لعدم وجود مساحة، استشهدنا الغالب استعراض المواد، ونعتذر لزملائنا واستشهد بعدم عملها الأصلي. العمل في مختبر لالح معتمد من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة، وجبهة الخلاص الوطني، ووزارة الزراعة/NIFA، بارد، وقوات حرس الحدود إلى الخامس، ومختبر S.G.L. معتمد من قبل المعهد الوطني للصحة والأموال من أقسام أمراض النبات والأحياء النباتية-ميكروب S.G.L.

1-مصنع المواد
<ol><li>اختيار أنواع النباتات</li>
	<li>استخدام الأنواع النباتية الأصلية للبروتين من الفائدة، أي، والذي يقوم بترميز هذا البروتين للبروتينات الذاتية أو الذي يمثل المضيفة الطبيعية لمسببات المرض للبروتينات الفيروسية. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن تكون الأنواع النباتية المحددة قابلة للطريقة المختارة للتحول الوراثي عابرة. ملاحظة: الدراسات التي تستخدم بشكل روتيني نيكوتيانا بينثاميانا، الذي يمثل مضيفة جيدة تمف وتتحول كفاءة تقنية التحول الجيني بوساطة المتبعة، أي، أجروينفيلتريشن (راجع الخطوة 3). محطات بينثاميانا أ. كما تزرع بسهولة ويترك الكبيرة، التي يتم تطعيمهم بسهولة المتبعة وتحليلها بسهولة بواسطة الفحص المجهري [كنفوكل].</li>
	<li>
نمو النبات
	<ol>
<li>أ. بينثاميانا بذور النباتات في التربة الرطبة في كثافة عالية. الاحتفاظ بها في دائرة بيئة التي تسيطر عليها في 20-25 ˚C تحت 16 ح الضوء في ~ 75 µmol الفوتونات m-2 s-1 و 8 ح الظلام. بعد قطر يوفيل تصل إلى 0.5 سم، بعناية نقل الشتلات إلى أواني أكبر ومواصلة النمو في الدائرة نفسها نفس الظروف.</li>
		<li>المحافظة على النباتات حتى تنمو إلى المرحلة 4-8-ليف في غضون 4 أسابيع عندما يترك أكبر 4-6 سم في القطر؛ وفي هذا الوقت، يمكن استخدامها أجروينفيلتريشن (راجع الخطوة 3). ملاحظة: الأهم من ذلك، ابدأ استخدام النباتات إذا بدأت زهرة لأنه، في هذه المرحلة الإنمائية، يختلف بنية ليف غالباً24،25، مما يؤدي أحياناً إلى نتائج غير متناسقة.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2-التعبير بناء ناقلات
<ol><li>
اختيار نظام التعبير
	<ol>
<li>اختر التعبير نظام أيوناقلات وناقلات أسلوب التسليم، الأكثر ملاءمة للتعبير عن بروتين الاهتمام بالأنواع النباتية التي شملتها الدراسة. ملاحظة: في بعض الأحيان، مثل مجموعات محددة من أنواع اختبار البروتين/النباتات قد تتطلب موجهات محددة وناقلات أسلوب التسليم للتعبير الأمثل ووظيفة البروتين للفائدة. للنباتات الأكثر فلقتين، ومع ذلك، حدد والبلازميدات ثنائي نواقل التعبير وأجروينفيلتريشن كنظام التسليم.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
علامات البروتين نيون
	<ol>
<li>فلوريسسينتلي الوسم كل البروتين أعرب للتحليل توزيع سوبسيلولار22، بما في ذلك الترجمة Pd. ملاحظة: تستخدم البروتينات أوتوفلوريسسينت، مثل الحركة و DsRed2، كالعلامات. العلامة البروتين تم اختبارها مع الحركة وكوكسبريس أنه مع DsRed2 حرة. وظائف الحراجية المعتمدة كعلامة وجزيء بضائع لا علاقة لها الفيروس. وظائف DsRed2 لمعايرة الكفاءة الإجمالية للتعبير عابرة، وأنها خلية مستقلة، لتحديد الخلية في البداية تحول؛ هذه الوظيفة الأخيرة المهم عند تقييم حركة الخلية للخلية البروتينات اختبار يحتمل أن تكون غير الخلية--المستقلة. كوكسبريسيون مع علامة Pd PDCB1، الذي أيضا خلية مستقلة، العلامة البروتين تم اختبارها مع الحركة و PDCB1 مع DsRed2.</li>
		<li>وكقاعدة عامة، صهر العلامة أوتوفلوريسسينت إلى الكربوكسيل-محطة البروتين المعرب عنها. ومع ذلك، إذا كانت المعروضات البروتين اختبار كامل طول المعلمة شبهة استهداف Pd، نقل العلامة إلى الأمينية تيرمينوس البروتين.</li>
		<li>استنساخ الترميز تسلسل البروتينات لفحصها في ناقل تعبير النباتات مناسبة. ملاحظة: هناك العديد من ناقلات التعبير النباتية المختلفة التي تسمح لوضع علامات مضيئة. نحن نستخدم مجموعة من pSAT والبلازميدات26 أو بعض من تلك المشتقات27،28، التي مناسبة لاستنساخ للتسلسل لمصلحة مباشرة في الإطار مع العلامات أوتوفلوريسسينت المقترحة (راجع الخطوة 2.2.1) في كلا الأمينية--و التوجهات الكربوكسيل الطرفية.</li>
		<li>نقل كل كاسيت التعبير إلى متجه ثنائي المتبعة. ملاحظة: على الرغم من أن يبني على أساس pSAT مناسبة لإيصال biolistic مباشرة إلى أنسجة النبات، أجروينفيلتريشن، وهو أسلوب التحويل الموصى بها هنا (راجع الخطوة 3)، يتطلب أن الكاسيت التعبير تقع بين تي-الحمض النووي حدود ثنائي ناقلات29. ملاحظة: جميع pSAT ناقلات مصممة للسماح بنقل هذه إلى26،ناقل ثنائي التعبير مولتيجيني بزب-RCS230 باستنساخ خطوة واحدة استخدام قطع نادرة nucleases الإداريين،--بوي،-اسوسﺗﻴﻚ، وأنا-سي، بي-بسبي وتلى PI 26-يمكن توظيف الباحثين الذين يفضلون استخدام الاستنساخ ريكومبيناتوريال، مثلاً، استخدام مواقع مغايرة لوكس 31، pSAT متجه المتغيرات26،27.</li>
		<li>كوكسبريشن، نقل كل شرائط التعبير، مثلاً، اختبار البروتين-الحراجية المعتمدة و DsRed2 أو اختبار البروتين-الحراجية المعتمدة و PDCB1-DsRed2 (انظر الخطوة 2، 1)، إلى نفس الموجه ثنائي بزب-RCS2. ملاحظة: بدلاً من ذلك، الثقافات المتبعة إيواء ثوابت ثنائي الفردية يمكن أن تكون مختلطة معا للتسلل إلى أ. بينثاميانا (راجع الخطوة 3.1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3-أجروينفيلتريشن
<ol><li>
إضافة 1 ميكروغرام من بلازميد بزب-RCS2-تعتمد من الثقافة 2.2.5 إلى 100 ميليلتر خطوة من الخلايا المختصة من سلالة tumefaciens المتبعة EHA105 أو GV3101 التي أعدت ك وصف32، احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة، وفلاش-التجميد في النيتروجين السائل لمدة 1 دقيقة، و تبني في 28 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
	<ol>
<li>ثم أضف 1 مل متوسطة رطل (تريبتوني 10 غرام/لتر، استخراج الخميرة 5 غرام/لتر و 10 غرام/لتر كلوريد الصوديوم) إلى خليط الخلية المختصة واحتضان عند 28 درجة مئوية ل 2 حاء تدور أسفل الخلايا في 3,000 × ز لمدة 1 دقيقة، وإعادة تعليق لهم في 0.2 مل رطل ، ولوحة لهم في أجار رطل وتستكمل مع المضادات الحيوية المناسبة (مثل، بالسبيكتينوميسين 100 مغ/لتر ووالريفامبيسين 50 مغ/لتر لناقلات المستندة إلى RSC2 بزب،من2630). تنمو عند 28 درجة مئوية عن 48 ساعة حتى مستعمرات فردية مرئية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>بيك ولوحة عدة مستعمرات فردية على طبق أجار رطل طازجة (راجع الخطوة 3.1)، ينمو بمعدل 28 درجة مئوية ح 48، وأن كمية صغيرة من البكتيريا لتحليل بمستعمرة [بكر]33 تأكيد وجود بنيات ثنائية محددة.</li>
	<li>
تنمو كل مستعمرة المتبعة مع بنية الفوائد بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية في 5 مل من رطل المتوسطة وتستكمل مع المضادات الحيوية المناسبة (راجع الخطوة رقم 3.1.1). الطرد المركزي الخلايا في 3,000 × ز، وإعادة تعليق لهم للتطوير التنظيمي600= 0.5 في المخزن المؤقت أجروينفيلتريشن (مم 10 MgCl2، 10 مم مس (pH 5.6)، 150 ميكرون أسيتوسيرينجوني). احتضانها ح 2 في درجة حرارة الغرفة.
	<ol>
<li>في حالة استخدام خليط من والبلازميدات ثنائي بدلاً من بلازميد تعبير مولتيجيني واحد للبروتين كوكسبريشن، خلط الثقافات الخلية المقابلة في نسبة 1:1 v/v قبل تسلل. ثم احتضان الخلايا عند 28 درجة مئوية ح 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
تحميل العدوى إلى 1 مل المحاقن البلاستيكية والصحافة يترك فوهة المحاقن (لا الإبرة) ضد البشرة (أباكسيال) أقل من النضج الكامل بينثاميانا أ . عقد طرفية مع إصبع القفاز على الوجه أداكسيال34،35.
	<ol>
<li>إدخال المتبعة في عمليات التسلل المتوسطة عن طريق الحقن البطيء. للأهمية الإحصائية، تسلل عدة أوراق في كل مصنع. ملاحظة: لاحظ أن يترك أقدم لا تستخدم كما أنها لا تؤدي إلى مستويات التعبير متسقا.</li>
		<li>تطعيم جميع الأوراق في الموقع. المحافظة على النباتات تسلل حتى المراقبة كما هو موضح في "الخطوة 1، 2".</li>
	</ol>
</li>
</ol>4-[كنفوكل] مجهرية
<ol><li>استخدام شفرة لقطع كل ورقة إلى شظايا بين العروق ح 24-48 بعد التسلل، (تبعاً لكفاءة التعبير عابرة من البروتين اختبار محددة)؛ ينبغي أن يكون حجم كل شريحة الأنسجة مثل الشريحة مغطى تماما بالزجاج غطاء (22 مم × 40 مم) المستخدمة للفحص المجهري.</li>
	<li>وضع قطره من الماء على الشريحة ليف مكان شرائح أوراق على الكائن الشريحة مع سطح أوراق أباكسيال التي تواجهها، وتغطية ذلك مع الزجاج غطاء. شل الزجاج غطاء مع قطع صغيرة من الشريط على كل جانب.</li>
	<li>
مراقبة الأنسجة أجروينفيلتراتيد تحت ليزر [كنفوكل] مجهر مسح وتسجيل الصور الناتجة.
	<ol>
<li>أولاً، استخدام عدسة هدف X 10 لتحديد الخلايا مع الإشارة، وثم استخدم عدسة الهدف x 63 للملاحظات أكثر تفصيلاً.</li>
		<li>الطول الموجي نانومتر الاستخدام 458 من ليزر أيون أرجون تثير الحراجية المعتمدة، و 543 نانومتر لإثارة DsRed2. الاحتفاظ بكافة الإعدادات للحصول على الصور، و أي، وكثافة الليزر وضوئي أنبوب (PMT) الإعدادات، بين التجارب. وفي المتوسط، فحص خلايا 100-120 لكل حالة تجريبية.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5-تحديد الثابتة والمتنقلة
<ol><li>تشخيص تعريب البروتين تم اختبارها باستخدام مجهر [كنفوكل] (القسم 4). تحقق إذا كان اختبار البروتين25،سمة نمط الشروريه الطرفية36،38،37،39،،من4041 وكولوكاليزيس مع علامة Pd PDCB123. يشير هذا إلى أن البروتين اختبار يحتوي على الأرجح على تسلسل الثابتة والمتنقلة.</li>
	<li>بعد تأكيد النشاط الثابتة والمتنقلة لاختبار البروتين، تدريجيا بتقسيم إطاره القراءة المفتوحة (ORF) (بنك الجينات انضمام عدد BAF93925.1) إلى أجزاء أصغر، أوتوفلوريسسينتلي، (مثلاً، الحراجية المعتمدة،) علامة كل منها، وتحليل ما سوبسيلولار الترجمة كما هو موضح في الخطوة 4. وفي البداية، يوصي بحجم المخلفات من الأحماض الأمينية 100 لكل جزء ينقسم.</li>
	<li>كذلك تقسيم الأجزاء المقطوعة التي لها نشاط الثابتة والمتنقلة وتحقق بها التعريب سوبسيلولار كما هو موضح في الخطوة 4 حتى الجزء الأصغر التي لا تزال يموضع إلى Pd، أي ما يكفي لنقل البضائع العلامة أوتوفلوريسسينت إلى Pd، يتم تعريف. ويفترض هذا الجزء لتمثيل تسلسل الثابتة والمتنقلة.</li>
	<li>حذف الثابتة والمتنقلة المفترضة من البروتين اختبار كامل طول، أي فتيل الجزء المتبقي من البروتين الاختبار دون الثابتة والمتنقلة المفترضة للعلامة أوتوفلوريسسينت، وتحديد التعريب سوبسيلولار من البروتين متحولة الناتجة كما هو موضح في الخطوة 4. إذا فشل هذا البروتين المسخ الذي يفتقر الثابتة والمتنقلة المفترضة لتعريب إلى Pd، هذا سوف تشير إلى أن المحددة الثابتة والمتنقلة لا فقط كافية (انظر الخطوة 5.3)، لكنها ضرورية أيضا لنقل Pd البروتين تم اختبارها.</li>
	<li>أجروينفيلتراتي أوراق بخليط ثقافات المتبعة إيواء التعبير بناء لمعلم الحراجية المعتمدة الثابتة والمتنقلة و DsRed2 الحرة (راجع الخطوة 3، 3). مراقبة تسلل الأنسجة باستخدام مجهر [كنفوكل] مع عدسة الهدف 10 x باستخدام نفس الإعدادات كما هو الحال في "الخطوة 4، 3".</li>
	<li>نقاط الخلايا التي تحتوي على إشارات الحراجية المعتمدة و DsRed2 كخلايا تسلل في البداية، ونقاط الخلايا المجاورة التي تتضمن فقط إشارة الحراجية المعتمدة كتلك أن حركة المعرض. ملاحظة: هذه الخطوة يدرس الثابتة والمتنقلة التي تم تحديدها لقدرته خلية إلى الحركة المحتملة؛ وهذا لأن العديد من البروتينات التي تستهدف Pd (بما في ذلك معظم النباتات الفيروسية MPs) أيضا نقل عن طريق المشتريات إلى الخلايا المجاورة. تركيز المتبعة المستخدمة لتسلل يعتمد على كفاءة هياكل مختلفة التعبير على التوالي. أجروينفيلتريشن، تأكد من استخدام تمييع الثقافة الخلية التي تضمن (ط) تحول الخلايا المفردة، ترك الخلايا المتجاورة تناظري، (ثانيا) أن يحقق كفاءة مماثلة للتعبير. على سبيل المثال، تستخدم تجاربنا OD600 من 0.01 و 0.005 للتعبير عن معلم الحراجية المعتمدة الثابتة والمتنقلة والحرة DsRed2، على التوالي.</li>
</ol>6-تحديد المخلفات "الرئيسية الثابتة والمتنقلة" باستخدام "المسح ألانين"42
<ol><li>استخدام البروتوكولات القياسية PCR لتضخيم الثابتة والمتنقلة الترميز تسلسل استخدام زوج من أجهزة الإشعال مصممة لتحتوي الطفرة المرجوة، أي، والاستعاضة عن بقايا الأحماض الأمينية المستهدفة مع ألانين، حول المنطقة الوسطى من كل التمهيدي كما هو موضح 21-القيام بالتصميم التمهيدي واستخدام طقم الطفرات موقع الموجه للطفرات موقع الموجهة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.</li>
	<li>تنقية منتجات PCR الناتجة عن استخدام أي أدوات تنقية الحمض النووي القياسية، ويستوعبها في 37 درجة مئوية مع دبني للقضاء على الوالدية (أيغير المتحولة) ميثليته وهيميميثيلاتيد الحمض النووي. يبرد هذا لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (وليس على الجليد). ثم تحويل المزيج مباشرة إلى الخلايا المختصة كولاي 43، وتحديد المستعمرات مع بنيات المسخ المطلوبة كما هو موضح في "الخطوة 3-2".</li>
	<li>إدخال بنيات متحولة إلى ناقل ثنائي كما هو موضح في الخطوة 2.2.4 وتنفيذ أجروينفيلتريشن كما هو موضح في الخطوة 3، وتقييم Pd استهداف كما هو موضح في الخطوات 4 و 5، 1.</li>
</ol>

وأعلن لا تضارب في المصالح.

هذا البروتوكول له أربعة مكونات أساسية: مفهوم تحديد تسلسل ضروري وكاف لاستهداف Pd، تقسيم منهجي من بروتين الفائدة إلى الشظايا التي تنخفض تدريجيا في الطول، والصمامات تم اختبارها الشظايا إلى بروتين أوتوفلوريسسينت الذي يخدم كعلامة وشحن الجزيئات، والتحليل الوظيفي لاستهداف Pd في المعيشة زرع الأنسجة بعد تعبير عابر من البروتينات الانصهار اختبارها. لاحظ أن التعبير عابر المتبعة بوساطة يولد البيانات خلال فترة قصيرة نسبيا من الزمن، أي، عدة أيام، بالمقارنة مع الأشهر المطلوبة لإنتاج النباتات المعدلة وراثيا التي غالباً ما تستخدم في دراسات مماثلة15.
كوكسبريسيون من بروتين الاهتمام مع علامات التعريب سوبسيلولار، مثلاً، PDCB1 أو DsRed2 الحرة، عادة ما يتم تنفيذ من ناقل تعبير مولتيجيني. ومع ذلك، إذا كان تحويل العديد من أشرطة الكاسيت التعبير إلى ناقل واحد إشكالية من الناحية الفنية، كوكسبريشن يمكن أيضا إجراء بنقل كل كاسيت إلى بنية ثنائية منفصلة، والجمع بين كميات تعادل الثقافات السائل من سلالات المتبعة الناتجة عن أجروينفيلتريشن. ناقل ثنائي لأن هذا البروتوكول يستخدم تعبير عابر، حاجة لا تحمل علامات التحديد للتحول مستقرة، على الرغم من أن وجودها لا يضر بكفاءة التعبير.
هذا البروتوكول الأمثل للتعبير البروتين والاستهداف في بينثاميانا أ؛ ومع ذلك، يمكن استخدامه في سائر الأنواع النباتية، بما في ذلك أعطيت45،46، قابلة للتحول الوراثي المتبعة. للأنواع النباتية الأخرى، أو إذا رغبت في ذلك، هذا البروتوكول يمكن تكييفها للاستفادة من بيوليستيك تسليم41 للتعبير عابرة من ناقلات المستندة إلى pSAT، وتجنب الحاجة إلى نقل شرائط التعبير إلى متجهات ثنائية مباشرة.
نقطة حرجة في هذا البروتوكول هو الشرط الفسيولوجية وإنمائية متسقة من المواد النباتية. على وجه التحديد، يجب أن تكون كافة منشآت صحية في جميع أنحاء كامل التجربة، والنباتات بينثاميانا أ أجروينفيلتريشن، يجب أن يكون أقل من 4 أسابيع القديمة وفي المرحلة 4-8-ليف مع ورقة أكبر حاليا 4-6 سم في القطر. إذا كانت النباتات صغيراً جداً، ستكون قاسية للغاية، التدخل في التعبير والترجمة من البروتينات المعلمة آثار أجروينفيلتريشن. من ناحية أخرى، النباتات الأكبر سنا غالباً ما يحمل بنية متغير Pd24،25، تؤثر أيضا على الاتساق بين أنماط استهداف Pd.
لا يزال، نظراً لاختلاف الظروف الفسيولوجية للمصنع ككل، والخلايا المحولة خاصة، إلى حد ما قد تختلف كفاءة Pd الاستهداف في كل تجربة. وبالتالي، من المهم تحليل عدد كبير نسبيا من الخلايا (> 100) كل تجربة، وأداء replicates البيولوجية ثلاثة على الأقل من كل تجربة. عموما، نحن نعتبر جزء تم اختبارها لاحتواء Pd تستهدف النشاط، إذا أنه يسلك التعريب Pd في 70 في المائة على الأقل من الخلايا المحولة. يجب أن يتم تحليل الاختلافات في Pd استهداف الكفاءة لكل جزء، مثلاً، في المئة من تحول الخلايا تظهر نمط التراكم الشروريه الخاصة بالمشتريات، باختبار t للطالب، وقيم p < 0.05-0.01، المقابلة الاحتمالات الإحصائية لأكثر من 95-99%.
مسألة هامة أخرى هي موضع العلامة نيون/الشحنة في جزيء الانصهار. بعض البروتينات المستهدفة لشعبة المشتريات أيضا إقران هيولى (ER)، وقد تتطلب هذه الرابطة بالتسلسل الأمينية الطرفية دون عائق. وفي هذه الحالات، اندماج الأمينية الطرفية، التي تنصهر الكربوكسيل-المحطة جزء البروتين من الفائدة هو فيها الأمينية تيرمينوس علامة نيون، مثلاً، الحراجية المعتمدة أو DsRed2، ينبغي أن تستخدم. ويمكن تغيير هذا الموضع الافتراضي للعلامة في الحالات التالية. (ط) في حالة اندماج الأمينية الطرفية غير قابل للاستخدام – أيأنها لا معرض أنماط ذات معنى التعريب سوبسيلولار، ويعبر عن سوء، أو لا تولد الفلورسنت إشارة كافية لكشف موثوق بها – وإذا كان البروتين للفائدة لا تحتوي على تسلسلات إشارة الأمينية الطرفية أو اندماج الكربوكسيل الطرفية التي تنصهر الأمينية تيرمينوس جزء اختبار هو فيها الكربوكسيل-محطة العلامة، ينبغي محاولة. (الثاني كما يجب استخدام الأنشطار الكربوكسيل الطرفية) إذا بروتين الفائدة يحتوي على تسلسل إشارة في نهايته الكربوكسيل. (ثالثا) إذا كان البروتين لمصلحة كلا إشارات الأمينية والكربوكسيل الطرفية، مثل تلك الموجودة في البروتينات GPI رأسية، أو إذا كان يحتوي على ببتيد إشارة الأمينية الطرفية الانصهار الأمينية الطرفية غير قابلة للاستخدام بعد، العلامة ينبغي أن توضع داخليا، ( أما المصب إشارة الأمينية الطرفية أو المنبع إشارة الكربوكسيل الطرفية). وصف بعض إجراءات مفيدة لوضع علامات مضيئة الداخلية من البروتينات لدينا47،المنشورات السابقة48.
وفي الوقت الحاضر، هناك لا تسلسل الآراء المعروفة الثابتة والمتنقلة. على هذا النحو (في الخطوة 5، 2) نوصي، في البداية تقسيم البروتين في مجاورة ~شظايا بقايا طوله 100-200. يمكن ثم يتم إجراء هذه أقصر تدريجيا استناداً إلى النشاط استهداف Pd ملاحظتها أو عدمه. يجب أن يكون أحد إدراكا منها لإمكانات أخرى تستهدف إشارات موجودة في البروتين (مثلاً، NLS، الببتيدات إشارة، إلخ). ومع ذلك، كمسألة التداخل المحتمل بين هذه التسلسلات مع تسلسل الثابتة والمتنقلة غير معروف، ينبغي إدراج هذه المناطق البروتين في هذا التحليل حيث.
حتى الآن، تم استخدام هذا البروتوكول للتعرف واحد الثابتة والمتنقلة في جزيء بروتين21. يحتمل أن تكون، مع ذلك، بروتين يمكن أن تحتوي تسلسل إشارة أكثر من واحد؛ وقد وصف الواقع نلس متعددة في العديد من البروتينات النووية، بما في ذلك عوامل النسخ غاتا49. وهكذا، عند تحليل الأجزاء المختلفة من البروتين تم اختبارها لاستهداف Pd، فمن الممكن أن يتم تحديد واحد أو أكثر مثل هذه الشظايا، مما يشير إلى وجود PLSs المتعددة التي يمكن أن تعمل بشكل مستقل أو تآزر.
القيد الرئيسي من هذا البروتوكول أنه، بعد أجروينفيلتريشن، التصور لتوطين سوبسيلولار عابر البروتينات أعرب عن اهتمام يتحقق على أفضل وجه في خلايا البشرة ومرحلة النمو ضيقة نسبيا. عند الضرورة، يمكن التغلب على هذا القيد بإنتاج النباتات المعدلة وراثيا ستابلي تعبر عن كل من البروتينات تم اختبارها في معظم أنواع الخلايا والأنسجة. أيضا، هذا البروتوكول غير المفيد للدراسات الفيروسية أعضاء البرلمان أو غيرها من البروتينات Pd المستهدفة التي تعمل فقط في أنواع النباتات التي ليست قابلة للتحول الوراثي عابرة.
بينما قمنا بتطوير هذه التقنية للتعرف الثابتة والمتنقلة "النائب تمف"، يمكن استخدامه لاكتشاف PLSs في أي مصنع النواب الفيروسي أو في مصنع البروتينات الذاتية التي ترجمة إلى Pd، عابر أو بشكل دائم. وعلاوة على ذلك، إذا اقترن ب علامات مناسبة التعريب سوبسيلولار47، هذا البروتوكول مناسبة للتعرف على العديد من إشارات أخرى تستهدف ضمن البروتينات للاهتمام بالنباتات.

Plasmodesmata (Pd) تعمل كقنوات لنقل المنظمين مفتاح التنمية النباتية و morphogenesis، بدءاً من عوامل النسخ مرناً وجزيئات الحمض النووي الريبي صغيرة بين الخلايا. وعلاوة على ذلك، تستخدم هذا قدرة النقل الجزيئات Pd معظم الفيروسات النباتية لانتشارها بين الخلايا أثناء العدوى؛ للانتقال عبر Pd، تطورت فيروسات النباتات البروتينات المتخصصة، ووصف حركة البروتينات (MPs)، التي تستهدف على وجه التحديد إلى Pd1،2،3،4،،من56 , 7-الجزيئية مسارات النقل Pd على الأرجح ترابطاً وثيقا مع تسلسل معين التي تستهدف نقل البروتينات في هذه المسارات. وهكذا، قد يكون تحديد هذه الإشارات التعريب Pd (PLSs) التشخيص لمسار النقل Pd المقابلة. وهذا قياسا ل النقل Pd8، على سبيل المثال، إلى مسارات مختلفة استيراد النووية، التي يمكن أن تكون محددة للتعريب النووية المختلفة إشارة (NLS) تسلسل9،10. من الناحية المفاهيمية، نلس و PLSs تمثل تسلسل استهداف سوبسيلولار غير كليفابل التي ضرورية وكافية لاستهداف. ولكن، خلافا نلس11، تسلسل المعلومات حول PLSs محدودة للغاية. على وجه التحديد، سجلت أربعة فقط تسلسل البروتين المتورطين في استهداف Pd، مع كل منهم المستمدة من البروتينات النباتية الذاتية. ويمثل أول واحد مجال هوميوبوكس KN112 – عامل نسخ الذي ينتقل من طبقات الخلايا الداخلية للبشرة من أوراق النبات13 – وبه نوكس هومولوجس14. أيضا هو ثانية واحدة من عامل نسخ، شعبة الشؤون المالية، التي تتضمن الثابتة والمتنقلة المفترضة وصفه الاتجار بين الخلايا (IT) عزر15. التسلسل الثالث من بروتين غشائي نوع plasmodesmata المقيم 1 PDLP1، ويتم تمثيله بواسطة مجال transmembrane16. وأخيراً، Pd الرابعة استهداف تسلسل أبلغ مؤخرا عن جليكوسيلفوسفاتيديلينوسيتول (GPI)-البروتينات المرتبطة، وأنه يمثل إشارة التعديل جليكوسيلفوسفاتيديلينوسيتول (GPI)17.
من المثير للاهتمام، وحتى وقت قريب جداً، لا PLSs أبلغ النواب الفيروسي. أشارت الدراسات السابقة إلى وجود تسلسل الثابتة والمتنقلة المفترضة في النبات الفيروسية MPs18،19، ولكن ليس صحيحاً الثابتة والمتنقلة، أيتسلسل الأحماض الأمينية الحد أدنى الضروري والكافي لاستهداف Pd (جزيء بضائع لا علاقة لها كل على سبيل المثال-، الحراجية المعتمدة) قد حددت في النائب فيروسية. بعد واحدة من هذه البروتينات، النائب من فيروس تبرقش التبغ (TMV)، كان الأول للمشتريات التي تم التعريب والنقل تبين20.
ولسد هذه الفجوة، قمنا بتطوير استراتيجية تجريبية لتحديد "تمف النائب الثابتة والمتنقلة". استندت هذه الاستراتيجية على ثلاثة مفاهيم. (ط) وحددنا الثابتة والمتنقلة كتسلسل الحد أدنى من الأحماض الأمينية التي ضرورية وكافية لاستهداف البروتين إلى Pd21. (ثانيا) لأن النائب تمف يستهدف أولاً Pd وثم ترانسلوكاتيس من خلال هذه القنوات22، نحن تهدف إلى فصل هذين النشاطين والتعرف الثابتة والمتنقلة حسنة النية، التي تعمل فقط من أجل استهداف Pd، وليس للنقل اللاحقة. (ثالثا) قمنا بتحليل الثابتة والمتنقلة التي تم تحديدها للمخلفات من الأحماض الأمينية الهامة للمشتريات استهداف نشاط، سواء هيكلياً أو وظيفيا. باستخدام هذا النهج، نحن تحديد تسلسل بقايا الأحماض أمينية 50 في الأمينية المحطة "النائب تمف" بمثابة النية الثابتة والمتنقلة. وكان ذلك بإنتاج سلسلة من الشظايا "تمف النائب" أن مشبعة على طول من البروتين، ووضع علامات على الكربوكسيل تيرميني مع الحركة وعابر إذ تعرب عن لهم في الأنسجة النباتية. تعريب Pd كل أجزاء اختبار تحددها كوكسبريسينج لهم مع بروتين علامة Pd، PDCB1 (Pd كلوس ملزمة البروتين 1)23. واعتبر الجزء الأصغر التي لا تزال المترجمة إلى شعبة المشتريات، ولكن عدم اجتياز Pd، لتمثيل الثابتة والمتنقلة. وأخيراً، كان الثابتة والمتنقلة ألانين الممسوحة ضوئياً لتحديد بقايا الأحماض الأمينية الأساسية اللازمة لهيكل و/أو وظيفة.
بينما نحن هنا لتوضيح هذا النهج بوصف تحديد "تمف النائب الثابتة والمتنقلة"، فإنه يجوز لاكتشاف PLSs في أي البروتينات المستهدفة لشعبة المشتريات الأخرى، سواء ترميز بمسببات الأمراض النباتية أو النباتات أنفسهم؛ وهذا لأن لدينا أسلوب عدم الاستفادة من أي ميزات فريدة من نوعها الفيروسية من أعضاء البرلمان فيما يتعلق بقدرتهم على الهدف إلى Pd.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1086">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">Confocal laser scanning microscope (CLSM)</td>
			<td style="width:176px;">Zeiss</td>
			<td style="width:268px;">LSM5</td>
			<td style="width:349px;">Any CLSM with similar capabilities is appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zen software for confocal microscope imaging</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>2009 version</td>
			<td>The software should be compatible with the CLSM used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quickchange II site-directed mutagenesis kit&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MES</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>69892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringes without needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectinomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of plasmodesmal localization sequences in proteins in planta

Plasmodesmata (Pd) هي خلية إلى الاتصالات التي تعمل كبوابات تنقل من خلالها الجزيئات الصغيرة والكبيرة بين الخلايا النباتية. بينما النقل Pd من جزيئات صغيرة، مثل الأيونات والماء، المفترض أن يحدث مكتوفي الأيدي، نقل خلية إلى خلية من الجزيئات البيولوجية الكبرى، مثل البروتينات، يحدث على الأرجح عبر إليه نشطة تتضمن إشارات محددة تستهدف في نقل جزيء. ندرة plasmodesmata التي تم تحديدها (Pd) ترجمة الإشارات (PLSs) قد مقيدة بشدة فهم الفرز البروتين مسارات تشارك في زرع خلية إلى خلية الجزيئات النقل والاتصالات. من ثروة النباتات البروتينات الذاتية والفيروسية المعروفة لحركة المرور من خلال Pd، PLSs ثلاثة فقط أبلغ حتى الآن، كل منهم من البروتينات النباتية الذاتية. وبالتالي، من المهم وضع استراتيجية تجريبية موثوقة ومنهجية لتحديد تسلسل الثابتة والمتنقلة فنية، التي ضرورية وكافية لاستهداف Pd، مباشرة في المعيشة الخلايا النباتية. هنا، يمكننا وصف واحد مثل هذه الاستراتيجية كنموذج باستخدام حركة الخلية للخلية البروتين (MP) فيروس تبرقش التبغ (TMV). هذه التجارب، التي حددت ووصفت الأول النباتية الثابتة والمتنقلة الفيروسية، ويمكن تكييفها لاكتشاف تسلسل الثابتة والمتنقلة في البروتينات الأكثر استهدافاً Pd.

بيانات تمثيلية، إخلاص توضح النتائج المتوقعة من البروتوكولات وصف وتحديد "النائب تمف المتنقلة"، مقتبسة من يوان et al. 21-ويوجز الشكل 1A أولاً ثوابت رئيسية معربا عن كامل طول "تمف النائب" (1-268)، تمف النائب الثابتة والمتنقلة (التي تضم بقايا الأحماض الأمينية أول 50 من البروتين، 1-50)، والأنين المسح مشتقات V4A تنصهر فيها الحركة (التي تم إنشاؤها ك ووصف في "الخطوات 2-2"، 5-2 و 6) حين يلخص الشكل 1B ويوضحها توطين هذه البروتينات المعلمة سوبسيلولار. ويوضح الشكل 1 مميزة الطرفية الشروريه Pd التعريب أنماط لاحظ للنائب تمف-الحراجية المعتمدة وعن تمف النائب الثابتة والمتنقلة-الحراجية المعتمدة، وكذلك فيما يتعلق بعلامة Pd كويكسبريسيد، PDCB1-DsRed2 (راجع الخطوة 5، 1). يوضح الشكل 2 ألف Pd استهداف تمف النائب-الحراجية المعتمدة وتوزيع تمف النائب الثابتة والمتنقلة-الحراجية المعتمدة ونوكليوسيتوبلاسميك كويكسبريسيد DeRed2 الحرة (راجع الخطوة 5، 1). وأخيراً، يوضح الشكل 2B فقدان Pd استهداف "النائب تمف" و "تمف النائب الثابتة والمتنقلة" مع استبدال ألانين واحد V4A، مشيراً إلى أن هذه البقايا هامة للبنية الثابتة والمتنقلة أو وظيفة؛ في نفس الخلايا علامة Pd كويكسبريسيد PDCB1 لا يزال يموضع إلى Pd (راجع الخطوة 6).
وتوضح هذه البيانات أن هذا الإجراء بسيطة نظرياً وتقنياً للإنتاج المنتظم لشظايا البروتين، والانصهار إلى بروتين علامة شحن أوتوفلوريسسينت، واختبار للقدرة على ترجمة إلى Pd يمكن تحديد تسلسل بروتين الحد الأدنى ضرورية وكافية لشعبة المشتريات الاستهداف، أي، الثابتة والمتنقلة. للحصول على التفسير الصحيح لهذه البيانات ومسلم، من الأهمية بمكان القيام بتجارب كولوكاليزيشن مع بروتين Pd معروفة، مثلاً، ريماند أو بدكب أفراد الأسرة16،23 أو واحدة من المصنع النواب الفيروسي هذا النوع إلى Pd44 . ومن الواضح أن ليس لديه كولوكاليزيشن أن تكون كاملة، لا جميع البروتينات إضفاء الطابع المحلي ف قد تستهدف Pd نفس، ولكن درجة يعتد بها إحصائيا من كولوكاليزيشن مع واحد على الأقل من البروتينات ماركر Pd ضروري لتحديد النشاط الثابتة والمتنقلة.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55301/55301fig1.jpg"> رقم 1: تحديد النائب تمف مخولين (أ) موجز بنيات الحراجية المعتمدة-الانصهار الرئيسية المستخدمة لتحديد مربعات متواليات، الأخضر "تمف النائب مخولين تمف النائب"؛ الحراجية المعتمدة، مربعات زرقاء؛ ف، والمروج؛ T, فاصل. تشير الأرقام على اليسار إلى مخلفات الأحماض الأمينية المدرجة في كل جزء "تمف النائب". (ب) ملخص للتعريب سوبسيلولار البروتينات الانصهار المبينة في (أ). Pd الترجمة أو التعريب نوكليوسيتوبلاسميك مصممة استناداً إلى إضفاء الطابع المحلي على علامات المقابلة سوبسيلولار، PDCB1-DsRed2 والحرة DsRed2، على التوالي. ويبين النسبة المئوية للخلايا العارضة كل نمط التعريب استناداً إلى سجل خلايا تعرب عن 100 الواحدة في ثلاث تجارب مستقلة بناء. البيانات هي ± يعني الأخطاء المعيارية (جنوب شرق). (ج) Pd استهداف تمف النائب-الحراجية المعتمدة والثابتة والمتنقلة النائب تمف-الحراجية المعتمدة، وعلامة Pd PDCB1-DsRed2. إشارة الحراجية المعتمدة باللون الأزرق؛ إشارة DsRed2 في الأرجواني؛ وقد تخرج البلاستيديه أوتوفلوريسسينسي. الصور هي واحدة من الأقسام [كنفوكل]. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون. DIC، تدخل فرق تباين صورة مجهرية. وهذا الرقم مقتبس من يوان et al. 21- <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55301/55301fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55301/55301fig2.jpg"> رقم 2: Pd استهداف النائب تمف تمف النائب الثابتة والمتنقلة وبهم طفرات المسح ألانين. (أ) الترجمة سوبسيلولار تمف النائب-الحراجية المعتمدة، والنائب تمف الثابتة والمتنقلة-الحراجية المعتمدة، وعلامة نوكليوسيتوبلاسميك DsRed2. (ب) الخسارة من Pd تستهدف قدرة طفرات المسح ألانين V4A تمف النائب-الحراجية المعتمدة والثابتة والمتنقلة النائب تمف-الحراجية المعتمدة. وقد تصور Pd من كوكسبريشن علامة Pd PDCB1-DsRed2. إشارة الحراجية المعتمدة باللون الأزرق؛ إشارة DsRed2 في الأرجواني؛ وقد تخرج البلاستيديه أوتوفلوريسسينسي. الصور هي واحدة من الأقسام [كنفوكل]. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون. DIC، تدخل فرق تباين صورة مجهرية. وهذا الرقم مقتبس من يوان et al. 21- <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55301/55301fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta at JoVE.com

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

الاتصالات بين الخلايا النباتية، plasmodesmata (Pd)، تلعب الأدوار المركزية في مصنع التفاعلات فسيولوجيا ومصنع للفيروسات. يتم فرز الحرجة للنقل Pd الإشارات التي توجه البروتينات للمشتريات. غير معرفتنا في تسلسل هذه لا تزال في مهدها. يصف لنا استراتيجية لتحديد إشارات التعريب Pd في البروتينات المستهدفة Pd.

تحديد تسلسل التعريب بلاسموديسمال في البروتينات في بﻻنتا

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

identification-plasmodesmal-localization-sequences-proteins

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

8.2K Views.  State University of New York. الاتصالات بين الخلايا النباتية، plasmodesmata (Pd)، تلعب الأدوار المركزية في مصنع التفاعلات فسيولوجيا ومصنع للفيروسات. يتم فرز الحرجة للنقل Pd الإشارات التي توجه البروتينات للمشتريات. غير معرفتنا في تسلسل هذه لا تزال في مهدها. يصف لنا استراتيجية لتحديد إشارات التعريب Pd...

Video: Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

الاستدلال الوراثي من HIV - 1 Tropism باستخدام السكان على أساس تسلسل V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

تصور فيروس حمى الضنك من خلال وصفها اليكسا فلور

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

الخلايا الدبقية الصغيرة زراعة من الجهاز العصبي المركزي حديثي الولادة والكبار

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells and can be further modified to visualize other components in the cell such as infection with viruses and bacteria. Spatial localization and visualization of viruses and bacteria during the infection process is an essential step that complements expression profiling experiments such as microarrays and RNAseq in response to different stimuli. Understanding the spatiotemporal infections with these agents complements biological experiments aimed at understanding their interaction with cellular components. Several techniques for visualizing viruses and bacteria such as reporter gene systems or immunohistochemical methods are time-consuming, and some are limited to work with model organisms&#160;and involve complex methodologies. FISH that targets RNA or DNA species in the cell is a relatively easy and fast method for studying spatiotemporal localization of genes and for diagnostic purposes. This method can be robust and relatively easy to implement when the protocols employ short hybridizing, commercially-purchased probes, which are not expensive. This is particularly robust when sample preparation, fixation, hybridization, and microscopic visualization do not involve complex steps. Here we describe a protocol for localization of bacteria and viruses in insect and plant tissues. The method is based on simple preparation, fixation, and hybridization of insect whole mounts and dissected organs or hand-made plant sections, with 20 base pairs short DNA probes conjugated to fluorescent dyes on their 5&#39; or 3&#39; ends. This protocol has been successfully applied to a number of insect and plant tissues, and can be used to analyze expression of mRNAs or other RNA or DNA species in the cell.

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

We describe here a simple fluorescence in situ hybridization (FISH) method for the localization of viruses and bacteria in insect and plant tissues. This protocol can be extended for the visualization of mRNA in whole mount and microscopic sections.

مضان<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH) لتوطين الفيروسات والبكتيريا Endosymbiotic في النبات والحشرات مناديل

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

باستخدام نيون البروتينات إلى تصور وQuantitate<em&gt; الكلاميديا</em&gt; فجوة النمو حيوية في الخلايا الحية

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

التعرف السريع على البكتيريا سالبة الجرام من ثقافة الدم في مرق عن طريق MALDI-TOF الطيف الكتلي

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

تنقية الحمض النووي الفيروسي للتعرف على البروتينات الفيروسية والخلوية المرتبطة بها

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been successfully used for identification of protein-protein interactions (PPIs) in mammalian cells. However, requirements of toxic hydrogen peroxide (H2O2) in APEX-based PL, longer incubation time with biotin (16&#8211;24 h), and higher incubation temperature (37 &#176;C) in BioID-based PL severely limit their applications in plants. The recently described TurboID-based PL addresses many limitations of BioID and APEX. TurboID allows rapid proximity labeling of proteins in just 10&#8201;min under room temperature (RT) conditions. Although the utility of TurboID has been demonstrated in animal models, we recently showed that TurboID-based PL performs better in plants compared to BioID for labeling of proteins that are proximal to a protein of interest. Provided here is a step-by-step protocol for the identification of protein interaction partners using the N-terminal Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain of the nucleotide-binding leucine-rich repeat (NLR) protein family as a model. The method describes vector construction, agroinfiltration of protein expression constructs, biotin treatment, protein extraction and desalting, quantification, and enrichment of the biotinylated proteins by affinity purification. The protocol described here can be easily adapted to study other proteins of interest in Nicotiana and other plant species.

Described here is a proximity labeling method for identification of interaction partners of the TIR domain of the NLR immune receptor in Nicotiana benthamiana leaf tissue. Also provided is a detailed protocol for the identification of interactions between other proteins of interest using this technique in Nicotiana and other plant species.