ペアになったヘリカルフィラメントへの自己集合におけるタウタンパク質の誤折は、アルツハイマー病および他のタウオパチーの病理学的特徴である。ここでは、タウ病因の解明に役立つ堅牢なタウ凝集アッセイを紹介します。この変換は、核生成依存重合プロセスのすべてのステップに従い、非常に再現性が高く、現在までにOBSIレベルを満たすより厳格な形式での薬物スクリーニングを可能にする。
試薬の品質は非常に重要です。組換えタウは、凝集体と断片を欠いて、非常に純粋である必要があります。まず、コンピュータとマルチモードマイクロプレートリーダーの電源を入れます。
装置を安定させた後、ソフトウェアを起動し、プロトコルの種類として標準プロトコルを選択します。温度を摂氏37度に設定し、プロトコルを続行する前に「予熱」を選択します。次に、運動の実行時間を 50 時間、測定間隔を 15 分に設定します。
連続モードで軌道振動を毎分425サイクルに設定します。これに続いて、蛍光強度エンドポイント運動性モモクロマーターとして読み取り方法を選択する。励起波長を440ナノメートル、発光波長を485ナノメートルに、光学位置を上に、ゲインを80に設定します。
通常の読み取り速度を選択し、読み取り高さを 4.50 ミリメートルに設定します。次に、プロトコルを検証して保存します。作成したプロトコルを使用して実行を開始します。
実験に名前を付け、新しく作成したファイルの保存先を選択し、計測器が希望の温度に事前に平衡化できるようにします。自発的組換えタウ変換実験では、チオフラビン-T蛍光用800マイクロリットルの1,000マイクロリットル反応サンプルを調製し、まず1.5ミリリットルチューブ内の反応バッファーとタンパク質を混合してSEC-MALS分析用に130マイクロリットルを調製します。その後、ヘパリンとチオフラビン-Tを加え、上下に5回ピペットでよく混ぜます。
高い再現性を確保し、同じ順序で試薬を混合し、時間枠内に保つためにプロトコルを正確に実行することが重要です。サンプルを12,000 x gと25°Cで5分間回転させ、気泡を除去します。遠心分離後、96ウェルマイクロプレートでウェルあたり200マイクロリットルの反応サンプルを分配し、気泡の形成を回避します。
その後、蒸発を避けるためにマイクロプレートを密封します。マイクロプレートをマルチモードマイクロプレートリーダーに配置します。プレート全体を選択するか、プレートが満杯でない場合は、読み取るウェルを選択して測定を開始します。
データ処理ソフトウェアにデータをエクスポートします。次に、マイクロプレートを機器から取り外します。次に、マイクロプレートからシーラーを取り外します。
2回上下にピペットを入れ、1.5ミリリットルチューブに異なる複製物をプールすることによって、ウェルに凝集したサンプルを混合します。各サンプルを5回上下にピペットで十分に混合し、マイカ表面に10~20マイクロリットルを分配して原子間力顕微鏡で凝集体を分析します。これに続いて、1.5ミリリットルのチューブをそれぞれ20,000 x gおよび4°Cで1時間回転させて凝集体を収穫します。
SEC-MALSによる上清を分析し、サンプル中に単量体タウが存在することを確認し、凝集体への変換が成功したことを示す。次に、残りの上澄みをすべて取り除き、残りの凝集体を含む1.5ミリリットルチューブに初期組換えタウタンパク質濃度およびサンプル量をラベル付けします。スナップは、凝集体を凍結し、摂氏80度で保存します。
播種実験の場合、組換えタウ凝集体を冷凍庫から取り出し、ラベルに示された反応バッファーの量を加え、チューブを室温まで安定させます。その後、5~8回上下にピペットを回して、骨材を再中断します。1/8インチのマイクロチップを使用して氷上の200マイクロリットルの凝集サンプルを15秒間超音波処理し、パルスは1秒で、2秒間は30%の振幅でオフにします。
次に、まず1.5ミリリットルチューブにタンパク質と反応バッファーを混合して800マイクロリットル反応サンプルを調製する。その後、ヘパリンとチオフラビン-Tを加え、上下に5回ピペットでよく混ぜます。サンプルを12,000 x gと25°Cで5分間回転させ、気泡を除去します。
遠心分離後、96ウェルマイクロプレートでウェルあたり198マイクロリットルの反応サンプルを分配し、気泡の形成を避けます。前形成フィブラルサンプルを上下3回ピペット化して均質化する。各ウェルに種子の所望の割合に対応する量を追加し、上下に3回ピペットで混ぜます。
その後、蒸発を避けるためにマイクロプレートを密封します。マイクロプレートをマルチモードマイクロプレートリーダーに配置し、測定を開始します。実験が完了したら、マイクロプレートを機器から取り外します。
次に、データをスプレッドシートにエクスポートします。C291AおよびC322A突然変異およびn末端c-末端を含む組換えタウは、SDSページで視覚化された非常に純粋であり、SEC-MALSによって評価されるように事実上100%単量体である。ヘパリン誘導組換えタウ凝集は、440ナノメートルの励起波長と485ナノメートルの発光波長を用いたチオフラビン-T蛍光を続けた。
アッセイは、10個の個々の井戸からの結果が事実上区別できないという非常に再現性が高い。組換えタウ凝集体は、報告された元生体形態と同様に、異なる長さのフィブラ構造の均質な混合物である。最終的な反応混合物はモノマーを含まないので、SEC-MALS測定で示されるように、凝集体への完全な変換を示唆している。
独立した実験走行における組換えタウ凝集の運動は、類似したシグモアダル曲線と区別できないラグおよび成長段階によって強調されるように、同様である。タンパク質の異なるバッチを使用する場合、再現性の高いレベルが維持されます。プレフォーム組換えタウ凝集体は、タウモノマーのリクルートとデノボタウ凝集体の形成を誘導する際に効率的であり、プロセスの効率は種子の割合に正比例します。
体積で表現されたプレフォームタウ凝集体の0.0025%という低い量は、組換えタウ核形成をバイパスし、ノボフィブラル生成を引き起こす可能性がある。現在のアッセイは、タウの生体内の誤折と凝集であると考えられているものを模倣し、病因プロセスに光を当てることができ、薬物スクリーニングのための貴重なツールを構成し、プロセスの異なる段階で薬物候補の干渉を研究するための貴重なツールを構成する機械学的研究を可能にする。アッセイの高い再現性は、科学者が実験室で比較的容易にそれを実装することを可能にする。
現在のアッセイは、最長のタウアイソフォーム、ヒトTau-441のみに焦点を当てていますが、アプリケーションは、異なるタウ変異体を研究するために適応することができます。そして、適切なタンパク質試薬を選択し、高品質の基準でそれらを生産することは、堅牢で再現性の高いアッセイを設定する上で不可欠です。
