Le mauvais déroulement de la protéine Tau dans son auto-assemblage en filaments héliciques appariés est une caractéristique pathologique de la maladie d’Alzheimer et d’autres tauopathies. Ici nous présentons un essai robuste d’agrégation de Tau qui pourrait aider à élucider le processus de pathogénie de Tau. La conversion suit toutes les étapes d’un processus de polymérisation dépendant de la nucléation et est hautement reproductible, permettant le dépistage des médicaments dans un format plus rigoureux qui a atteint le niveau d’OSI à ce jour.
La qualité des reagents est cruciale. Le Tau recombinant doit être très pur et dépourvu d’agrégats et de fragments. Allumez d’abord l’ordinateur et le lecteur de microplaque multimode.
Après avoir permis à l’équipement de se stabiliser, démarrez le logiciel et sélectionnez protocole standard comme type de protocole. Réglez la température à 37 degrés Celsius et sélectionnez Préchauffage avant de poursuivre le protocole. Ensuite, réglez le temps de course cinétique à 50 heures et l’intervalle de mesure à 15 minutes.
Réglez la secousse orbitale à 425 cycles par minute en mode continu. Par la suite, choisissez la méthode de lecture comme momochromators cinétiques de point de terminaison d’intensité de fluorescence. Réglez la longueur d’onde d’excitation à 440 nanomètres et la longueur d’onde d’émission à 485 nanomètres, la position optique au sommet, et le gain à 80.
Sélectionnez la vitesse normale de lecture et réglez la hauteur de lecture à 4,50 millimètres. Ensuite, validez et enregistrez le protocole. Démarrez l’exécuter à l’aide du protocole créé.
Nommez l’expérience, sélectionnez la destination du fichier nouvellement créé et permettez à l’instrument de prééquilibrer à la température désirée. Pour une expérience spontanée de conversion de Tau recombinante, préparez un échantillon de réaction de 1000 microlitres avec 800 microlitres pour la fluorescence thioflavine-T, et 130 microlitres pour l’analyse SEC-MALS en mélangeant d’abord la protéine avec le tampon de réaction dans un tube de 1,5 millilitre. Ajouter ensuite l’héparine et le thioflavine-T et bien mélanger en faisant monter et descendre cinq fois.
Il est important d’exécuter le protocole avec précision pour assurer une reproduction élevée, mélanger les réaccentrages dans le même ordre et rester dans les délais. Faites tourner l’échantillon à 12 000 x g et 25 degrés Celsius pendant cinq minutes pour éliminer les bulles d’air. Après centrifugation distribuer 200 microlitres d’échantillon de réaction par puits dans une microplaque de 96 puits, en évitant la formation de bulles d’air.
Ensuite, scellez la microplaque pour éviter l’évaporation. Placez la microplaque dans un lecteur de microplaque multimode. Sélectionnez la plaque complète, ou si la plaque n’est pas pleine, sélectionnez les puits à lire et commencez la mesure.
Exportez les données vers un logiciel de traitement de données. Retirez ensuite la microplaque de l’équipement. Ensuite, retirez le scellant de la microplaque.
Mélangez l’échantillon agrégé dans les puits en pipetage de haut en bas deux fois, et mettre en commun les différentes répliques dans des tubes de 1,5 millilitre. Mélangez soigneusement chaque échantillon en pipetage de haut en bas cinq fois, et distribuez 10 à 20 microlitres sur une surface de mica pour analyser les agrégats par microscopie de force atomique. Par la suite, récoltez les agrégats en faisant tourner chacun un tube de 1,5 millilitre à 20 000 x g et 4 degrés Celsius pendant une heure.
Analyser le supernatant par SEC-MALS pour confirmer l’absence de Tau monomère dans l’échantillon, indiquant une conversion réussie en agrégats. Ensuite, retirez tous les supernatants restants et étiquetez le tube de 1,5 millilitre contenant les agrégats restants avec la concentration initiale de protéines Tau recombinantes et le volume de l’échantillon. Casser congeler les agrégats et stocker à 80 degrés Celsius.
Pour une expérience ensemencée, retirez les agrégats tau recombinants du congélateur, ajoutez le volume de tampon de réaction indiqué sur l’étiquette et laissez le tube se stabiliser à température ambiante. Puis réutilisez les agrégats en faisant monter et descendre cinq à huit fois. Sonicate l’échantillon agrégé de 200 microlitres sur la glace à l’aide d’un microtip de 1/8 pouce pour une période totale de 15 secondes avec des impulsions d’une seconde sur et deux secondes à 30 pour cent d’amplitude.
Ensuite, préparez un échantillon de réaction de 800 microlitres en mélangeant d’abord la protéine avec le tampon de réaction dans un tube de 1,5 millilitre. Ajouter ensuite l’héparine et le thioflavine-T et bien mélanger en faisant monter et descendre cinq fois. Faites tourner les échantillons à 12 000 x g et 25 degrés Celsius pendant cinq minutes pour éliminer les bulles d’air.
Après centrifugation, distribuez 198 microlitres d’échantillon de réaction par puits dans une microplaque de 96 puits, évitant ainsi la formation de bulles d’air. Homogénéisez l’échantillon fibral pré-formé en faisant monter et descendre trois fois. Ajouter la quantité correspondant au pourcentage désiré de graines à chaque puits et mélanger en pipetting de haut en bas trois fois.
Ensuite, scellez la microplaque pour éviter l’évaporation. Placez la microplaque dans le lecteur de microplaque multimode et commencez la mesure. Une fois l’expérience terminée, retirez la microplaque de l’équipement.
Exportez ensuite les données vers une feuille de calcul. Recombinant Tau contenant les mutations C291A et C322A et n terminal son terminal c-tags sont très purs comme visualisé sur la page SDS et pratiquement 100 pour cent monomère tel qu’évalué par SEC-MALS. L’agrégation recombinante de Tau induite par l’héparine a été suivie de la fluorescence de thioflavine-T utilisant une longueur d’onde d’excitation de 440 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 485 nanomètres.
L’analyse est hautement reproductible avec des résultats de 10 puits individuels étant pratiquement indiscernables. Les agrégats tau recombinants sont un mélange homogène de structures fibulaires de différentes longueurs, semblables aux morphologies ex vivo rapportées. Le mélange de réaction final ne contient pas de monomère, ce qui suggère une conversion complète en agrégats, comme le montrent les mesures SEC-MALS.
La cinétique de l’agrégation recombinante de Tau dans les courses expérimentales indépendantes sont semblables, comme souligné par les courbes sigmoidal semblables et les phases indiscernables de décalage et de croissance. Le niveau élevé de reproductibilité est maintenu lorsque différents lots de protéines sont utilisés. Les agrégats tau recombinants pré-formés sont efficaces pour recruter du monomère Tau et induire la formation d’agrégats de novo Tau, et l’efficacité du processus est directement proportionnelle au pourcentage de graines.
Des quantités aussi faibles que 0,0025 pour cent des agrégats Tau pré-formés exprimés en volume sont capables de contourner la nucléation recombinante tau et déclencher la génération de novo fibral. L’analyse actuelle imite ce que l’on croit être le mauvais déroulement et l’agrégation in vivo de Tau et permet des études mécanistes qui pourraient faire la lumière sur le processus de pathogénie et constitue un outil précieux pour le dépistage des médicaments et l’étude de l’interférence des candidats médicaments à différentes étapes du processus. La haute reproductibilité de l’essai permettra aux scientifiques de le mettre en œuvre avec une relative facilité en laboratoire.
Bien que l’analyse actuelle se concentre uniquement sur le plus long Tau isoforme, humain Tau-441, l’application peut être adaptée pour étudier différentes variantes tau. Et n’oubliez pas que le choix des bons réaditeurs protéiques et leur production à des normes de qualité élevées sont essentiels à la mise en place d’un test robuste et hautement reproductible.
