وقد استلهمت هذه الدراسة من عمل ليفين وآخرون. ، الذي وصف هذه الطريقة التجريبية وقدم وصفا شاملا للتنمية الأوعية الدموية في القيطم ليفيس . نشكر أعضاء مختبرنا على مدخلاتهم. وقد تم دعم هذه الدراسة من قبل مبادرة البحوث الرائدة في المستقبل جامعة يونسي 2015 (2015-22- 0095) وبرنامج تطوير التكنولوجيا الحيوية والتكنولوجيا الطبية للمؤسسة الوطنية للبحوث (نرف) بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات والتخطيط المستقبلي ( جبهة الخلاص الوطني، 2013M3A9D5072551)

<ol>
	<li>Herbert, S. P., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+control+of+endothelial+cell+behaviour+during+blood+vessel+morphogenesis.">Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).</li><li>Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+vascular+morphogenesis+and+homeostasis+through+the+angiopoietin-Tie+system.">Control of vascular morphogenesis and homeostasis through the angiopoietin-Tie system.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), 165-177 (2009).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteries+and+veins:+making+a+difference+with+zebrafish.">Arteries and veins: making a difference with zebrafish.</a> Nat Rev Genet. 3 (9), 674-682 (2002).</li><li>Levine, A. J., Munoz-Sanjuan, I., Bell, E., North, A. J., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+endothelial+cells+allows+in+vivo,+continuous+characterization+of+the+vascular+development+of+Xenopus+laevis.">Fluorescent labeling of endothelial cells allows in vivo, continuous characterization of the vascular development of Xenopus laevis.</a> Dev Biol. 254 (1), 50-67 (2003).</li><li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+Mediates+Ca2+-Dependent+Inhibition+of+Tie2+Signaling+and+Acts+as+a+Developmental+Brake+During+Embryonic+Angiogenesis.">Calmodulin Mediates Ca2+-Dependent Inhibition of Tie2 Signaling and Acts as a Developmental Brake During Embryonic Angiogenesis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (7), 1406-1416 (2016).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell-stage+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo.</a> Dev Biol. 122 (2), 300-319 (1987).</li><li>Elliott, K. L., Houston, D. W., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Xenopus+laevis+tissues+to+determine+the+ability+of+motor+neurons+to+acquire+a+novel+target.">Transplantation of Xenopus laevis tissues to determine the ability of motor neurons to acquire a novel target.</a> PLoS One. 8 (2), 55541 (2013).</li><li>Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+tropicalis+as+a+model+organism+for+genetics+and+genomics:+past,+present,+and+future.">Xenopus tropicalis as a model organism for genetics and genomics: past, present, and future.</a> Methods Mol Biol. 917, 3-15 (2012).</li><li>Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Mahley, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+lysine+residues+of+plasma+lipoproteins+in+high+affinity+binding+to+cell+surface+receptors+on+human+fibroblasts.">Role of lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts.</a> J Biol Chem. 253 (24), 9053-9062 (1978).</li><li>Showell, C., Conlon, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+collection+and+in+vitro+fertilization+of+the+western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis.">Egg collection and in vitro fertilization of the western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (9), 5293 (2009).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).</li><li>Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Neurite+Tracer:+open+source+software+for+reconstruction,+visualization+and+analysis+of+neuronal+processes.">Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes.</a> Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).</li><li>Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+TrkB+signaling+in+presynaptic+retinal+ganglion+cells+mediates+axon+arbor+growth+and+synapse+maturation+during+the+establishment+of+retinotectal+synaptic+connectivity.">Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity.</a> J Neurosci. 27 (10), 2444-2456 (2007).</li><li>Cha, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionarily+repurposed+networks+reveal+the+well-known+antifungal+drug+thiabendazole+to+be+a+novel+vascular+disrupting+agent.">Evolutionarily repurposed networks reveal the well-known antifungal drug thiabendazole to be a novel vascular disrupting agent.</a> PLoS Biol. 10 (8), 1001379 (2012).</li><li>Ny, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+Xenopus+laevis+reporter+model+to+study+lymphangiogenesis.">A transgenic Xenopus laevis reporter model to study lymphangiogenesis.</a> Biol Open. 2 (9), 882-890 (2013).</li><li>Bussmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteries+provide+essential+guidance+cues+for+lymphatic+endothelial+cells+in+the+zebrafish+trunk.">Arteries provide essential guidance cues for lymphatic endothelial cells in the zebrafish trunk.</a> Development. 137 (16), 2653-2657 (2010).</li><li>Li, X. M., Hu, Z., Jorgenson, M. L., Slayton, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+levels+of+acetylated+low-density+lipoprotein+uptake+and+low+tyrosine+kinase+with+immunoglobulin+and+epidermal+growth+factor+homology+domains-2+(Tie2)+promoter+activity+distinguish+sinusoids+from+other+vessel+types+in+murine+bone+marrow.">High levels of acetylated low-density lipoprotein uptake and low tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains-2 (Tie2) promoter activity distinguish sinusoids from other vessel types in murine bone marrow.</a> Circulation. 120 (19), 1910-1918 (2009).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

بروتوكول المقدمة هنا وضعت لأول مرة من قبل علي H. بريفنلو وزملائه للتحقيق في الأحداث التنموية خلال تشكيل الأوعية الدموية في القيطم ليفيس 4 ، ولكن، كما هو مبين في هذه المخطوطة، فإنه يمكن تطبيقها على الحيوانات الصغيرة الأخرى. صبغ الحقن في القلب هو بسيط لأداء، وشبكة الأوعية الدموية بأكملها يمكن تصويرها تحت المجهر تشريح مضان، فضلا عن المجهر متحد البؤر. إذا تم حقن الصبغة في القلب أثناء تطوير السفن، وديناميات نمو السفن والتفرع يمكن تصويرها في الوقت الحقيقي 4 . باستخدام الشبكة الوريدية محددة جيدا، وخاصة يكف و روسترال-معظم إيسفس، آثار الاضطراب الجيني أو البيئي على الأوعية الدموية يمكن تقييم كميا. الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو حقن ديي-أكلدل (الخطوة 4). نحن نقدم أمثلة على الحقن الناجحة وغير الناجحة (فيغور 3). وينبغي أن يتم فحص الأجنة حقن بنجاح تحت المجهر مضان، كما هو موضح في الخطوة 4.3. إذا كان يكف غير مرئية 30 دقيقة بعد الحقن، لم يتم حقن ما يكفي من الجاذبة- أكلدل ( الشكل 3C ). قد يتم تخدير الأجنة حقن ناجحة وحقن مرة أخرى. في بعض الحالات، قد يتم حقن ديدي-أكلدل في موقع غير صحيح، وفي هذه الحالة سيتم وصف الأجهزة الأخرى ( الشكل 3D ). تجاهل الأجنة حقن بشكل غير صحيح. الأوعية الدموية من الجنين حقن بنجاح تكون مرئية بعد فترة وجيزة من الحقن، ومضان يستمر لعدة ساعات. لذلك، إذا تم تنفيذ الحقن قبل تشكيل إيسفس، ويمكن تصوير تطورها في جنين الحية، وتوفير أداة قوية للتحقيق في تطوير نظام القلب والأوعية الدموية في الوقت الحقيقي وفي الجسم الحي 4 . كما تم استخدام القيطم بنجاح كنموذج لفحص الأوعية الدموية دوكلاء إفساد في الثدييات 14 ، النهج التجريبي الموصوفة هنا قد تكون جنبا إلى جنب مع التجارب الاضطراب الدوائية وتستخدم كمنصة الفرز للعثور على الأدوية التي تعزز أو تمنع الأوعية الدموية. يمكن تصور الأوعية الدموية عن طريق الأدوات الوراثية، فضلا عن أساليب وضع العلامات على أساس صبغ وصفها هنا. على سبيل المثال، المعدلة وراثيا القيطم 15 أو الزرد 16 التي تعبر عن البروتينات مضان تحت سيطرة المروجين نوع خلية محددة تمكن التصوير الحي من الدم والأوعية اللمفاوية، وأنه من الممكن حتى للتمييز الشرايين من الأوردة 16 . وعلى الرغم من أن النهج الجينية متفوقة وتولد كفاءة أكثر اتساقا في وضع العلامات، فإن الأساليب القائمة على الصباغة يمكن الوصول إليها بسهولة لمعظم المختبرات دون الوصول إلى هذه الحيوانات المحورة جينيا. في القيطم ، ونضح ترانسكارديال من النتائج ديي أكلدل فيووضع العلامات على معظم الخلايا البطانية 4 ، والشرايين والأوردة لا يمكن تمييزها في الصور مضان. ومن المثير للاهتمام، الطماطم ليتين-فلوريسئين بشكل انتقائي تسميات الشرايين في الفئران، وعندما شارك في حقن مع الجاذبة- أكلدل، الشرايين والأوردة يمكن التمييز 17 . على الرغم من أن التطبيق لم يتم اختباره في الأنسجة أو الحيوانات الأخرى، وهذا يوفر اتجاها واعدا للتحقيق في التطور الديناميكي للشرايين والأوردة في القيطم .

تشكيل الأوعية الدموية، وتشكيل الأوعية الدموية الجديدة من الخلايا البطانية المولودة حديثا، والأوعية الدموية، وتشكيل سفن جديدة من السفن الموجودة من قبل، هي عمليتين متميزة التي تشكل الأوعية الدموية الجنينية 1 . أي اختلال في هذه العمليات يؤدي إلى أمراض القلب المختلفة والتشوهات الهيكلية للسفن. وعلاوة على ذلك، يرتبط نمو الورم مع نمو السفن غير المنضبط. على هذا النحو، والآليات الجزيئية الكامنة وراء الأوعية الدموية والأوعية الدموية هي موضوع تحقيق مكثف 2 . القيطم والزرد هي نماذج جذابة الفقاريات لدراسات الأوعية الدموية ودراسات الأوعية الدموية، لعدة أسباب. أولا، أجنة صغيرة. وبالتالي، فمن السهل نسبيا لصورة الأوعية الدموية بأكملها. ثانيا، التطور الجنيني هو سريع. يستغرق سوى بضعة أيام ل الأوعية الدموية بأكملها لتطوير، وخلال ذلك الوقت الأوعية الدموية النامية<html> أتيور يمكن تصويرها. ثالثا، التدخلات الجينية والدوائية قبل وأثناء تشكيل السفن هي سهلة لأداء، مثل من خلال ميكروينجكتيون من النيوكليوتيدات مورفولينو مضادات (موس) في الجنين النامي أو من خلال تطبيق حمام من المخدرات 3 ، 4 ، 5 . ميزة فريدة من القيطم على الزرد هو أن التلاعب الجنينية لا يمكن أن يؤديها لأن القيطم يتبع الانقسامات هوليوبلاستيك النمطية وخريطة مصير الجنينية محددة جيدا 6 . على سبيل المثال، فمن الممكن لتوليد الجنين حيث يتم التلاعب الجانب الجانبي واحد فقط عن طريق حقن مو موتزين إلى خلية واحدة في مرحلة اثنين من الخلايا. ومن الممكن أيضا لزرع القلب الأولي من جنين إلى آخر لتحديد ما إذا كان الجين يمارس وظيفته من خلال خلية جوهرية أو آلية -extrinsicأس = &quot;كريف&quot;&gt; 7. على الرغم من أن هذه التقنيات قد وضعت في الغالب في القيطم ليفيس، وهو ألوتيترابلويد، وبالتالي ليست مثالية للدراسات الوراثية، ويمكن تطبيقها مباشرة على الزينوبوس تروبيكاليس ، وهو نوع من الأنواع ثنائية الارتباط وثيقة الصلة 8 . طريقة واحدة لتصور الأوعية الدموية في جنين القرد الحية هو حقن صبغة الفلورسنت لتسمية الأوعية الدموية. أسيتيلد البروتين الدهني منخفض الكثافة (أكلدل) المسمى مع جزيء الفلورسنت مثل الجاذبة هو مسبار مفيد جدا. على عكس لدل أونستيتيلاتد، أكلدل لا يرتبط لمستقبلات لدل 9 ولكن إندوسيتوسد بواسطة الضامة والخلايا البطانية. حقن داي-أكلدل في قلب نتائج الحيوانات الحية في وضع العلامات الفلورسنت محددة من الخلايا البطانية، ويمكن تصوير الأوعية الدموية بأكملها من قبل المجهر مضان في الأجنة الحية أو الثابتة 4 . هنا، نحن بريسفي بروتوكولات مفصلة لتصور وتقدير الكميات من الأوعية الدموية باستخدام دالي-أكلدل في القيطم تروبيكاليس ( الشكل 1 ). نحن نقدم نقاط عملية رئيسية، مع أمثلة من التجارب الناجحة وغير الناجحة. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن نقدم طريقة واضحة للتحليل الكمي للتعقيد الأوعية الدموية، والتي قد تكون مفيدة في تقييم آثار العوامل الوراثية والبيئية على تشكيل شبكة الأوعية الدموية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="539">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">35mm Petri dish</td>
			<td style="width:113px;">SPL</td>
			<td style="width:93px;">10035</td>
			<td style="width:180px;">Sylgard mold frame</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">60mm Petri dish</td>
			<td style="width:113px;">SPL</td>
			<td style="width:93px;">10060</td>
			<td>Embryo raising tray</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Borosilicate Glass</td>
			<td style="width:113px;">Sutter instrument</td>
			<td style="width:93px;">B100-50-10</td>
			<td>Needle for injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">BSA</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">A3059-10G</td>
			<td>Coating reagent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">CaCl2</td>
			<td style="width:113px;">D.S.P.GR Reagent</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>0.1X MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Coverslip</td>
			<td style="width:113px;">Superior</td>
			<td style="width:93px;">HSU-0111520</td>
			<td>For confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">DiI-AcLDL</td>
			<td style="width:113px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:93px;">L3484</td>
			<td>Vessel staining solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">FBS</td>
			<td style="width:113px;">Hyclone</td>
			<td style="width:93px;">SH.30919.02</td>
			<td>For storage of testis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Fiber Optical Illuminator</td>
			<td style="width:113px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:93px;">Z-LITE-Z</td>
			<td>Light</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Ficoll</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">F4375</td>
			<td>Injection buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:113px;">Sutter instrument</td>
			<td style="width:93px;">P-97</td>
			<td>Injection needle puller</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Forcep</td>
			<td style="width:113px;">Fine Science Tool</td>
			<td style="width:93px;">11255-20</td>
			<td style="width:180px;">For embryo hatching and 
			needle tip cutting</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Glass Bottom dish</td>
			<td style="width:113px;">SPL</td>
			<td style="width:93px;">100350</td>
			<td>For confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">hCG</td>
			<td style="width:113px;">MNS Korea</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>For priming of frogs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">HEPES</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">H3375</td>
			<td>Buffering agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Incubator</td>
			<td style="width:113px;">Lab. Companion</td>
			<td style="width:93px;">ILP-02</td>
			<td>For raising embryos</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">KCl</td>
			<td style="width:113px;">DAEJUNG</td>
			<td style="width:93px;">6566-4400</td>
			<td>MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">L15 medium</td>
			<td style="width:113px;">Gibco</td>
			<td style="width:93px;">11415-114</td>
			<td>For storage of testis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">L-cysteine</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">168149-100G</td>
			<td>De-jellying reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">MgSO4</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">M7506</td>
			<td>MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Microtube</td>
			<td style="width:113px;">Axygen</td>
			<td style="width:93px;">MCT-175-C-S</td>
			<td>For storage of testis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">MS222</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">E10521</td>
			<td>Anesthetic powder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">NaCl</td>
			<td style="width:113px;">DAEJUNG</td>
			<td style="width:93px;">7647-14-5</td>
			<td>MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">NaOH</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">S-0899</td>
			<td>pH adjusting reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">P6148</td>
			<td>Fixatives</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">PBS</td>
			<td style="width:113px;">BIOSESANG</td>
			<td style="width:93px;">P2007</td>
			<td>Buffer for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">pH paper</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">P4536-100EA</td>
			<td>For confirming pH</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">PICO-LITER INJECTOR</td>
			<td style="width:113px;">Waner instruments</td>
			<td style="width:93px;">PLI-100A</td>
			<td>For injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Pin</td>
			<td style="width:113px;">Pinservice</td>
			<td style="width:93px;">26002-10</td>
			<td>For incision</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Pinholder</td>
			<td style="width:113px;">Scitech Korea</td>
			<td style="width:93px;">26016-12</td>
			<td>For incision</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Precision Stereo Zoom Binocular Microscope</td>
			<td style="width:113px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:93px;">PZMIII</td>
			<td>For visual screening</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:153px;">Standard Manual Control Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Waner instruments</td>
			<td style="width:93px;">W4 64-0056</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">SYLGARD 184 Kit</td>
			<td style="width:113px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>For DiI injection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Transfer pipette</td>
			<td style="width:113px;">Korea Ace Scientific Co.</td>
			<td style="width:93px;">YM.B78-400</td>
			<td>For eggs and 
			embryo collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantitative analysis of embryonic angiogenesis in xenopus tropicalis

الأوعية الدموية توريد الأكسجين والمواد المغذية في جميع أنحاء الجسم، وتشكيل شبكة الأوعية الدموية تحت السيطرة التنموية الضيقة. كفاءة في التصور الجسم الحي من الأوعية الدموية وكمية موثوق بها من تعقيدها هي المفتاح لفهم البيولوجيا والمرض للشبكة الوعائية. هنا، ونحن نقدم طريقة مفصلة لتصور الأوعية الدموية مع صبغ الفلورسنت المتاحة تجاريا، والبلازما البشرية أسيتيلات منخفضة الكثافة البروتين الدهني مجمع الجاذبة (ديي أكلدل)، وتحديد مدى تعقيدها في القيطم الاستوائية . يمكن وصف الأوعية الدموية عن طريق حقن بسيط من الجاذبة- أكلدل في قلب الضرب من الجنين، والأوعية الدموية في الجنين بأكمله يمكن تصويرها في الأجنة الحية أو الثابتة. جنبا إلى جنب مع اضطراب الجينات من قبل ميكروينجكتيون المستهدفة من الأحماض النووية و / أو تطبيق حمام الكواشف الدوائية، وأدوار الجين أو مسار الإشارات على التنمية الأوعية الدموية يمكن أن يكونفي غضون أسبوع واحد دون اللجوء إلى الحيوانات المتطورة وراثيا. بسبب النظام الوريدي المعرفة جيدا من القيطم وتوليد الأوعية النمطية، تنبت من السفن الموجودة من قبل، يمكن أن يكون كميا تعقيد السفينة بكمية بكفاءة بعد التجارب الاضطراب. وينبغي أن يكون هذا البروتوكول بسيط نسبيا بمثابة أداة يمكن الوصول إليها بسهولة في مجالات متنوعة من البحوث القلب والأوعية الدموية.

الجدول الزمني للتجارب (الشكلان 1 و 2) بعد فترة قصيرة من الإخصاب، يمكن أن يؤديها ميكروينجكتيون المستهدفة لتعديل التعبير الجيني. على سبيل المثال، مو أنتيزنس التي تربط على وجه التحديد إلى كودون بدء من TNA2 مرنا الذاتية يمكن حقن، مما يثبط ترجمة Tie2 الهدف مرنا بواسطة عائق ستيري. يمكن مو مترافق إلى فلوريسئين لفحص البصرية سهلة من الأجنة حقنها بنجاح. بدلا من ذلك، يمكن أن يكون مرنا التتبع (على سبيل المثال، مرنا ترميز إغف) شارك في حقن مع مو. بالإضافة إلى ذلك، يمكن علاج المخدرات عن طريق تطبيق حمام بعد الفقس (مرحلة تيلبود في وقت مبكر، حول نف المرحلة 26). حل الدواء في 0.1X مبس وإضافته إلى الأجنة. لعلاج سابق، يمكن تحرير الأجنة من الأغشية مع زوج من ملقط. يمكن حقن ديدي-أكلدل في القلب حول المرحلة 33/34 للتحقيق في ديناميات شكل السفينةولكن عادة ما نقوم بحقن في مرحلة 37/38 أو في وقت لاحق ( الشكل 2 ، المناطق الملونة). أمثلة نموذجية للحقن الناجحة وغير الناجحة (الخطوة 4.3) (الشكل 3) التصوير مجسمة مناسب للفحص البصري. إذا تم حقن كمية كافية من الجاذبة- أكلدل في القلب، وينبغي أن يكون يكف مرئية على الفور تحت المجسام مضان ( الشكل 3A و 3 B). غير كافية أو غير صحيحة حقن الأجنة هي سهلة لتحديد ( الشكل 3C و 3D ). الأجنة مع كمية كافية من الجاذبة- أكلدل ( الشكل 3C ) يمكن حقنها مرة أخرى مع نفس الصبغة حتى الأوعية واضحة للعيان. صورة حقن الأجنة بنجاح تحت المجهر متحد البؤر، ويعيش أو بعد التثبيت. تطوير بوستيريأو الوريد الكاردينال (يكف) والأوردة إنتيرسوميتيس (إيسفس) يمتد ال يكف في الاتجاه من ملكي إلى ذيلية، وينتهي هذا التمديد حول المرحلة 37/38. تظهر إيسفس ظهريا من يكف في الموجة الأمامية إلى الخلفية. هذه الموجة من تشكيل إيسف تبدأ في المرحلة 36 وتنتهي حول المرحلة 40/41؛ تستمر إيسفس في النمو وتصبح تشعبت طفيفة حتى المرحلة 43 ( الشكل 3A و 3 B ). Tie2 يشير ضوابط التنمية إيسف المتفرعة (الشكل 4) و يكف و إيسفس تنمو في نمط نمطي، وتنميتها تحت سيطرة مشددة ( الشكل 4A ). تشكيل إيسفس من يكف يمكن وصفها بأنها الأوعية الدموية، وبالتالي فإنه هو نموذج مفيد للتحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء الأوعية الدموية. نحن نقدم نتيجة دراستنا الأخيرة شوينانوغرام أن الإشارات التنموية تمنع إشارات Tie2 في إيسف للحد من المتفرعة 5 . ضربة قاضية من Tie2 مما يدل على مضادات مو يقلل من طول وتعقيد إيسفس (الشكل 4B)، والتعبير عن الشكل النشط التأسيسية من Tie2 (caTie2) يسبب المفرط إيسف المتفرعة ( الشكل 4C ). الكمي للتعقيد إيسف (الشكل 5) بالإضافة إلى أطوال وأرقام فرع من إيسفس، يمكن حساب &quot;مؤشر تعقيد الوريد&quot; (فسي) لتقييم تعقيدها ( الشكل 5A ). اعتمدنا &quot;مؤشر التعقيد&quot; التي وضعتها كوهين-كوري والزملاء، والتي تم تصميمها لتحديد مدى تعقيد العصبية العصبية أو الشجيرات أربورس 13 . في هذا الفهرس، جنين مع أكثر من فروع عالية الترتيب يتلقى أعلى درجة من الجنين مع نفس العدد من النخالة الإجماليةولكن مع المزيد من الفروع منخفضة الترتيب. لذلك، أعلى فسي يشير إلى أن هذا الجنين لديه شبكة وريدي أكثر تعقيدا. &quot;بسيطة نيوريت التتبع&quot; هو برنامج مفيد لتتبع النظام وطول الفروع الفردية. ومن الممكن أيضا لتوليد &quot;مسارات المقدمة&quot;، وهو وسيلة مفيدة لتصور العمارة الشاملة للأوعية الدموية ( أرقام 5B-5D ، لوحات الحق). <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55652/55652fig1.jpg" /> الشكل 1: الجدول الزمني للتجارب. في يوم الإخصاب، مورفولينوس (موس)، الحمض النووي، رنا، أو البروتين يمكن حقنه في البيض المخصب في نف المرحلة 1 (st1) أو 2 (st2). إذا حقن فقط في بلاستومير واحد في st2، فإن كاشف حقن تؤثر على جانب واحد فقط الجانبية. الجانب أونينجكتد يمكن استخدامها كعنصر تحكم. شارك في حقن التتبع (على سبيل المثال، إغف مرنا) لتحديد الجانب حقن. في اليوم الثاني، إيرلي تايلبود المرحلة (~ st24) الأجنة يمكن علاجها مع الكواشف الدوائية عن طريق تطبيق الحمام. القلب واضح للعيان في اليوم الثالث. يمكن حقن ديلي-أكلدل في القلب والأوعية الدموية يمكن تصويرها بعد فترة وجيزة من الحقن. استخدام الأجنة st33-37 إلى صورة ديناميات نمو الأوعية أو الأجنة st42 إلى صورة الأوعية المتقدمة بالكامل. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55652/55652fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/55652/55652fig2.jpg" /> الشكل 2: موقع حقن الجاذبة- أكلدل في st42. الجانبي ( أب &#39; ) والبطنية (سد) وجهات النظر من المرحلة 42 الجنين. يتم تلوين القلب باللون الوردي في أس، في الصور المأخوذة من زينباس (www.xenbase.org). وتظهر الصور مجسمة التمثيلية في A &#39; ، <strأونغ&gt; B &#39;، أند D. للحقن، ثقب الجلد المغطي القلب ( C ، السهم الصلب)، وجعل شق خطي، وفتح الجلد أفقيا لفضح القلب (الأسهم الحمراء). بعد إجراء شق، سيتم تمييز القلب بوضوح للحقن ( D &#39; ). مقياس الحانات = 200 ميكرون. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55652/55652fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/55652/55652fig3.jpg" /> الشكل 3: النتائج المتوقعة (صور مجسمة). صور مضان ممثل من المرحلة 37/38 ( A ) والمرحلة 42 ( B ) الأجنة. يظهر الجانبان الأيسر من الأجنة. الوريد الكاردينالي الخلفي (يكف) يمتد كاودالي، والتي من الأوردة إنتيرسوميتيس (إيسفس) فرع بشكل ظهري في الوريد منقاري إلى الذيليةه. ولا تظهر سوى مرآبات إيسف المنقارية في المرحلة 37/38 ( أ )، وقد شكلت معظم أنواع الدعم الدولي حسب المرحلة 42 ( باء ). إذا تم حقن كمية كافية من الجاذبة- أكلدل، فإن يكف لا تكون واضحة للعيان، حتى بعد 30 دقيقة ( C ). في هذه الحالة، يمكن حقن المزيد من دي-أكلدل. إذا تم حقن ديدي-أكلدل عن طريق الخطأ في أجهزة أخرى ( D )، وتجاهل الأجنة. شريط مقياس = 500 ميكرون. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55652/55652fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/55652/55652fig4.jpg" /> الشكل 4: آثار إشارات Tie2 على تطوير إيسف. تم طرد Tie2 التعبير الجيني أسفل عن طريق الحقن بلاستومير من حجب ترجمة العقاقير مورفولينو أوليغونوكلأوتيدس (Tie2MO). السيطرة مورفولينو (كومو) له نفس الوزن الجزيئي ولكن لا نأوت تستهدف أي جين في القيطم الاستوائية . مرنا ترميز كونتوتوتيلي نشط Tie2 متحولة (caTie2) شارك في حقن لانقاذ النمط الظاهري ضربة قاضية Tie2. وعلى النقيض من التحكم ( A )، أدى الحقن TT22MO إلى انخفاض كبير في طول وعدد من إيسفس ( B ). وقد تم إنقاذ هذا النمط الظاهري من قبل caTie2، والتي أظهرت إيسفس مع فروع الضمان مندفعا ( C ). يتم تحديد تعقيد إيسفس في المناطق المشار إليها من قبل صناديق متقطع الأزرق في الشكل 5. شريط مقياس = 200 ميكرون. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55652/55652fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/55652/55652fig5.jpg" /> الشكل 5: الكمي لتعقيد الوريد. ( A ) تعقيد إيسف يمكن أن يمثله مؤشر تعقيد الوريد (فسي).(بد) تم حساب فسي من الأجنة هو مبين في الشكل 4. شريط مقياس = 200 ميكرون. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55652/55652fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis at JoVE.com

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

يوضح هذا البروتوكول طريقة القائم على مضان لتصور الأوعية الدموية وتحديد مدى تعقيدها في القيطم الاستوائية . الأوعية الدموية يمكن تصويرها بعد دقائق من حقن صبغة الفلورسنت في قلب الضرب من الجنين بعد التلاعب الجيني و / أو الدوائية لدراسة التنمية القلب والأوعية الدموية في الجسم الحي .

التصور والتحليل الكمي من الأوعية الدموية الجنينية في<em&gt; زينوبوس تروبيكاليس</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

visualization-quantitative-analysis-embryonic-angiogenesis-xenopus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

8.3K Views.  Yonsei University College of Medicine.  يوضح هذا البروتوكول طريقة القائم على مضان لتصور الأوعية الدموية وتحديد مدى تعقيدها في القيطم الاستوائية . الأوعية الدموية يمكن تصويرها بعد دقائق من حقن صبغة الفلورسنت في قلب الضرب من الجنين بعد التلاعب الجيني و / أو الدوائية لدراسة ال...

Video: Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

التلاعب و<em&gt; في المختبر</em&gt; نضوج<em&gt; القيطم المورق</em&gt; البويضات، تلاه سهم داخل الهيولى حقن الحيوانات المنوية، لدراسة التطور الجنيني

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

تحليل التنمية Cardiomyocyte باستخدام المناعي في القلب الجنينية الماوس

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. Patterning of the Meckel&#39;s cartilage, a first pharyngeal arch derivative, involves the migration of cranial neural crest (CNC) cells and the progressive partitioning, proliferation and organization of differentiated chondrocytes. Several studies have described CNC migration during lower jaw&#160;morphogenesis, but the details of how the chondrocytes achieve organization in the growth and extension of Meckel&#8217;s cartilage remains unclear. The sox10 restricted and chemically induced Cre recombinase-mediated recombination generates permutations of distinct fluorescent proteins (RFP, YFP and CFP), thereby creating a multi-spectral labeling of progenitor cells and their progeny, reflecting distinct clonal populations. Using confocal time-lapse photography, it is possible to observe the chondrocytes behavior during the development of the zebrafish Meckel&#8217;s cartilage.
Multispectral cell labeling enables scientists to demonstrate extension of the Meckel&#8217;s chondrocytes.&#160;During extension phase of the Meckel&#8217;s cartilage, which prefigures the mandible, chondrocytes intercalate to effect extension as they stack in an organized single-cell layered row. Failure of this organized intercalating process to mediate cell extension provides the cellular mechanistic explanation for hypoplastic mandible that we observe in mandibular malformations.

Cell organization of craniofacial bones has long been hypothesized but never directly visualized. Multi-spectral cell labeling and in vivo live imaging allows visualization of dynamic cell behavior in zebrafish lower jaw. Here, we detail the protocol to manipulate Zebrabow transgenic fish and directly observe cell intercalation and morphological changes of chondrocytes in the Meckel&#8217;s cartilage.

التصور من خلية غضروفية بيوم إضافي والاتجاه انتشار عبر Zebrabow تحليل الخلية نسيلي في الغضروف والجنينية ميكل

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

باستخدام تحليل متحد البؤر من<em&gt; القيطم المورق</em&gt; بالتحقيق المغيرون من WNT وShh على محدثة التخلق التدرجات

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

الخلايا الجذعية مثل<em&gt; القيطم</em&gt; الجنينية إإكسبلنتس إلى الدراسة في وقت مبكر العصبية التنموية الميزات<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transcriptome على من التنميط<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; إنتاج الأبقار الأجنة قبل الزرع عن طريق اللونين ميكروأري منصة

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

تقنية لاستهداف حقن مكروي إلى البلدان النامية<em&gt; القيطم</em&gt; الكلى

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

تحليل الأوعية التاجية في قلوب الجنينية مسح

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early embryonic development, kinase activity is highly dynamic and widespread across the embryo. Pharmacological and genetic approaches are commonly used to probe kinase activities. Unfortunately, it is challenging to achieve superior spatial and temporal resolution using these strategies. Furthermore, it is not feasible to control the kinase activity in a reversible fashion in live cells and multicellular organisms. Such a limitation remains a bottleneck for achieving a quantitative understanding of kinase activity during development and differentiation. This work presents an optogenetic strategy that takes advantage of a bicistronic system containing photoactivatable proteins Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) and the N-terminal domain of cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix (CIBN). Reversible activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway is achieved through light-mediated protein translocation in live cells. This approach can be applied to mammalian cell cultures and live vertebrate embryos. This bicistronic system can be generalized to control the activity of other kinases with similar activation mechanisms and can be applied to other model systems.

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

This protocol describes an optogenetic strategy to modulate mitogen-activated protein kinase (MAPK) activity during cell differentiation and Xenopus embryonic development. This method allows for the reversible activation of the MAPK signaling pathway in mammalian cell culture and in multicellular live organisms, like Xenopus embryos, with high spatial and temporal resolution.

الضوء بوساطة تعديل عكسها من الميتوجين تنشيط كيناز مسار البروتين خلال تمايز الخلايا و<em&gt; القيطم</em&gt; التنمية الجنينية

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

تحليل كمي الجامع-جبل الفلورة السكان السلف القلب في الأجنة الماوس

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...