيمرحبا الخلايا الهدف في ح 6 (أعلى الرسوم البيانية) وآخر 24 ساعة (أسفل الرسوم البيانية) الحقن. الأرقام تشير إلى تواتر قمم المسمى كفسي على كلا من الرسم البياني (يسار) ومقابل كفسي SSC دوت ارسم الشكل (يمين). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56255/56255fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model at JoVE.com

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

والهدف من هذا البروتوكول هو السماح للكشف عن في فيفو قتل الخلية المستهدفة في نموذج مورين مستضد على حدة.

في فيفو الفحص للكشف عن وظيفة محددة مستضد تي خلية عن استخدام نموذج التطعيم

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

in-vivo-assay-for-detection-antigen-specific-t-cell-cytolytic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

9.8K Views.  University of Texas MD Anderson Cancer Center. والهدف من هذا البروتوكول هو السماح للكشف عن في فيفو قتل الخلية المستهدفة في نموذج مورين مستضد على حدة.

Video: In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation. This labeling has classically been used to study proliferation and migration. In the method presented here, we have shortened the timeline after adoptive transfer to look at survival and killing of epitope specific CFSE labeled target cells4-6. The level of specific killing of a CD8 + T cell clone can indicate the quality of the response, as their quantity may be misleading. Specific CD8+ T cells can become functionally exhausted over time with a decline in cytokine production and killing7,8. Also, certain CD8 + T cell clones may not kill as well as others with differing TCR specificities9. For effective Cell Mediated Immunity (CMI), antigens must be identified that produce not only adequate numbers of responding T cells, but also functionally robust responding T cells. Here we assess the percent cell specific killing of two peptide specific T cell clones in BALB/c mice.

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Many infections elicit a strong CTL response, but occasionally, the quantity of responding cells does not correlate to control of the pathogen1. One measure of CTL quality is their ability to kill specifically2. CFSE labeling of target cells can be used to investigate this CTL response quality in vivo3,4.

مستضد محددة في فيفو الفحص باستخدام خلايا القتل المستهدف CFSE إعتبر

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

تحريض الطعم ضد المضيف المرض و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; مراقبة الخلايا T باستخدام نموذج MHC المطابقة الفئران

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Trans-vivo Delayed Type Hypersensitivity Assay for Antigen Specific Regulation

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host immune system has experienced in the recent past. DTH reactions are often divided into a sensitization phase, referring to the initial antigen experience, and a challenge phase, which usually follows several days after sensitization. The lack of a delayed-type hypersensitivity response to a recall Ag demonstrated by skin testing is often regarded as an evidence of anergy. The traditional DTH assay has been effectively used in diagnosing many microbial infections.
Despite sharing similar immune features such as lymphocyte infiltration, edema, and tissue necrosis, the direct DTH is not a feasible diagnostic technique in transplant patients because of the possibility of direct injection resulting in sensitization to donor antigens and graft loss. To avoid this problem, the human-to-mouse "trans-vivo" DTH assay was developed 1,2. This test is essentially a transfer DTH assay, in which human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and specific antigens were injected subcutaneously into the pinnae or footpad of a na&iuml;ve mouse and DTH-like swelling is measured after 18-24 hr 3. The antigen presentation by human antigen presenting cells such as macrophages or DCs to T cells in highly vascular mouse tissue triggers the inflammatory cascade and attracts mouse immune cells resulting in swelling responses. The response is antigen-specific and requires prior antigen sensitization. A positive donor-reactive DTH response in the Tv-DTH assay reflects that the transplant patient has developed a pro-inflammatory immune disposition toward graft alloantigens.
The most important feature of this assay is that it can also be used to detect regulatory T cells, which cause bystander suppression. Bystander suppression of a DTH recall response in the presence of donor antigen is characteristic of transplant recipients with accepted allografts 2,4-14. The monitoring of transplant recipients for alloreactivity and regulation by Tv-DTH may identify a subset of patients who could benefit from reduction of immunosuppression without elevated risk of rejection or deteriorating renal function.
A promising area is the application of the Tv-DTH assay in monitoring of autoimmunity15,16 and also in tumor immunology 17.

We describe a valuable diagnostic assay that could potentially be used to decide the withdrawal of immunosuppression after transplant without elevated risk of graft rejection. The assay uses the principles of Delayed Type Hypersensitivity and provides accurate assessment of both donor specific effector and regulatory immune responses mounted by recipients.

عبر الجسم الحي فرط الحساسية النوع المتأخر الفحص ل Antigen تنظيم محدد

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

في المختبر الفحص لتقييم أثر مناعة مقررات تمهيدية بشأن فيروس نقص المناعة CD4 T محددة المستجيب خلية وظيفة

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

ل<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; نموذج لهجوم T-خلية الموجه دبقية قليلة التغصن في الدماغ الحادة شرائح

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

التصوير كله والحيوان وتدفق Cytometric تقنيات CD8 + T الردود خلية التحليل من Antigen محددة بعد الجسيمات النانوية التطعيم

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

تقييم الشبكية دبقية أكلة وظيفة<em&gt; في فيفو</em&gt; باستخدام الفحص القائمة على الخلوي التدفق

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

توليد<em&gt; دي نوفو</em&gt; محددة مستضد تي الإنسان مستقبلات الخلية من قبل فيروسات تنبيغ من مركزية Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

كشف وإثراء نادر محددة مستضد الخلايا B لتحليل النمط الظاهري وظيفة

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in human sera and in separate preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin (IVIg). The protocol describes the methodological steps involved in sample preparation, printing of arrays, assay procedure, and data analysis. In addition, this protocol could be further developed to incorporate diverse clinical samples including plasma and cell culture supernatants. We show how protein microarray can be used to determine a combination of isotype (IgG, IgA, IgM), subclass (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), and strain-specific antibodies to highly purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087), toxin B from a C. difficile toxin-B-only expressing strain (CCUG 20309), a precursor form of a B fragment of binary toxin, pCDTb, ribotype-specific whole surface layer proteins (SLPs; 001, 002, 027), and control proteins (tetanus toxoid and Candida albicans). During the experiment, microarrays are probed with sera from individuals with C. difficile infection (CDI), individuals with cystic fibrosis (CF) without diarrhea, healthy controls (HC), and from individuals pre- and post-IVIg therapy for the treatment of CDI, combined immunodeficiency disorder, and chronic inflammatory demyelinating polyradiculopathy. We encounter significant differences in toxin neutralization efficacies and multi-isotype specific antibody levels between patient groups, commercial preparations of IVIg, and sera before and following IVIg administration. Also, there is a significant correlation between microarray and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for antitoxin IgG levels in serum samples. These results suggest that microarray could become a promising tool for profiling antibody responses to C.difficile antigens in vaccinated or infected humans. With further refinement of antigen panels and a reduction in production costs, we anticipate that microarray technology may help optimize and select the most clinically useful immunotherapies for C. difficile infection in a patient-specific manner.

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

This article describes a simple protein microarray method for profiling humoral immune responses to a 7-plex panel of highly purified Clostridium difficile antigens in human sera. The protocol can be extended for the determination of specific antibody responses in preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin.

مقايسة ميكرواري البروتين "تحديد المصلية" محددة مستضد "الضد الردود التالية" المطثيّة العسيرة الإصابة

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...