إن االاختلال من بروتين تاو في تجميعه الذاتي إلى خيوط هيللية مقترنة هو السمة المميزة المرضية لمرض الزهايمر وغيرها من التووباميس. هنا نقدم فحص تجميع تاو القوي الذي يمكن أن يساعد في توضيح عملية التوربات. التحويل يتبع جميع الخطوات لعملية البلمرة تعتمد على النوى وهو استنساخ للغاية، مما يسمح لفحص المخدرات في شكل أكثر صرامة التي اجتمعت مستوى OBSI حتى الآن.
إن نوعية الكواشف أمر بالغ الأهمية. يجب أن يكون تاو المؤتلف نقيًا للغاية وخالياً من المجاميع والشظايا. تشغيل أولا على الكمبيوتر وقارئ متعدد المستويات microplate.
بعد السماح للمعدات بالانستقراء، ابدأ تشغيل البرنامج وحدد بروتوكول قياسي كنوع البروتوكول. تعيين درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية وحدد سخنا قبل مواصلة البروتوكول. بعد ذلك، قم بتعيين وقت التشغيل الحركي إلى 50 ساعة وفاصل القياس إلى 15 دقيقة.
تعيين اهتزاز المدارية إلى 425 دورات في الدقيقة الواحدة في وضع مستمر. بعد ذلك، حدد طريقة القراءة كـ الفلورسنس كثافة نقطة النهاية الحركية momochromators. تعيين الطول الموجي الإثارة إلى 440 نانومتر والطول الموجي للانبعاثات إلى 485 نانومتر، ووضعية البصريات إلى أعلى، والمكسب إلى 80.
حدد سرعة القراءة العادية وقم بتعيين ارتفاع القراءة إلى 4.50 ملليمتر. ثم التحقق من صحة البروتوكول وحفظه. بدء تشغيل باستخدام بروتوكول تم إنشاؤه.
اسم التجربة، حدد وجهة الملف المنشأ حديثا، والسماح للأداة لتكواليت ما قبل إلى درجة الحرارة المطلوبة. لتجربة تحويل تاو المؤتلفة التلقائية ، قم بإعداد عينة تفاعل 1000 ميكرولتر مع 800 ميكرولترتر لـ thioflavin-T fluorescence ، و 130 ميكرولترات لتحليل SEC-MALS عن طريق خلط البروتين أولاً مع حاجز التفاعل في أنبوب 1.5 ملليلتر. ثم إضافة الهيبارين وثيوفلافيين تي ومزيج جيد عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا خمس مرات.
من المهم تنفيذ البروتوكول بدقة لضمان قابلية التكاثر العالية ، ومزج الكواشف بنفس الترتيب ، والحفاظ على الإطار الزمني. تدور العينة في 12، 000 س ز و 25 درجة مئوية لمدة خمس دقائق للقضاء على فقاعات الهواء. بعد الطرد المركزي الاستغناء 200 ميكرولترات من عينة رد فعل في بئر في 96 جيدا microplate، وتجنب تشكيل فقاعات الهواء.
ثم ختم microplate لتجنب التبخر. ضع اللوحة الصغيرة في قارئ متعدد المستويات. حدد لوحة كاملة، أو إذا كان لوحة ليست كاملة، حدد الآبار التي سيتم قراءتها، وبدء القياس.
تصدير البيانات إلى برنامج معالجة البيانات. ثم إزالة microplate من المعدات. بعد ذلك، إزالة السدادة من اللوح الصغير.
اخلط العينة المجمعة في الآبار عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا مرتين، وتجمع النسخ المتماثلة المختلفة في أنابيب 1.5 ملليلتر. اخلط كل عينة بدقة عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا خمس مرات، والاستغناء 10 إلى 20 ميكرولترات على سطح الميكا لتحليل المجاميع عن طريق المجهر القوة الذرية. بعد ذلك، حصاد المجاميع عن طريق الغزل كل واحد 1.5 ملليلتر أنبوب في 20، 000 × ز و 4 درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.
تحليل المنافق من قبل SEC-MALS لتأكيد عدم وجود Tau أحادية الأحرف في العينة، مما يشير إلى تحويل ناجح إلى مجاميع. بعد ذلك، إزالة جميع عظمى المتبقية وتسمية أنبوب 1.5 ملليلتر التي تحتوي على المجاميع المتبقية مع تركيز بروتين تاو المؤتلف الأولي وحجم العينة. المفاجئة تجميد المجاميع وتخزينها في 80 درجة مئوية.
لتجربة مبذرة، إزالة المجاميع تاو المؤتلف من الفريزر، إضافة حجم العازلة رد الفعل المشار إليها على التسمية، والسماح للأنبوب لتحقيق الاستقرار في درجة حرارة الغرفة. ثم إعادة بناء المجاميع عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا من خمس إلى ثماني مرات. سونيكات العينة 200 ميكرولتر المجمعة على الجليد باستخدام 1/8 بوصة microtip لمدة إجمالية قدرها 15 ثانية مع نبضات من ثانية واحدة على وثانيتين قبالة في 30 في المئة السعة.
بعد ذلك، قم بإعداد عينة تفاعل 800 ميكرولتر عن طريق خلط البروتين أولاً مع حاجز التفاعل في أنبوب 1.5 ملليلتر. ثم إضافة الهيبارين وثيوفلافيين تي ومزيج جيد عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا خمس مرات. تدور العينات في 12، 000 س ز و 25 درجة مئوية لمدة خمس دقائق للقضاء على فقاعات الهواء.
بعد الطرد المركزي، الاستغناء 198 ميكرولترات من عينة رد فعل في بئر في 96-جيدا microplate، وتجنب تشكيل فقاعات الهواء. التجانس عينة الفيبرال شكلت مسبقا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا ثلاث مرات. إضافة المبلغ المقابلة للنسبة المطلوبة من البذور إلى كل بئر ويخلط عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا ثلاث مرات.
ثم ختم microplate لتجنب التبخر. ضع اللوحة الدقيقة في قارئ اللوحة الدقيقة المتعددة المقاييس وابدأ القياس. بعد اكتمال التجربة، قم بإزالة اللوحة الدقيقة من المعدات.
ثم قم بتصدير البيانات إلى جدول بيانات. المؤتلف تاو تحتوي على الطفرات C291A وC322A و ن محطة له وC محطة c العلامات نقية للغاية كما هو متصور على صفحة SDS وتقريبا 100 في المئة أحادية الأحرف كما تم تقييمها من قبل SEC-MALS. وأعقب تراكم تاو المؤتلف الناجم عن الهيبارين فلوريسين تي ثيوفلافين-تي باستخدام طول موجي مثير من 440 نانومتر وطول موجة من الانبعاثات من 485 نانومتر.
ولهذا الفحص قابلية استنساخه إلى حد كبير، حيث يمكن تحديد النتائج من 10 آبار فردية لا يمكن تحديدها تقريباً. المجاميع تاو المؤتلف هي خليط متجانس من الهياكل الفينية من أطوال مختلفة، على غرار ما تم الإبلاغ عنه السابقين فيفو مورفولولوجي. ولا يحتوي خليط التفاعل النهائي على مونومر، مما يوحي بتحويل كامل إلى مجاميع، كما هو مبين في قياسات قانون الاحصاءات العامة- SEC.
وتتشابه حركية تجميع تاو المؤتلف في أشواط تجريبية مستقلة، كما تؤكد على ذلك منحنيات السيني مماثلة وتخلف لا يمكن أن ينم عن أيه لا يمكن االتعـاي ومراحل النمو. يتم الحفاظ على مستوى عال من إعادة إنتاج عند استخدام دفعات مختلفة من البروتين. مجاميع تاو المؤتلفة مسبقًا فعالة في توظيف Tau monomer وتحفيز تشكيل مجاميع دي نوفو تاو ، وتناسب كفاءة العملية بشكل مباشر مع النسبة المئوية للبذور.
كميات منخفضة تصل إلى 0.0025 في المئة من مجاميع تاو شكلت مسبقا أعرب عن حجم قادرة على تجاوز نوى تاو المؤتلفة وتحريك دي توليد الفبرال نوفو. يحاكي الفحص الحالي ما يعتقد أنه في vivo misfolding وتجميع تاو وتمكن من إجراء دراسات ميكانيكية يمكن أن تلقي الضوء على عملية التسبب في الأمراض وتشكل أداة قيمة لفحص المخدرات ودراسة تدخل المرشحين للمخدرات في مراحل مختلفة من العملية. وسوف تسمح قابلية الاستنساخ العالية للم مقايسة العلماء بتنفيذها بسهولة نسبية في المختبر.
على الرغم من أن المقايسة الحالية تركز فقط على أطول تاو isoform، الإنسان تاو-441، يمكن تكييف التطبيق لدراسة المتغيرات تاو مختلفة. ولا ننسى، واختيار الكواشف البروتين الحق وإنتاجها في معايير عالية الجودة ضرورية في إعداد مقايسة قوية وقابلة للاستنساخ للغاية.
