ونود أن نشكر تل ناوي ومارتن باير لنصائحهم على العزلة الجنين. MTR، VG، UG وCB ابتكر أجهزة العزلة الجنين. وضعت MTR، VG وCB بروتوكول العزلة الجنين. أنشئت MTR، VG وCB البروتوكول، عزل الأجنة، والجنين ولدت [كدنا]، ينجز VG على JJ PCR، MTR تلطيخ المكتب المركزي للاحصاءات، والتجارب على الأسماك. MTR، VG، CG وUG كتب مخطوطة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل جامعة زيوريخ، وزمالة من مؤسسة أبحاث روش (لMTR)، والمنح المقدمة من المؤسسة السويسرية الوطنية (لUG وCB).

وتتلخص الإجراء في المخطط الانسيابي هو مبين في الشكل 1. يتم عرض microcapillaries والإعداد فعال في الشكل 2 والشكل 3، ويتم عرض خطوات نموذجية من العزلة الجنين في الشكل 4. 1. المواد وإعداد الواق 1.1 سيليكون طلاء الزجاج microcapillaries <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع microcapillaries في 15 مل أنبوب فالكون مع ~ 5 مل من Sigmacote (سيغما) وعكس عدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحل، وضع أنبوب فالكون يحتوي على الشعيرات الدموية في رقائق الألومنيوم ويخبز لهم لمدة 3 ساعة على 60 درجة مئوية. تخزين في درجة حرارة الغرفة. </li></ol> 1.2 ~ 50-100 ميكرون الحصول قطرها نصائح microcapillary <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب 1 مم القطر الزجاج الشعيرات الدموية إما يدويا على الموقد بنسن أو باستخدام ساحبة التجارية (العمودي خيوط ساحبة أو مجتذب micropipette). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الماسالقلم غيض أو شفرة لقطع غيض من سحبت الشعرية لخلق افتتاح المرجوة. حدد على شكل أفضل الشعيرات الدموية تحت المجهر ستيريو. وينبغي أن يكون افتتاح 50-100 ميكرون (الشكل 2). </li></ol> 1.3 إعداد الشرائح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Siliconize الشرائح نظيفة من خلال تغطية جميع الآبار مع Sigmacote (~ 1 مل / الشريحة) لمدة 5 دقائق، وإزالة. خبز 3 ساعة في رقائق الألومنيوم. تخزين في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل متعددة أيضا شرائح زجاجية مجهرية لمدة 10 دقيقة في 10٪ SDS، 2 × 2 دقيقة في nuclease خالية من المياه (تعقيمها DEPC-ده 2 O)، 2 دقيقة في الايثانول 70٪، 2 دقيقة في الإيثانول بنسبة 100٪، والهواء تجف. تتم جميع الخطوات في الجرار Coplin تعقيمها. الشرائح ويمكن إعادة استخدامه عدة مرات توفير تنظيف شامل بين كل استخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فقط قبل الجنين انتشار العزلة ~ 0.5 ميكرولتر من 10 ملغ / مل ألبومين المصل البقري (BSA) مع ماصة على سطح كامل من كل بئر والهواء الجاف. </li></ol> 1.4 المجهر والإعداد الشعرية &lt;OL&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مجهر مقلوب مع 10X 20X الهدف والتكبير. تحسين النقيض من الضوء (أجنة شفافة تماما). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مياداة مجهرية لعقد الزجاج الشعرية بجوار المجهر. يتم توصيل الزجاج الشعرية إلى microinjector (الشكل 3A) أو إلى العادية P-200 ماصة عن طريق أنبوب من المطاط (الشكل 3B، انظر المناقشة للحصول على وصف مفصل لهذا الإعداد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الشعرية فوق شريحة المجهر في زاوية ~ 70 درجة (الشكل 3) وضبط الموقف أن يكون فتحة في مجال الرؤية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبيل العزلة الجنين يستغرق والافراج ~ 5-10 ميكرولتر BSA (1 ملغ / مل) لمعطف الشعرية. </li></ol> 1.5 المخازن المؤقتة يسرد الجدول 1 العزلة والمقصد مخازن بالاعتماد على التطبيقات المصب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ~ 1 مل العازلة العزلة لكل عينة استخدام طازجة قبل وابقائه على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المخزن المؤقت الوجهة في مل أنبوب إيبندورف 0.5 ملزم منخفض على الجليد (تطبيقات الجزيئية) أو على شريحة المجهر (تطبيقات الخلوي) في غرفة رطبة. </li></ol> 2. تشريح البذور واستخراج الأجنة 2.1 المزامنة من تطوير البذور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> إضعاف الزهور والاحتفاظ بها 2 أيام في غرفة النمو مع تجنب الاتصال من المدقات يتعرض مع غيرها من الزهور، ثم تلقح لهم (على سبيل المثال 11). </li><li class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> اختبار تلك المرحلة من التطور في ظل ظروف النمو الخاص بك عن طريق التحقيق المجهرية من البذور تطهيرها. مع ظروف النمو لدينا (16 ساعة ضوء في 21 ° C، 8 ساعة مظلمة عند 18 درجة مئوية والرطوبة 70٪) جمع البذور 2.5 أيام بعد التلقيح (DAP) أسفرت أساسا 2-4 أجنة الخلية والبذور التي تم جمعها 3،5-4 DAP أسفرت كروي الأجنة. </li></ol> 2.2 تشريح البذور وتمزق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الصورةeeds 10-15 siliques (~ 2.5 DAP) تحت stereomicroscope مع ملقط وإبر الأنسولين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج البذور في 20 ميكرولتر العازلة العزلة في 2 مل جولة القاع أنبوب إيبندورف وضعت على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحق بلطف البذور مع مدقة البلاستيك (قبل تنظيفها مع 10٪ SDS، تشطف مع DEPC-ده 2 O وغسلها مع الايثانول 70٪) للافراج عن الأجنة حتى استخراج البذور هو غائم. القوة لتقديم الطلبات هو يحدده كل مستخدم على المحاكمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مدقة مع 300 ميكرولتر من العازلة العزلة لغسل مدقة وتمييع العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار استخراج في 5،000 x ج لمدة 5 ثوانى. resuspend بلطف استخراج مكعبات من قبل pipetting صعودا ونزولا 2-3 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد استخراج مع شبكة من النايلون 30 ميكرومتر (التي شنت على محولات أنبوب، على سبيل المثال من PartecCelltricks). شطف شبكة مع 200 العازلة ميكرولتر إضافية العزلة. </li></ol> 3. عزل الجنين 3.1 إعداد الشرائح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"> &lt;لى&gt; مكان نظيف والشرائح المتعددة جيدا BSA المغلفة وsiliconized على مسرح المجهر المقلوب، resuspend واستخراج البذور تمت تصفيتها من قبل pipetting بلطف صعودا ونزولا وماصة 2 قطرات من 40-50 ميكرولتر استخراج البذور في 1 أو 2 الآبار . فحص فقط 1 أو 2 قطرات في وقت يمنع التبخر من العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان 50 ميكرولتر من العازلة العزلة الطازجة (1 شارع انخفاض غسل) في بئر من شريحة مختلفة أعدت كما كان من قبل. إبقاء هذه الشريحة في غرفة تجارة وصناعة المغطاة الرطبة لمنع التبخر. </li></ol> 3.2 الشاشة، وتنظيف، وجمع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص قطرات من استخراج البذور من أجل أجنة في مرحلة المطلوب مع هدف التكبير 10x. إذا لزم الأمر، تأكيد المسرح مع التكبير 20X. الأجنة عادة تنزل الى القاع من الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة يدويا الحطام حول الجنين مع إبرة التنغستن، إبرة الأنسولين أو معدات مماثلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الزجاج الشعرية بالقرب من جنين باستخدام مياداة مجهرية، رأك يصل الجنين مع كحل أقل قدر ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع العديد من الأجنة (على سبيل المثال كل من القطيرات واحدة) وإطلاق سراحهم في 1 شارع انخفاض غسل (تطبيق الجزيئية) أو في المخزن المؤقت الوجهة (تطبيقات الخلوي). يجب أن تبقى كل جولة جمع في غضون 5-10 دقيقة وينبغي جمع الأجنة في حجم الحد الأدنى (الحجم الكلي للجميع الجولات جمع يجب أن يكون &lt;5 ميكرولتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار الفحص وجمع حتى يتم جمع المبلغ المطلوب من الأجنة في 1 شارع انخفاض غسل (مركزيا، إذا كان ذلك ممكنا، لتسهيل تذكر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتذكر جميع الأجنة في آن واحد من قطرة غسل (إذا نفذت أكثر من الحطام، إزالتها بإبرة قبل تذكر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإفراج عن الأجنة إلى قطرة غسل الثانية 2 من 50 ميكرولتر. كرر 3.2.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإفراج عن الأجنة في المخزن المؤقت الوجهة. نقل وينبغي أن تشمل فقط الاتصال، وليس الغمر، من طرف الشعرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال microcapilلاري للعينة القادمة. </li></ol>

<ol>
	<li>Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+demethylation+of+repetitive+elements+during+seed+development+underlies+gene+imprinting.">Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting.</a> Science. 324, 1447-1451 (2009).</li><li>Muller, B., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinin+and+auxin+interaction+in+root+stem-cell+specification+during+early+embryogenesis.">Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis.</a> Nature. 453, 1094-1097 (2008).</li><li>Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+parent-of-origin+allelic+expression+in+Arabidopsis+thaliana+seeds.">Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds.</a> PLoS One. 6, 23687-23 (2011).</li><li>Xiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+gene+expression+and+metabolic+network+dynamics+during+embryo+development+in+Arabidopsis.">Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).</li><li>Nawy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GATA+factor+HANABA+TARANU+is+required+to+position+the+proembryo+boundary+in+the+early+Arabidopsis+embryo.">The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo.</a> Dev Cell. 19, 103-113 (2010).</li><li>Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+triploid+endosperm+genome+of+Arabidopsis+adopts+a+peculiar,+parental-dosage-dependent+chromatin+organization.">The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization.</a> Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).</li><li>Autran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+epigenetic+pathways+control+parental+contributions+to+Arabidopsis+early+embryogenesis.">Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis.</a> Cell. 145, 707-719 (2011).</li><li>Wohrmann, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+DNA+methylation-independent+imprinting+control+region+at+the+Arabidopsis+MEDEA+locus.">Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus.</a> Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).</li><li>Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+Flexibility+of+Genomic+Imprinting+during+Seed+Development.">Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development.</a> Plant Cell. 23, 16-26 (2011).</li><li>Rea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+DNA+methylation+of+imprinted+genes+in+Arabidopsis+endosperm.">Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm.</a> J. Vis Exp. 47 (47), e2327 (2011).</li><li>Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+WOX+genes+mediates+apical-basal+axis+formation+in+the+Arabidopsis+embryo.">Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo.</a> Dev Cell. 14, 867-876 (2008).</li><li>Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+thaliana+MEDEA+Polycomb+group+protein+controls+expression+of+PHERES1+by+parental+imprinting.">The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting.</a> Nature. 37, 28-30 (2005).</li><li>Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interphase+chromosomes+in+Arabidopsis+are+organized+as+well+defined+chromocenters+from+which+euchromatin+loops+emanate.">Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).</li><li>Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+single+cells.">Transcriptome analysis of single cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2634 (2011).</li><li>Nodine, M. D., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+and+paternal+genomes+contribute+equally+to+the+transcriptome+of+early+plant+embryos.">Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos.</a> Nature. 482 (7383), (2012).</li><li>Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fusions:+beta-glucuronidase+as+a+sensitive+and+versatile+gene+fusion+marker+in+higher+plants.">fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.</a> EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).</li><li>Schmidt, A., W&#246;hrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polycomb+group+protein+MEDEA+and+the+DNA+methyltransferase+MET1+interact+in+Arabidopsis+to+repress+autonomous+endosperm+development.">The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development.</a> Plant J. 73 (5), (1111).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

وضعنا بروتوكولا العزلة الجنين الذي هو سريع، فعال، ويمكن نقلها بسهولة إلى مختبرات أخرى. المعدات وصفها هنا يتكون من مجهر مقلوب، وهو مياداة مجهرية، زجاج microcapillaries، مجتذب خيوط الرأسي وmicroinjector (الشكل 3A). الإعداد هو مماثلة لتلك التي وصفها لاحد العزلة الخلية الحيوانية لتحاليل transcriptomics 17. كما عملنا بنجاح مع إعداد أكثر الأساسية حيث امتدت الزجاج microcapillaries يدويا فوق لهب (وقطع مع الماس شفرة) وتشغيلها عن طريق مختبر ماصة القياسية (Pipetman P-200) بدلا من microinjector (الشكل 3B). في هذه الحالة كان يعلق على microcapillary إلى ماصة عن طريق أنبوب من المطاط. واستخدمت 10 filtertips ميكرولتر لجعل التقاطعات، التي كانت ملفوفة مع parafilm لجعلها محكمة الغلق. الشعرية - التي تحتفظ بها غيض ماصة - تم إصلاح على ميكرذراع omanipulator باستخدام كتل البوليسترين والشريط (الشكل 3B). أثبت هذا الإعداد الأساسي لتكون فعالة وموثوق بها 8. ومع ذلك، كان واحدا من أهم الصعوبات في الحفاظ على تقاطعات محكمة الغلق بين microcapillary وماصة، خاصة عند تغيير الشعرية. التحقق وضبط الضغط في الشعيرات الدموية - لضمان جمع الأجنة صقلها في حجم الحد الأدنى - يمكن أن يكون مضيعة للوقت باستخدام هذا الإعداد الأساسي. تحسين الإعداد مع مياداة مجهرية التحكم هيدروليكيا وساحبة خيوط العمودي هو تحسنا كبيرا ويوفر الوقت. المهارات اللازمة لنجاح تطبيق هذه الطريقة قابلة للتحويل بسهولة. خمسة مستخدمين في مختبرنا علمت بنجاح الأسلوب في وقت قصير نسبيا. بعض التبسيط من البروتوكول هي اعتمادا ممكن على سهولة للمستخدم في التلاعب. على سبيل المثال، فمن الممكن لتخطي الخطوات 2.2.5 2.2.6 وبينماتشريح فقط 5 siliques (بدلا من 15) وتنظيف المناطق المحيطة بها الجنين بدقة من الحطام مع إبرة التنغستن (تم تطبيق هذا الإجراء في 8). التزامن من تطوير البذور من خلال خصاء وتأخر التلقيح هو اختياري ولكن الموصى بها لزيادة عدد الأجنة في هذه المرحلة التنموية نفسها، ولا سيما في المراحل المبكرة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن التعجيل العزلة الجنين إذا تم حذف غسل الخطوات، على سبيل المثال للتطبيقات الخلوي. وعلاوة على ذلك، siliconization الشريحة (الخطوة 1.3.2) ليس من الضروري للمستخدمين العمل بسرعة، مثل أن الأجنة التي تلتصق على سطح الزجاج مع مرور الوقت ليست مشكلة. سواء الترشيح أو يتم تطبيق التنظيف اليدوي، فمن المهم للغاية لتجنب المرحل من الحطام الأنسجة التي تخلق التلوث المحتمل للRNA المصب أو تطبيقات الحمض النووي. وقد أثيرت هذه المسألة مؤخرا في دراسة التنميط Transcriptome على استخدام أسلوب مختلف من العزلة الجنين18. على النقيض من ذلك إلى الجزء الأكبر بروتوكول العزلة الجنين هو موضح هنا، والكتاب تشريح الأجنة نبات الأرابيدوبسيس يدويا من داخل البذور الفردية باستخدام إبر دقيقة، والإجراءات المطولة التي تتطلب مهارات تشريح ممتازة. هذا الإجراء يتطلب على ما يبدو 2 أو أكثر من يغسل لتجنب المرحل من الممكن الخلايا الملوثة من الأنسجة المحيطة البذور، وهو وضع من المرجح مصادفة عند استخدام هذه الطريقة نظرا لصغر حجم الأجنة، والصعوبات في الوصول إليها مع الإبر تشريح، والإلتصاق من الخلايا المحيطة بها. على النقيض من ذلك، لدينا الإجراء يسمح (ط) التخفيف من الأجنة في مقذوف من البذور على سحق والمحيطة الحطام في حجم كبير (500 ميكرولتر) قبل جمع الأجنة، (الثاني) اختيار البصرية للأجنة خالية من مادة لاصقة، وتلويث الحطام، و (ثالثا) التخفيف من تلوث ممكن RNA-تسرب من تمزق الخلايا عن طريق الخطوات الغسيل. في حين أنه من الممكن لاستخدام واحد فقط الخطوة غسل إذا كانتظهر الأجنة نظيفة جدا ويتم جمعها في أقل من 5 ميكرولتر 8، خطوة غسل الثاني هو الموصى بها، وخاصة بالنسبة للمستخدمين لأول مرة قد جمع الأجنة في عدة جولات (أي مع حجم المضافة). وينبغي جمع الأجنة في كحل أقل قدر ممكن، والسماح للتخفيف القصوى من الملوثات المحتملة في كل خطوة الغسيل. يجب أن تبقى كل جولة جمع قصيرة (في غضون 5-10 دقيقة) للسماح أقصى الانتعاش على الإطلاق في انخفاض غسل (وجود أطول في شعري يميل إلى تقليل معدل الاسترداد). وعلاوة على ذلك، ينبغي نقل الأجنة التي تم جمعها في بيئة مستخلص (اتباع الخطوات غسل) تنطوي فقط على الاتصال مع افتتاح غيض microcapillary وليس الغمر من غيض، لأن ذلك قد نقل كذلك الحطام الشائكة على الجدار فوق microcapillary افتتاح. وأخيرا، فإن الشعرية ينبغي تغييرها بين كل مستخلص بذور جديدة. لدينا بروتوكول يسمح لعدة هبوطاتطبيقات tream ببساطة عن طريق استخدام وجود مخزن مؤقت العزلة المناسبة التي تحافظ على سلامة الجزيئية من الحمض النووي الريبي والحمض النووي، لونين، مراسل انزيم أو الفلورسنت. نحن معزولة بنجاح الأجنة في عازلة عزل الحمض النووي الريبي واقية لاستخراج الحمض النووي الريبي وتحليلات transcriptomics 8، 1X العازلة TE-لتحليلات الحامض النووي 9، مخزنة 100 ملي الفوسفات المالحة (PBS) للأسماك والمناعية (Jaenisch، Grossniklaus وBaroux، غير منشورة، الشكل 5C)، وحل تلطيخ دون الركيزة لفحوصات مراسل المكتب المركزي للاحصاءات (19، الشكل 5B). التطبيق الأكثر حساسية للظروف العزلة / نوعية الجنين هو بالتأكيد استخراج الحمض النووي الريبي والتضخيم. كانت كمية الحمض النووي الريبي المستخرج من أجنة معزولة منخفضة نوعا ما. من ~ 30 الأجنة في مرحلة الخلية 2-4 (وبالتالي 60-120 الخلايا في الكل) قدرنا مبلغ ~ 1NG من الحمض النووي الريبي مجموع يعتمد على كلا 2100 اجيلنت Bioanalyzer (اجيلنت تكنولوجيز) وو qubit القياسات (إينفيتروجن). Followiنانوغرام استخراج الحمض النووي الريبي، تم التحقق من الحمض النووي الريبي جودة على الحمض النووي الريبي اجيلنت 6000 رقاقة بيكو (اجيلنت تكنولوجيز). ومع ذلك، فإن كمية قليلة من الحمض النووي الريبي المستخرج ليست دائما كافية لإنتاج الملف الشخصي موثوق بها. وبالتالي، يجب أن يتم إجراء مزيد من التجارب على المواد تضخيم ([كدنا]) (مثل PCR الكشف التي تبديها منخفضة، جينات الجنين محددة و / أو الشخصي Bioanalyzer). وأخيرا، القدرة على عزل الأجنة وفقا لمعايير البصرية في بروتوكول لدينا هو ميزة كبيرة. الأجنة من نفس silique (فاكهة نبات الأرابيدوبسيس) لا تتطور بشكل متزامن. وهكذا، والعمل على مقتطفات silique كله (على سبيل المثال لتحليل RT-PCR أو المقايسات مراسل الكمي) لا يسمح وجود علاقة مثالية مع المرحلة التنموية معين. عزل الأجنة في مرحلة تنموية محددة يحل هذه المشكلة. وبالإضافة إلى ذلك، يطرح مشكلة مماثلة عند العمل مع المسوخ متخالف حيث تحتوي siliques المورثات الجنين مختلفة. عزل الأجنة بناء على معايير البصرية لدistinguish على سبيل المثال من النوع البري من الظواهر الجنين متحولة يسمح ربط التحليلات المصب مع التركيب الوراثي. ولقد فعلنا ذلك بنجاح لتحليل الحامض النووي في مواضع محددة في المورثات مختلفة 20.

ويحيط الجنين من النباتات المزهرة من السويداء، والأنسجة الغذائية المستمدة من حدث الإخصاب الثانية. ويحيط كل من الجنين والسويداء من قبل عدة طبقات الخلية من معطف البذور. هذه الأنسجة بشكل جماعي تشكيل البذور، التي تنمو داخل الفاكهة. وبالتالي، يعانون من ضعف الأنسجة وتحليلات خلية محددة من الأجنة نبات الأرابيدوبسيس بشدة بسبب عدم إمكانية الوصول لها. ومع ذلك، الأجنة في المراحل المتأخرة كروي أو في وقت لاحق نسبيا قابلة جيدا لتشريح اليدوي باستخدام الإبر التنغستن غرامة بموجب stereomicroscope، أو عن طريق تطبيق ضغط طفيف على البذور باستخدام ملقط لاستخراجها. واستخدمت هذه التقنيات بنجاح لTranscriptome على تحليلات أو التنميط epigenome مثل تهجين ميكروأري، التسلسل بيسلفيت، أو الحمض النووي الريبي التسلسل (على سبيل المثال 1-3). في المقابل، دراسات الأجنة في البيضة الملقحة إلى مرحلة كروية في وقت مبكر تظل تحديا تقنيا. حتى الآن، سوى عدد قليل من الدراسات لديهم معدل تقييمتحليلات Transcriptome على orted على الأجنة الشباب باستخدام إما تسليخ مجهري التقاط الليزر (LCM) من الأنسجة الجنينية من أقسام البذور ثابت 4 أو استخراج دليل من الأجنة الفردية من داخل البذور باستخدام أدوات غرامة 5. ومع ذلك، معدات LCM لا تتوفر عادة واستخراج الجنين دليل في مراحل مبكرة وقتا طويلا وتتطلب مهارات تشريح الممتازة التي هي غير قابلة للتحويل بسهولة. بالإضافة إلى تحليل الجينوم واسعة، الموقع التحليلات التعبير الجيني في هي أيضا من الصعب تنفيذها على الشباب والأجنة كله يشن من نبات الأرابيدوبسيس. إلى حد ما، يمكن الإفراج الأجنة الشباب على شرائح المجهر من قبل ضغط لطيف على البذور واستخدامها لمراسل المقايسات الجين أو البروتين عن طريق الكشف المناعية (انظر على سبيل المثال 6،7). هذا الأسلوب، ومع ذلك، لا يسمح العزلة الجنين عالية الإنتاجية، مما يعيق التحليل الكمي. لذلك، قمنا بتطوير بروتوكول فعالة وسريعةلعزل الجنين في وقت مبكر من بذور نبات الأرابيدوبسيس التي هي بسيطة لإعداد، للتحويل بسهولة، ومناسبة لمجموعة متنوعة من التطبيقات المصب. المبدأ الأساسي هو سحق بلطف البذور - تشريح من siliques الشباب في أنبوب إيبندورف باستخدام مدقة البلاستيك في وجود مخزن مؤقت العزلة المناسبة. يتم وضع استخراج البذور في قطرات على شريحة متعددة بشكل جيد ويتم فحص لوجود الأجنة صدر في مرحلة المطلوب باستخدام مجهر مقلوب. يتم جمع الأجنة باستخدام الزجاج microcapillary تعلق على microinjector أو ماصة المختبر القياسية. لتطبيقات الجزيئية، يتم غسلها مرتين من قبل الأجنة الإفراج المتكررة إلى قطرات من العازلة العزلة جديدة قبل نقلهم إلى المخزن المؤقت الوجهة في حجم الحد الأدنى. للتطبيقات الخلوي (المقايسات مراسل، المناعية، FISH)، يمكن حذف غسل الخطوات. الأسلوب يوفر العديد من المزايا: (ط) لأنها تعود 25-40 الأجنة في ~ 45 دقيقة عن التطبيق الخلويlications أو في 3-4 ساعة لتطبيقات الجزيئية (بما في ذلك الخطوات الغسيل)، (الثاني) أنها تتيح العزلة من المراحل الجنينية محددة، (الثالث) فمن السهل نقلها إلى الأشخاص ومختبرات أخرى بسبب الإعداد لها بسيطة، (الرابع) أنه يتطلب معدات متناول الإعداد الأساسية والتي هي قابلة للترقيات، و(V) قد تم استخدامه بنجاح لمختلف التطبيقات المصب مثل RNA تسلسل 8، تحليل الجينات المحددة DNA-مثيلة 9، المقايسات مراسل (10 و Raissig وآخرون، في الإعدادية.)، والأسماك (J. Jaenisch، U. Grossniklaus، C. Baroux غير منشورة، انظر الشكل 5).

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sigmacote</td>
 <td>SIGMA </td>
 <td>SL2-100 ml</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNAse OUT</td>
 <td>Invitrogen (life technologies)</td>
 <td>10777-019</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>First- strand buffer</td>
 <td>Invitrogen (life technologies)</td>
 <td>18064-022</td>
 <td>contained in Superscript II package</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Invitrogen (life technologies)</td>
 <td>18064-022</td>
 <td>contained in Superscript II package</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml </td>
 <td>New England Biolabs Inc.</td>
 <td></td>
 <td>Different suppliers will also work </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thin wall Capillaries 1.0 mm</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>TW100F-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNA LoBind tube 0.5 ml</td>
 <td>Vaudaux-Eppendorf</td>
 <td>0030108.035</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTrics&Delta; 30 &mu;m</td>
 <td>PARTEC</td>
 <td>04-0042-2316</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5wells 10 mm diameter slides</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>63421-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Formaldehyde Solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F1635</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Superfrost Plus slide</td>
 <td>Thermo Fisher</td>
 <td>J1800AMNZ</td>
 <td>Menzel-Gl&auml;ser</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris</td>
 <td>Amaresco</td>
 <td>0497</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Applichem</td>
 <td>A2937</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycin</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>50050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SDS pellets</td>
 <td>Roth</td>
 <td>CN30.3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Pestle</td>
 <td>VWR</td>
 <td>431-0094</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microfine insulin syringes</td>
 <td>BD</td>
 <td>U-100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEPC</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D5758</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol</td>
 <td>Schaurlau</td>
 <td>ET00102500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Forceps N5</td>
 <td>Dumont</td>
 <td>0108-5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bioanalyzer Pico Chip</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td>5067-1513</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted microscope</td>
 <td>Nikon TMS (Japan),</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micromanipulator</td>
 <td>Leitz</td>
 <td></td>
 <td>Leica</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micomanipulator Post mount LH1 probe</td>
 <td>Leica microsystems</td>
 <td>39430101</td>
 <td>Different brand will also do the work</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vertical filament puller</td>
 <td>Sutter instrument</td>
 <td>P-20 model</td>
 <td>Other model are also suitable </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell Tram vario</td>
 <td>Vaudaux-Eppendorf</td>
 <td>5176.000.033</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bioanalyzer</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td>2100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qubit Fluorometer</td>
 <td>Invitrogen (life technologies</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

efficient and rapid isolation of early-stage embryos from arabidopsis thaliana seeds

في النباتات المزهرة، الجنين يتطور داخل الأنسجة مغذية - السويداء - محاطة integuments البذور الأمهات (أو معطف البذور). ونتيجة لذلك، وعزل الأجنة النباتية في المراحل المبكرة (1 الخلية إلى مرحلة كروي) يمثل تحديا تقنيا بسبب عدم إمكانية الوصول النسبية. هو ضعف كفاءة تشريح دليل في المراحل الأولى بقوة من قبل صغر حجم بذور نبات الأرابيدوبسيس الشباب والإلتصاق من الجنين إلى الأنسجة المحيطة بها. هنا، نحن تصف طريقة التي تسمح للعزلة كفاءة الأجنة نبات الأرابيدوبسيس الشباب، مما أسفر حتى 40 الأجنة في 1 ساعة إلى 4 ساعات، اعتمادا على تطبيق المصب. يتم الإفراج الأجنة في عازلة العزلة عن طريق سحق البذور قليلا 250-750 مع مدقة البلاستيك في أنبوب إيبندورف. كوب microcapillary تعلق إما مختبر ماصة القياسية (عن طريق أنبوب المطاط) أو يتم استخدام microinjector التحكم هيدروليكيا لجمع الأجنة من مكان قطراتد على شريحة متعددة أيضا على ضوء المجهر المقلوب. المهارات الفنية المطلوبة هي بسيطة وقابلة للنقل بسهولة، والإعداد الأساسية لا تتطلب معدات مكلفة. الأجنة التي تم جمعها هي مناسبة لمجموعة متنوعة من التطبيقات المصب مثل RT-PCR، RNA تسلسل، تحليلات الحامض النووي، مضان التهجين في الموقع (FISH) في، المناعية، ومراسل المقايسات الجينات.

لدينا إجراء العزل الجنين (الشكل 1) يسمح العزلة لمدة تصل إلى 40 الأجنة في 4 ساعة إذا يتم تنفيذ يغسل، وعلى سبيل المثال لتطبيقات الجزيئية، أو في أقل من ساعة إذا تم حذف يغسل، على سبيل المثال للتطبيقات الخلوي. يعرض الشكل 2 العالية والمنخفضة نصائح microcapillary الجودة والشكل 3 يبين الإعداد من الجهاز العزلة الجنين. يعرض الشكل 4 عملية عزل الأجنة على مجهر مقلوب. طبقنا بنجاح إجراءاتنا لمختلف التطبيقات التي نشرت في عدة مقالات نشرت مؤخرا. وقد تم تطوير هذا الأسلوب أصلا لتحليل مساهمة الوالدين إلى Transcriptome على الجنينية المبكرة. تم عزل الأجنة الهجينة التي تتولد من خلال الصلبان بين اثنين من الانضمام نبات الأرابيدوبسيس مختلفة (ندسبرغ المقف (L إيه) وكولومبيا (COL-0)) في مرحلة الخلية 2-4. تم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع، [كدنا]أنتجت المكتبات باستخدام التضخيم الخطية والتسلسل على أرضية صلبة. تم إنشاء transcriptomes أليل محددة على أساس تحليل SNP 8. لسيطرتنا مكتبات [كدنا] الجنينية قبل التسلسل نحن تضخيم النصوص الجنين محددة، WUSCHEL-HOMEOBOX 2 و 8 و 9 (WOX2، WOX8، WOX9) وأكتين 11 (13،14، الشكل 5A). بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام هذا الأسلوب لعزل الأجنة الشباب لتحليل أنماط الحمض النووي الجنيني مثيلة في مواضع محددة في الجينوم. تم عزل الأجنة وغسلها في 1X TE-المخزن المؤقت. تم إجراء التسلسل بيسلفيت الصغيرة كما هو موضح 9،15. وبالمثل، فقد ثبت العزلة الجنين مفيدة جدا في فحوصات الجينات مراسل مع التعبير الجنينية منخفضة، وحيث يفند غلاف البذرة الأمهات الكشف أو من قبل ملثمين التعبير مراسل في الأنسجة المحيطة بها الجنين (السويداء، ومعطف البذور). الأجنة كار<html> يينغ التحوير مراسل هي الملون (ß غلوكورونيداز؛ المكتب المركزي للاحصاءات) أو تحليلها مباشرة (الأخضر أو ​​الأحمر بروتين الفلورسنت؛ GFP، RFP) بعد العزلة. ويرد مثال في الشكل 5B للأجنة معربا عن الجين مراسل المكتب المركزي للاحصاءات تحت سيطرة المروج MEDEA (ع MEA) 10. سهولة نسبيا مع العديد من الأجنة التي يمكن أن تكون معزولة كما يسمح للتحليل كمي (على سبيل المثال عدد من الأجنة ملطخة في خلفيات وراثية مختلفة، Raissig، Grossniklaus وآخرون. قيد الإعداد). وأخيرا، فإننا تطبيقها بنجاح نيون في الموقع التهجين (FISH) والتقنيات المناعية لدراسة الهندسة المعمارية النووية في الأجنة المعزولة جزءا لا يتجزأ من منصات الأكريلاميد على الشرائح. ويرد مثال من الأسماك باستخدام تحقيقات ضد يكرر السنترومير والمناطق تنظيم نويي في الشكل 5C. <html> 1 &quot;FO: محتوى العرض =&quot; 5IN &quot;FO: SRC =&quot; / files/ftp_upload/50371/50371fig1highres.jpg &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/50371/50371fig1.jpg &quot;/&gt; الشكل 1. الرسم البياني من إجراء العزل الجنين وينقسم البروتوكول في ثلاثة أجزاء: 1 - إعداد المواد؛ 2 - تشريح البذور؛ 3 - العزلة الأجنة. <img alt="الشكل 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50371/50371fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50371/50371fig2.jpg" /> الشكل 2. نصائح Microcapillary. A. نصائح microcapillary عالية الجودة مع افتتاح سلسة من حوالي 100 ميكرون. B. نصائح microcapillary ذات جودة منخفضة مع الانفتاح بشكل اوسع وكفاف غير النظامية (هذه النصائح مقبولة للتطبيقات الخلوي فقط). شريط النطاق: 2 مم. ghres.jpg &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/50371/50371fig3.jpg &quot;/&gt; الشكل (3). إعداد من العزلة المجهر الجنين. يتم تنفيذ A. B. والفرز على شرائح المجهر تحت مجهر مقلوب. يتم جمع الأجنة باستخدام الزجاج microcapillary ثابتة على micromanipulator للسيطرة على وجه التحديد موقفها (انظر أيضا الشكل 4) ومتصلا إما microinjector (A) أو معيار مختبر ماصة (B). A. ويرتبط زجاج microcapillary إلى التحكم هيدروليكيا ويرد microinjector (على سبيل المثال إيبندورف الخليوي الترام فاريو) لمراقبة دقيقة أثناء الجنين جمع B. الزجاج microcapillary في مستوى P-200 ماصة عن طريق أنبوب من المطاط المرن. يتم التحكم جمع الأجنة والإفراج عن طريق تحريك العجلة معايرة من ماصة. وتستخدم قطع نهاية ماصة نصائح والموصلات ويتم اغلاق التقاطعات مع parafilm. مييتم إصلاح crocapillary على مياداة مجهرية عبر كتل البوليسترين، وأنابيب فالكون والشريط. <img alt="الشكل 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50371/50371fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50371/50371fig4.jpg" /> الشكل 4. عملية عزل الجنين. A. A تم التعرف 2-4 الجنين الخلية (السهم) في استخراج البذور (قطيرة الفرز) وتحيط بها الحطام (شظايا غلاف البذرة). B. تمت إزالة الأنقاض المحيطة يدويا باستخدام إبرة. C. تم نقل الزجاج الشعرية حق بجوار الجنين (السهم). D. وقد تم جمع الأجنة والآن داخل الشعيرات الدموية (السهم). E. عدة أجنة في آخر قطرة بعد يغسل. نطاق = 50 ميكرون. <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/50371/50371fig5.jpg" /> F<html> igure 5. تطبيقات المصب من العزلة الجنين A. التحليلات التعبير الجيني: PCR التضخيم من WOX9، WOX2، WOX8 وACTIN11 13،14 في مكتبات [كدنا] (ولدت كما هو موضح 8) 2-4 أجنة الخلية غسلها 1X مرات (حارة 1) وعلى الجيني . الحمض النووي (حارة 2) B. فحص المراسل: الجنين 8 خلايا معزولة من النباتات تحمل ا ف ب MEA :: كانت ملطخة المكتب المركزي للاحصاءات بناء على شريحة في معيار حل تلطيخ المكتب المركزي للاحصاءات (مستنسخة من Raissig وآخرون، 2011 بعد الحصول على إذن من و. الخلية النباتية، ASPB حق المؤلف). C. نيون التهجين في الموضع (FISH): تم تهجين جنين 8 خلايا مع تحقيقات ضد يكرر القسيم المركزي (الحمراء)، ويكرر 45S rDNA (الخضراء) قبل مناعي غير المباشرة 16. تم مضافين الصور FISH ثنائي اللون مع counterstaining دابي والصور DIC (DM6000B المجهر epifluorescence، لايكا، ألمانيا). محتوى &quot;FO: المحافظة على together.within الصفحات =&quot; دائما &quot;&gt; <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> تطبيق </td><td> العازلة العزلة </td><td> المخزن المؤقت الوجهة </td></tr><tr><td> استخراج الحمض النووي الريبي (مثل التضخيم وtranscriptomics) </td><td> 1X العازلة الأولى ستراند (إينفيتروجن)، 1 ملم DTT، 4٪ RNAseOUT </td><td> العازلة استخراج الحمض النووي الريبي </td></tr><tr><td> استخراج الحمض النووي (على سبيل المثال لتسلسل بيسلفيت) </td><td> 100 ملي تريس، 10 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 8 (TE) </td><td> الحمض النووي استخراج العازلة أو 1X TE العازلة </td></tr><tr><td> تحليل مراسل GFP </td><td> 1 M Glycin في 0.5X MS 1 </td><td> 1 M Glycin في MS 0.5X </td></tr><tr><td> تحليل مراسل المكتب المركزي للاحصاءات </td><td> تلطيخ العازلة 2 بدون X-الحلاوة (الركيزة) </td><td> تلطيخ العازلة مع X-الحلاوة (الركيزة) </td></tr><tr><td> FISH والمناعية </td><td> 100 ملي الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) </td><td> تنشيط الاكريليك: مزيج Bisacryl (33:3) على Superfrost زائد الشريحة تبلمر لمدة 30 دقيقة </td></tr></tbody></table> الجدول 1. يمكن تكييفها العزلة وجهة المخازن المؤقتة للتطبيقات المصب مختلفة. المخازن المؤقتة لمتطلبات تجريبية محددة. 1 Murashig وسكوغ المتوسطة. 2 على سبيل المثال جيفرسون وآخرون، EMBO J. 6 (13)، 3901-3907 (1987).

Watch this Scientific Journal Video about Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds at JoVE.com

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

ونحن التقرير وسيلة فعالة وبسيطة لعزل الأجنة في المراحل الأولى من التطوير من<em&gt; thaliana نبات الأرابيدوبسيس</em&gt; البذور. ما يصل الى 40 الأجنة يمكن أن تكون معزولة في 1 ساعة إلى 4 ساعات، اعتمادا على تطبيق المصب. هذا الإجراء هو مناسبة لTranscriptome على، الحامض النووي، مراسل التعبير الجيني، المناعية ومضان<em&gt; في الموقع</em&gt; تحليلات التهجين.

العزلة الفعالة والسريعة من الأجنة المبكرة مرحلة من<em&gt; thaliana نبات الأرابيدوبسيس</em&gt; بذور

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

efficient-rapid-isolation-early-stage-embryos-from-arabidopsis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

17.7K Views.  University of Zürich. ونحن التقرير وسيلة فعالة وبسيطة لعزل الأجنة في المراحل الأولى من التطوير من thaliana نبات الأرابيدوبسيس البذور. ما يصل الى 40 الأجنة يمكن أن تكون معزولة في 1 ساعة إلى 4 ساعات، اعتمادا على تطبيق المصب. هذا الإجراء هو مناسبة لTranscriptome على، الحامض النووي، مراسل ال?...

Video: Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development. These proteins have been shown to be critical for cell fate determination, cell migration, and formation of neural circuits. Neuronal induction and patterning involve bone morphogenetic protein (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast growth factor (FGF), among others. In particular, the expression pattern of Fgf8 is in close proximity to regions expressing BMP4 and SHH. This expression pattern is consistent with developmental interactions that facilitate patterning in the telencephalon.

Here we provide a visual demonstration of a method in which an in ovo preparation can be used to test the effects of Fgfs in the formation of the forebrain. Beads are coated with protein and placed in the developing neural tube to provide sustained exposure. Because the procedure uses small, carefully placed beads, it is minimally invasive and allows several beads to be placed within a single neural tube. Moreover, the method allows for continued development so that embryos can be analyzed at a more mature stage to detect changes in anatomy and in neural patterning. This simple but useful protocol allows for real time imaging. It provides a means to make spatially and temporally limited changes to endogenous protein levels.

A variety of growth factors and proteins interact to induce cells to take on different cell fates during development. Here we demonstrate the use of an in ovo preparation to address possible interactions between different proteins in development by placing beads on E2.5 chick embryos.

وضع عامل النمو المغلفه الخرز على أجنة الدجاج المرحلة المبكرة

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts from different plant tissues was first reported more than 40 years ago 1 and has since been adapted to study a variety of cellular processes, such as subcellular localization of proteins, isolation of intact organelles and targeted gene-inactivation by double stranded RNA interference (RNAi) 2-5. Most of the protoplast isolation protocols use leaf tissues of mature Arabidopsis (e.g. 35-day-old plants) 2-4. We modified existing protocols by employing 14-day-old Arabidopsis seedlings. In this procedure, one gram of 14-day-old seedlings yielded 5 106-107 protoplasts that remain intact at least 96 hours. The yield of protoplasts from seedlings is comparable with preparations from leaves of mature Arabidopsis, but instead of 35-36 days, isolation of protoplasts is completed in 15 days. This allows decreasing the time and growth chamber space that are required for isolating protoplasts when mature plants are used, and expedites the downstream studies that require intact protoplasts.

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

This video shows a procedure for isolating intact protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis. Given that the isolated protoplasts remain intact for at least 96h and are isolated from seedlings instead of one-month-old mature plants, this procedure expedites assays requiring intact protoplasts.

عزلة Protoplasts من أنسجة لمدة 14 يوما من عمره الشتلات thaliana Arabidopsis</em

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

الأزهار وتراجع تحويل thaliana Arabidopsis لتفحص pTSO2 : β غلوكورونيداز التعبير مراسل جين

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as phosphatidylcholine or phosphatidylethanolamine, form bilayer membranes which act as both boundaries and interfaces for chemical exchange between cells and their surroundings. Unlike animals, plant cells have a special organelle for photosynthesis, the chloroplast. The intricate membrane system of the chloroplast contains unique glycerolipids, namely glycolipids lacking phosphorus: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG)4. The roles of these lipids are beyond simply structural. These glycolipids and other glycerolipids were found in the crystal structures of photosystem I and II indicating the involvement of glycerolipids in photosynthesis8,11. During phosphate starvation, DGDG is transferred to extraplastidic membranes to compensate the loss of phospholipids9,12.
Much of our knowledge of the biosynthesis and function of these lipids has been derived from a combination of genetic and biochemical studies with Arabidopsis thaliana14. During these studies, a simple procedure for the analysis of polar lipids has been essential for the screening and analysis of lipid mutants and will be outlined in detail. A leaf lipid extract is first separated by thin layer chromatography (TLC) and glycerolipids are stained reversibly with iodine vapor. The individual lipids are scraped from the TLC plate and converted to fatty acyl methylesters (FAMEs), which are analyzed by gas-liquid chromatography coupled with flame ionization detection (FID-GLC) (Figure 1). This method has been proven to be a reliable tool for mutant screening. For example, the tgd1,2,3,4 endoplasmic reticulum-to-plastid lipid trafficking mutants were discovered based on the accumulation of an abnormal galactoglycerolipid: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) and a decrease in the relative amount of 18:3 (carbons : double bonds) fatty acyl groups in membrane lipids 3,13,18,20. This method is also applicable for determining enzymatic activities of proteins using lipids as substrate6.

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

Composition of polar lipid extracts and the fatty acid composition of individual glycerolipids are determined in a simple and robust lipid profiling experiment. For this purpose, glycerolipids are isolated by thin layer chromatography and subjected to transmethylation of their acyl groups. Fatty acyl methylesters are quantified by gas-liquid chromatography.

Arabidopsis thaliana التنميط Glycerolipid القطبية التي اللوني طبقة رقيقة (TLC) اقترن اللوني الغاز السائل (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

مناعي لونين الفحص الجينات الأنسجة الخاصة باستخدام أجنة فئران في مرحلة مبكرة

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

العزلة وتنقية كينيسين من ذبابة الفاكهة الأجنة

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are multistep procedures involving the isolation and expansion of neural precursor cells, prior to terminal differentiation. In comparison to these time-consuming approaches, we have recently found that combined inhibition of three signaling pathways, TGF&beta;/SMAD2, BMP/SMAD1, and FGF/ERK, promotes rapid induction of neuroectoderm from hPSCs, followed by immediate differentiation into functional neurons. Here, we have adapted our procedure to a novel multititre plate format, to further enhance its reproducibility and to make it compatible with mid-throughput applications. It comprises four days of neuroectoderm formation in floating spheres (embryoid bodies), followed by a further four days of differentiation into neurons under adherent conditions. Most cells obtained with this protocol appear to be bipolar sensory neurons. Moreover, the procedure is highly efficient, does not require particular expert skills, and is based on a simple chemically defined medium with cost-efficient small molecules. Due to these features, the procedure may serve as a useful platform for further functional investigation as well as for cell-based screening approaches requiring human sensory neurons or neurons of any type.

Protocols for neuronal differentiation of pluripotent human stem cells (hPSCs) are often time-consuming and require substantial cell culture skills. Here, we have adapted a small molecule-based differentiation procedure to a multititre plate format, allowing simple, rapid, and efficient generation of human neurons in a controlled manner.

بسرعة وكفاءة توليد الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان في تنسيق اللوحة Multititre

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

الأيضية وصفها وغشاء التقطير للالمقارن تحليل البروتين من<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana</em&gt; الثقافات تعليق خلية

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

تلطيخ النسيجية من<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana</em&gt; الخليوي الثانوية ستريت عناصر

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

طريقة موحدة للتعقيم الفائق من بذور نبات

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...