The author thanks Hugo Juraver-Geslin, Marion Wassef and Anne H&#233;l&#232;ne Monsoro-Burq for their help and advice, and the Animal Facility of the Institut Curie. The author thanks Paul Johnson for his editing work on the manuscript. This work was supported by the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS UMR8197, INSERM U1024) and by grants from the "Association pour la Recherche sur le Cancer" (ARC 4972 and ARC 5115; FRC DOC20120605233 and LABEX Memolife) and the Fondation Pierre Gilles de Gennes (FPGG0039).

<ol>
	<li>Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IIB,+Pattern+formation+in+the+developing+central+nervous+system+(CNS)+of+the+amphibians+and+birds+(English).">IIB, Pattern formation in the developing central nervous system (CNS) of the amphibians and birds (English).</a> Proceedings of the Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen. 94, 121-127 (1991).</li><li>Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+induction+process;+its+morphogenetic+aspects.">The neural induction process; its morphogenetic aspects.</a> Int J Dev Biol. 43, 615-623 (1999).</li><li>Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+induction.">Neural induction.</a> Curr Opin Genet Dev. 10, 357-362 (2000).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , (2000).</li><li>Hoppler, S., Vize, P. D., Hoppler, S., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Xenopus protocols : post-genomic approaches. , (2012).</li><li>Franklin Hughes, W., La Velle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+early+tectal+lesions+on+development+in+the+retinal+gonglion+cell+layer+of+chick+embryos.">The effects of early tectal lesions on development in the retinal gonglion cell layer of chick embryos.</a> J Comp Neurol. 163, 265-283 (1975).</li><li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beads+on+the+run:+beads+as+alternative+tools+for+chemotaxis+assays.">Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays.</a> Methods Mol Biol. 769, 449-460 (2011).</li><li>Juraver-Geslin, H. A., Gomez-Skarmeta, J. L., Durand, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conserved+barH-like+homeobox-2+gene+barhl2+acts+downstream+of+orthodentricle-2+and+together+with+iroquois-3+in+establishment+of+the+caudal+forebrain+signaling+center+induced+by+Sonic+Hedgehog.">The conserved barH-like homeobox-2 gene barhl2 acts downstream of orthodentricle-2 and together with iroquois-3 in establishment of the caudal forebrain signaling center induced by Sonic Hedgehog.</a> Dev Biol. 396, 107-120 (2014).</li><li>Green, J. B., New, H. V., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+embryonic+Xenopus+cells+to+activin+and+FGF+are+separated+by+multiple+dose+thresholds+and+correspond+to+distinct+axes+of+the+mesoderm.">Responses of embryonic Xenopus cells to activin and FGF are separated by multiple dose thresholds and correspond to distinct axes of the mesoderm.</a> Cell. 71, 731-739 (1992).</li><li>Wallingford, J. B., Ewald, A. J., Harland, R. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+during+convergent+extension+in+Xenopus.">Calcium signaling during convergent extension in Xenopus.</a> Curr Biol. 11, 652-661 (2001).</li><li>Kiecker, C., Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morphogen+gradient+of+Wnt/beta-catenin+signalling+regulates+anteroposterior+neural+patterning+in+Xenopus.">A morphogen gradient of Wnt/beta-catenin signalling regulates anteroposterior neural patterning in Xenopus.</a> DEVELOPMENT. 128, 4189-4201 (2001).</li><li>Wilson, P. A., Hemmati-Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+epidermis+and+inhibition+of+neural+fate+by+Bmp-4.">Induction of epidermis and inhibition of neural fate by Bmp-4.</a> Nature. 376, 331-333 (1995).</li><li>Afouda, B. A., Hoppler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+explants+as+an+experimental+model+system+for+studying+heart+development.">Xenopus explants as an experimental model system for studying heart development.</a> Trends in cardiovascular medicine. 19, 220-226 (2009).</li><li>Afouda, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-like+embryonic+explants+to+study+cardiac+development.">Stem-cell-like embryonic explants to study cardiac development.</a> Methods Mol Biol. 917, 515-523 (2012).</li><li>Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Xenopus+laevis+neural+crest+for+in+vitro+explant+culture+or+in+vivo+transplantation.">Dissection of Xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. , (2014).</li><li>Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax3+and+Zic1+drive+induction+and+differentiation+of+multipotent,+migratory,+and+functional+neural+crest+in+Xenopus+embryos.">Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 5528-5533 (2013).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J., Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).</li><li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization:+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos.">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li><li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate.">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removing+the+Vitelline+Membrane+from+Xenopus+laevis+Embryos.">Removing the Vitelline Membrane from Xenopus laevis Embryos.</a> CSH protocols. , (2007).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Cap+Isolation+from+Xenopus+laevis.">Animal Cap Isolation from Xenopus laevis.</a> CSH protocols. , (2007).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+dissection+and+micromanipulation+tools.">Embryo dissection and micromanipulation tools.</a> CSH protocols. , (2007).</li><li>Wilson, S. W., Houart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Early+Steps+in+the+Development+of+the+Forebrain.">Review: Early Steps in the Development of the Forebrain.</a> Developmental Cell. 6, 167-181 (2004).</li><li>Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+of+the+neural+plate:+new+roles+for+apoptosis+and+for+one+of+its+main+effectors+caspase-3.">Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3.</a> Genesis. 53, 203-224 (2015).</li><li>Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+the+early+Xenopus+embryo.">Patterning the early Xenopus embryo.</a> Development. 133, 1205-1217 (2006).</li><li>Rubenstein, J. L., Martinez, S., Shimamura, K., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+vertebrate+forebrain:+the+prosomeric+model.">The embryonic vertebrate forebrain: the prosomeric model.</a> Science. 266, 578-580 (1994).</li><li>Puelles, L., Rubenstein, J. L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+gene+expression+domains+and+the+evolving+prosomeric+model.">Forebrain gene expression domains and the evolving prosomeric model.</a> Trends in Neurosciences. 26, 469-476 (2003).</li><li>Martinez-Ferre, A., Martinez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regionalization+of+the+diencephalon.">Molecular regionalization of the diencephalon.</a> Frontiers In Neuroscience. 6, 73-73 (2012).</li><li>Scholpp, S., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Building+a+bridal+chamber:+development+of+the+thalamus.">Review: Building a bridal chamber: development of the thalamus.</a> Trends in Neurosciences. 33, 373-380 (2010).</li><li>Coffman, C., Harris, W., Kintner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xotch,+the+Xenopus+homolog+of+Drosophila+notch.">Xotch, the Xenopus homolog of Drosophila notch.</a> Science. 249, 1438-1441 (1990).</li><li>Pera, E. M., Acosta, H., Gouignard, N., Climent, M., Arregi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+signals,+gradient+formation+and+regional+specificity+in+neural+induction.">Active signals, gradient formation and regional specificity in neural induction.</a> Exp Cell Res. 321, 25-31 (2014).</li><li>Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+induction:+old+problem,+new+findings,+yet+more+questions.">Neural induction: old problem, new findings, yet more questions.</a> Development. 132, 2007-2021 (2005).</li><li>Juraver-Geslin, H. A., Ausseil, J. J., Wassef, M., Durand, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barhl2+limits+growth+of+the+diencephalic+primordium+through+Caspase3+inhibition+of+beta-catenin+activation.">Barhl2 limits growth of the diencephalic primordium through Caspase3 inhibition of beta-catenin activation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2288-2293 (2011).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+and+Reaggregation+of+Xenopus+laevis+Animal+Caps.">Dissociation and Reaggregation of Xenopus laevis Animal Caps.</a> CSH protocols. , (2007).</li><li>Harland, R. M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+research:+metamorphosed+by+genetics+and+genomics.">Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics.</a> Trends Genet. 27, 507-515 (2011).</li><li>Beccari, L., Marco-Ferreres, R., Bovolenta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+logic+of+gene+regulatory+networks+in+early+vertebrate+forebrain+patterning.">The logic of gene regulatory networks in early vertebrate forebrain patterning.</a> Mech Dev. 130, 95-111 (2013).</li><li>Pani, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ancient+deuterostome+origins+of+vertebrate+brain+signalling+centres.">Ancient deuterostome origins of vertebrate brain signalling centres.</a> Nature. 483, 289-294 (2012).</li><li>Holland, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+bilaterian+central+nervous+systems:+a+single+origin?.">Evolution of bilaterian central nervous systems: a single origin?.</a> Evodevo. 4, 27 (2013).</li><li>Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+neurodevelopmental+disorders+in+the+Xenopus+tadpole:+from+mechanisms+to+therapeutic+targets.">Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets.</a> Disease models &amp; mechanisms. 6, 1057-1065 (2013).</li><li>Sasai, Y., Ogushi, M., Nagase, T., Ando, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+the+gap+from+frog+research+to+human+therapy:+a+tale+of+neural+differentiation+in+Xenopus+animal+caps+and+human+pluripotent+cells.">Bridging the gap from frog research to human therapy: a tale of neural differentiation in Xenopus animal caps and human pluripotent cells.</a> Development, growth &amp; differentiation. 50, s47-s55 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ومدبرة التطور العصبي بواسطة تفاعل معقد بين البرامج التنموية الخلوية وإشارات من الأنسجة المحيطة بها (مراجعة في 3،31،32). نحن هنا وصف مجموعة من البروتوكولات التي يمكن استخدامها في X. المورق الأجنة لاستكشاف خارجي والعوامل الجوهرية التي ينطوي عليها العصبي تقرير مصير والتشكل العصبية في المختبر والمجراة. هذه البروتوكولات يمكن استخدامها على هذا النحو على X. الأجنة مداري، ولكن X. الأجنة مداري هي أربع مرات أصغر ثم X. المورق الأجنة. كل من ملقط والإبر التنغستن المستخدمة حاجة إلى أن يكون الدقيقة. عندما يكون ذلك ممكنا، استخدم X. المورق. التصور الدقيق للX. المورق وX. لا يمكن أن يتحقق المجالات histogenic العصبية مداري باستخدام تركيب مسطحة النسيجي للتشريح أنابيب العصبية من WM- ISH. تم تنفيذ هذه التقنية بنجاح على X. المورق الأجنة من مرحلة إلى 26المرحلة 45 (الشكل 1)، وعلى X. مداري الأجنة من مرحلة لمرحلة 30 45 8،33. الأجنة القديمة هي أسهل لتشريح الأجنة ثم الأصغر سنا. هذا الأسلوب هو السهل القيام بها. ويسمح تحليل أنماط التعبير الجيني، منفردة أو مجتمعة، على أنابيب العصبية في مراحل النمو المختلفة. مع هذا البروتوكول أنه من السهل للمقارنة جانب واحد من الأنبوب العصبي مع الآخر. هذا مفيد جدا في القيطم GOF وLOF التجارب. العيوب وحظ على الجانب حقنه في الأنبوب العصبي يمكن مقارنة مباشرة مع الأحداث التطور الطبيعي لاحظ على الجانب السيطرة. وقد استخدمت هذه الاستراتيجية لتحليل GOF وLOF الظواهر في X. المورق الأجنة 8،33. خطوة هامة في هذا البروتوكول هو التثبيت الصحيح من الأنسجة الجنينية. تثبيتا غير مكتمل يمنع مفرزة فعالة من الأديم الظاهر من الأنبوب العصبي. ما قبل تشريح الأنبوب العصبي يسهل تغلغل في الاعتصامتحقيقات ش. ولكن مرة واحدة معزولة، فمن السهل أن تفقد الأنابيب العصبية. فمن المستحسن أن تبقي جزء من الجنين أثناء إجراء ISH للحيلولة دون أي خسارة. الأجنة المستخدمة في كل هذه التجارب يجب أن تكون قوية وتحتاج للشفاء بشكل جيد. تجاهل أي دفعة من الأجنة غير صحية. من أجل تشريح الرابطة وإإكسبلنتس الكسب غير المشروع بين مرحلة ومرحلة 15 13 كان من الممكن أن ينمو X. المورق إإكسبلنتس والأجنة في درجات حرارة مختلفة (12-18 درجة مئوية و 18-20 درجة مئوية). الجدير بالذكر X. المورق الخلايا الجنينية تحتوي على ما يكفي من صفار البيض للسماح للبقاء على قيد الحياة لعدة أيام دون إضافة أي المغذيات الخارجية. حتى لا تضر الأنسجة الجنينية، أي إجراء نقل الجنين، AC، أو النباتى الذي ينبغي القيام به بعناية. فمن المستحسن استخدام إما نقل ماصة بلاستيكية أو micropipette إذا لزم الأمر مع خفض الحافة في نهايته. يتم ضبط القطر من نهاية طرف لحجم الجنين، أو حجم النباتى، على أن يتم تحويلها.ومن الجدير بالذكر، الماصات طلاء مع حل BSA 0.1٪ يمنع التصاق من قطع صغيرة من الأنسجة إلى البلاستيك. يمكن برمجتها إإكسبلنتس AC من خلال القسري التعبير الجيني، أو من خلال التعرض إلى العوامل الخارجية بطريقة الزمنية والتي تسيطر عليها الفضاء. وصفنا تقنية تسمح تحريض المحلي عن طريق الاتصال المباشر بين النباتى وحبة. إذا لزم الأمر حبات يمكن أن تكون مجزأة كذلك باستخدام ملقط. بالمقارنة مع غيرها من الاستراتيجيات التي سبق وصفها، تتيح هذه التقنية للاختبار تحريض المحلي مع العوامل نقية، منفردة أو مجتمعة، في إطار زمني دقيق. باستخدام نهج سبق وصفها من التفكك الخلايا وإعادة تكوين الجمعيات 34، فمن الممكن للتحقيق قدرات حركية الخلية، والسلوكيات فصل الخلايا، وتشكيل حدود المقصورة في ورطة وAC مختلطة إإكسبلنتس 8. تبدأ عملية التفكك الخلايا في أقل من 15 دقيقة. تجنب شاكينز لوحة خلال خطوة التفكك لمنع فقدان الخلايا. طبقات المصطبغة AC لا تنأى جيدا. فمن المستحسن لإزالتها خلال خطوة التفكك. يتم ترك بضعة AC طبقات الصباغية في-تجميع إعادة النباتى. أنه يساعد في تصور الكسب غير المشروع. أنها لا تتداخل مع التحليل في مراحل النمو اللاحقة. في هذه المخطوطة بروتوكول لزرع إإكسبلنتس المختلطة في لوحة العصبية مفصلة. في الأجنة القيطم، لوحة العصبية مفتوحة بين مرحلة ومرحلة 13 15. وهذه المراحل هي بالتالي مناسبة للزرع داخل الظهارة العصبية. X. المورق الأنسجة خصائص لاصقة تتغير مع مرور الوقت. من المهم أن الكسب غير المشروع إإكسبلنتس AC إلى المضيف في مرحلة تنموية مماثلة. في مراحل التنمية المبكرة، X. المورق الأجنة نمت في 3/4 إصلاح NAM سريع للغاية. إذا تضررت بعض الأجنة أثناء إزالة الغشاء المحي قد يكون من المفيد أن ننتظر 15 دقيقة،وهو الوقت اللازم لعملية الشفاء تحدث. الإدراج يمكن يفضل عن طريق وضع قطعة من الزجاج ساترة على أنسجة المضيف المطعمة، ولكنها ليست شرطا. القوة المتولدة من عملية الشفاء يمكن قذف الخلايا المطعمة. هو الحفاظ على التشكل من الجنين المضيف بشكل أفضل عندما يضطر الكسب غير المشروع الى انه مع الضغط الخارجي، كما هو الحال مع ساترة. لتقييم نجاح الكسب غير المشروع، ويمكن حقن التتبع الفلورسنت في إإكسبلنتس. وجود الخلايا الفلورسنت داخل الجنين المطعمة يمكن تصور حتى إغلاق الأنبوب العصبي. العيب الرئيسي في الثقافة وتطعيم AC التجارب هو التردد من البكتيريا أو الفطريات التلوث. استخدام الحلول المادية ومعقمة نظيفة أو معقمة قدر المستطاع لتجنب تلوث الطبق في كل خطوة من البروتوكول. للثقافة على المدى الطويل من الأجنة المطعمة دائما استخدام المضادات الحيوية ودرجة حرارة 15 ° C. تجنب الاتصال على المدى الطويل إإكسبلنتس AC أو الأجنة مع الاغاروز. نحن observإد أنها يمكن أن تقلل من متوسط ​​العمر المتوقع للالنباتى. تقنية تطعيم قوية ولكن تستغرق وقتا طويلا. ومن غير المستحسن للكشف عن اشارات تقرير مصير معها، ولكن للحصول على معلومات كافية عن الأنسجة التي تختارها مسبقا. بجانب المزايا التقليدية، فتحت التطورات الجينية الأخيرة في القيطم الطريق لهذا نظام نموذجي لاستكشاف شبكات تنظيم الجينات باستخدام التحليل الجيني على نطاق واسع من تسلسل الحمض النووي الريبي العميق وChromatide مناعي التسلسل (رقاقة وما يليها) 5،35. هناك RNAseq ممتازة ومجموعات البيانات المرجعية رقاقة يليها تغطي التطور الجنيني المبكر. واحدة من عيوب تحليل الشذرة وما يليها هي الحاجة إلى جمع كمية كبيرة من المواد. برمجة إإكسبلنتس AC تسمح بإنتاج كمية كبيرة من الأنسجة العصبية محددة، وجزئيا على الأقل، يساعد على التغلب على هذا الحد من التقنية. البرامج التنموية الكامنة الجهاز الأنبوب العصبييتم حفظها ogenesis إلى حد كبير، لا سيما في الفقاريات. المعلومات المكتسبة باستخدام البرمائيات تساعد في فهم العمليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء تطور الفقاريات 25،32،36-38. وقد فتحت التقدم الذي أحرز مؤخرا في مجال الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) حتى بوابات للبحوث في مجال الطب التجديدي واكتشاف المخدرات. مبرمجة iPSCs من خلايا جسدية باستخدام مزيج من عوامل النسخ. البحث في العظة البرمجة للخلايا الجذعية مستمر. المقايسات تصف هنا توفير وسيلة لتوليد أنواع الخلايا المشتقة من العصبية في المختبر التي يمكن أن تستخدم في فحص المخدرات. كما أنها توفر وسيلة رخيصة وسريعة لاختبار محددات مصير العصبية التي يمكن استخدامها للحصول على مزيد إعادة برمجة iPSCs 39،40.

يظهر الجهاز العصبي الفقاريات من لوحة العصبية باعتبارها طبقة متجانسة من الخلايا الظهارية العصبية. فهم كيفية يسببها البرامج التنموية، ترميز، وأنشأ خلال الجهوية لوحة العصبية هو، في الوقت الحاضر، وهو هدف رئيسي في البيولوجيا التطورية. مقارنة مع النظم الأخرى، والقيطم الجنين قابلة تجريبيا هو نموذج للاختيار لتحليل الخطوات الأولى من 1،2 تطوير العصبي. فمن السهل الحصول على أعداد كبيرة من الأجنة، والتنمية الخارجية يتيح الوصول إلى الخطوات الأولى لتكون العصيبة 3. تتوفر للتلاعب تجريبيا القيطم المورق (X. المورق) التطور الجنيني العديد من الأدوات. الدقيقة حقن من mRNAs أو morpholinos (MO)، بما في ذلك المنظمات الأعضاء محرض، جنبا إلى جنب مع أدوات البيوكيميائية والدوائية، يسمح السيطرة على زيادة وظيفة (GOF) وفقدان وظيفة (LOF) والتعديل المحدد من مسارات إشارات 4،5. جيش تحرير بلوشستانstocoel سقف الأديم الظاهر، وتقع حول القطب الحيواني من الأريمة أو المعيدة الجنين في وقت مبكر جدا، ويشار إليها باسم &quot;كاب الحيوان&quot; (AC)، هو مصدر الخلايا المحفزة التي يمكن برمجتها من خلال التلاعب في التعبير الجيني قبل إإكسبلنتس الإعداد. في هذه المخطوطة هي بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لاستخدام X. إإكسبلنتس المورق AC لاختبار في المختبر والآليات الجزيئية الجسم الحي والعمليات الخلوية تطوير العصبية الكامنة. ويرد تقنية، مما يتيح مراقبة دقيقة من أنماط التعبير الجيني في القيطم أنبوب الشرغوف العصبية، وهي خطوة أولية في تحديد العظة تقرير المصير. في حين أن مراقبة الأنسجة مسطحة شنت يشيع استخدامها في دراسة افراخ الدجاج 6، أنه لم يتم وصفها بشكل صحيح في القيطم. التلاعب في التعبير الجيني عن طريق حقن مرنا الاصطناعية أو MO في عن Blastomeres من 2 أو 4 أجنة مرحلة الخلية يسمح برمجة ACإإكسبلنتس 4. على سبيل المثال تثبيط مخلق العظام البروتين (BMP) مسار كتبها التعبير عن مكافحة BMP عامل رأس، ويعطي هوية العصبية إلى الخلايا AC 3. هو مفصل بروتوكول لأداء التعرض المحلي والتي تسيطر عليها وقت إإكسبلنتس AC لاشارات خارجية عن طريق الاتصال المباشر مع حبة راتنج تبادل أنيون. أخيرا يوصف تقنية لاختبار الميزات التنموية من الأسلاف العصبية في الجسم الحي بواسطة زرع إإكسبلنتس مختلطة أعد من خلايا متميزة مبرمجة فصلها وإعادة المصاحب. جنين الضفدع هو نموذج قوي لدراسة مبكرة التطور العصبي الفقاريات. الجمع بين التلاعب في التعبير الجيني ليزدرع الثقافات في المختبر يوفر معلومات هامة في دراسة الجهوية الظهارة العصبية، والانتشار، والتشكل 7-12. برمجة إإكسبلنتس AC سمحت وضع القلب وظيفية خارج الجسم الحي 13،14. الاستخداممن يزدرع تطعيم 15 أدت إلى التعرف على مفتاح النسخي الحد الأدنى من حمل البرنامج التمايز قمة العصبية 16. وintrathalamica المحدد للزونا (ZLI) هو مركز الإشارات التي تفرز القنفذ سونيك (Shh على) للسيطرة على النمو والإقليمي على الدماغ الأمامي الذيلية. عندما تتعرض باستمرار لShh على الخلايا الظهارية العصبية coexpressing عامل الجينات الثلاثة النسخ - باره مثل homeobox 2 (barhl2)، orthodenticle 2 (otx2) والايروكوا-3 (irx3) - الحصول على اثنين من خصائص المقصورة ZLI: اختصاص ل التعبير عن SHH، والقدرة على فصل من الخلايا العصبية لوحة الأمامية. كنظام نموذج، وستعرض تحريض على مصير ZLI إلى خلايا عصبية ظهارية 8. وتهدف هذه البروتوكولات في توفير بسيطة ورخيصة، وأدوات فعالة لعلماء البيولوجيا التطورية وغيرهم من الباحثين على استكشاف وزارة التعليم الأساسيhanisms للسلوكيات الأساسية الخلية العصبية. هذه البروتوكولات هي متعددة للغاية وتسمح بالتحقيق في طائفة واسعة من الاشارات العصبية تقرير خارجي والجوهرية. ويسمح على المدى الطويل في التحليل المجراة على التزام النسب العصبية والتفاعلات الاستقرائي والسلوكيات الخلية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;20909.290</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anion exchange resin beads</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>140- 1231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A-7888</td>
			<td>For culture of animal cappH 7.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycine&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15751-045&#160;</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A7906</td>
			<td>&#160;for bead preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stem cell-like xenopus embryonic explants to study early neural developmental features in vitro and in vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

وبناء على الاعتبارات الشكلية في الأنواع المختلفة، والتلاعب الجنينى، ونمط التعبير عن الجينات التنظيمية، حاصل على النموذج المفاهيمي الذي ينقسم لوحة العصبية إلى عرضية وطولية شرائح التي تحدد شبكة التنموية توليد حقول histogenic متميزة. في لوحة العصبية، وكلها بالفعل أنشأ براعم من الدماغ الأمامي، الدماغ المتوسط، الدماغ المؤخر والحبل الشوكي على طول محور انتيرو-الخلفي (AP) خلال تكون المعيدة (إعادة النظر في 23-25). أثناء تكون العصيبة، ويمكن الكشف عن حقول histogenic كما المجالات تقتصر مكانيا في التعبير الجيني. استنادا إلى أنماط التعبير عن الجينات التنظيمية، وينقسم منشم الدماغ الأمامي إلى ستة قطاعات عرضية التي تولد مجالات histogenic متميزة دعا prosomeres (ع). وينقسم كل prosomere في بطني (القاعدية) والظهرية (الجناحية) جزء (مراجعة في 26،27). في البرمائيات، وprosomere 2(P2) يؤدي إلى epithalamus والمهاد ومنظم لها وZ العمانية L imitans I ntrathalamica (ZLI) 8 (إعادة النظر في 28،29). على الشكل يتم عرض 1 إلى تصاعد مسطحة من X. المورق وX. مداري الأمامي الأنابيب العصبية في المراحل 30 و 32 و 35 بعد WM-DISH. أجريت WM-ISH وفقا لبروتوكول 1 باستخدام مجسات للعوامل النسخ fezf2 أن يصادف الدماغ الانتهائي وP3، barhl2 الذي يصادف p2، ويطوق القشرية والدماغ المتوسط، الايروكوا-1 (irx1) والايروكوا-3 (irx3) أن على التوالي علامة الذيلية P2 و P2 الجناحية وللSHH محدثة التخلق أن يصادف ZLI، الدماغ الأمامي القاعدية والدماغ المتوسط ​​(الشكل 1E). تحليل مقارن لمختلف أنماط التعبير الجيني يكشف أن الحد الأمامي من barhl2 P2 التعبير يتاخم حدود الذيلية التعبير fezf2 في P3 (الشكل 1A). irx3 تشارك في التعبير عنها SHH في ZLI المستقبل (الشكل 1B). داخل P2 مجال irx1 التعبير هي مكملة لتلك التي SHH (الشكل 1C) 8. نمط التعبير عن barhl2 في X. ويرد مداري في المرحلة 35 في الشكل 1D. يتم تقديم رسم تخطيطي للأراضي التعبير عن هذه الجينات في الدماغ الأمامي البرمائيات النامية في الشكل 1E. باستخدام بروتوكول 2 قدرة الخرز راتنج تبادل أنيون غارقة في Shh على للحث على التعبير SHH تم التحقيق في إإكسبلنتس أجهزة التكييف. X. المورق تم حقن الأجنة في الحيوانات عن Blastomeres 4 في خلايا 8 4 و المسرح مع من mRNAs ترميز لالأمامي ظهاري عصبي محفز رأس جنبا إلى جنب مع barhl2، سTX2، irx3 وGFP بمثابة التتبع الحقن. التعبير عن عامل رأس مكافحة BMP يمنع مسار BMP ويعطي هوية العصبية إلى الخلايا AC 3. نشير إلى AC معربا عن رأس كما Anteriorised كاب الحيوان (AAC). أعدت Blastocoel إإكسبلنتس سقف كما هو موضح في بروتوكول كانوا 2. AACS مثقف لمدة 48 ساعة على 18 درجة مئوية في اتصال مع حبة راتنج تبادل أنيون غارقة في المتوسط ​​مكيفة (CM) التي تحتوي على، أو لا، والجزء N-محطة يفرز من القنفذ سونيك محدثة التخلق من الفئران (N-Shh على). تم تحليل التعبير عن SHH الذاتية التي ISH (الشكل 2). تم الكشف عن التعبير عن القيطم SHH (Xshh) في الخلايا على اتصال مع حبة غارقة في CM مع N-Shh على ولكن ليس في الخلايا في اتصال مع حبة غارقة في CM دون N-Shh على (الشكل 2B). باستخدام بروتوكول 3 قدرة أنواع مختلفة من الخلايا لفصل من عنوت واحدإيه جرى التحقيق. X. تم حقن الأجنة المورق في الحيوانات عن Blastomeres 4 في خلايا 8 4 و المسرح مع من mRNAs الترميز لرأس مع أو بدون otx2، barhl2 وirx3، كما هو مبين، وذلك باستخدام ßGal أو في Gfp كأثر (الشكل 3A). تم فصل المرحلة 8/9 الرابطة وإعادة تجميعها لتوليد إإكسبلنتس يتألف من خلايا الظهارية العصبية مختلطة تحتوي على كل ßGal- والخلايا في Gfp، معربا عن. كانت إإكسبلنتس قمنا بإعادة تجميع تربيتها لمدة 48 ساعة على 18 ° C. وكشف النشاط ßGal باللون الأحمر وفقا ل30 (الشكل 3A). ولوحظ سلوك الخلايا باتباع التعريب في غضون للتجميع إعادة إإكسبلنتس. في إإكسبلنتس حيث يتم خلط الخلايا AACS مع AACS الخلايا معربا عن Otx2 (الأحمر)، والخلايا ßGal، معربا عن عدم عزل من الخلايا معربا عن GFP كلا النوعين من الخلايا المختلطة بحرية (الشكل 3B، 3C). في المقابل، فييتم خلط إإكسبلنتس الخلايا (GFP) حيث Otx2، معربا مع Barhl2، Otx2، Irx3 (BOI3) خلايا -expressing (ßGal)، والخلايا ßGal، معربا عن (الأحمر) شكل بقع متماسكة ولا تنتشر بشكل موحد في حدود تجميعها إعادة النباتى ( الشكل 3D، 3E). باستخدام بروتوكول 4، والتحقيق في سلوك الخلايا AC المبرمجة في الجسم الحي. X. المورق تم حقن الأجنة في الحيوانات عن Blastomeres 4 في 4 و 8 خلايا مراحل مع من mRNAs ترميز للرأس مع otx2 إما بمفرده أو بالاشتراك مع barhl2 وirx3. وقد استخدم ßGal كما التتبع. في موازاة ذلك، تم حقن الأجنة بالمثل مع من mRNAs ترميز للرأس والجزء يفرز N-محطة للSHH محدثة التخلق من الفئران (N-SHH). في مرحلة 8/9، تم فصلها إإكسبلنتس AC وعلى الفور إعادة تجميعها لتوليد إإكسبلنتس مختلطة تتألف من neuroepit<html> خلايا helial إما معربا عن N-Shh على وOtx2، أو التعبير عن N-Shh على وOtx2، Barhl2 وIrx3 (BOI3). قطع صغيرة من إإكسبلنتس مختلطة والمطعمة في لوحة العصبية من X. المورق الأجنة في مرحلة 14. تميزت الخلايا المطعمة مع ßGal تلطيخ (الحمراء). في المرحلة 35 تم تحليل التعبير عن SHH الذاتية التي ISH. عندما المطعمة في لوحة العصبية الأمامي من X. المورق الأجنة، إإكسبلنتس مختلطة تتألف من BOI3 وN-Shh على الخلايا معربا عن ضعت اثنين من ميزات معينة من الخلايا ZLI: أعربت الخلايا المطعمة Xshh وفصلها من الخلايا الظهارية العصبية الأمامي (الشكل 3C). في المقابل، عندما إإكسبلنتس مختلطة تتألف من Otx2 - والمطعمة وN-Shh- معربا عن الخلايا في X. المورق لوحة العصبية، فإن الخلايا المطعمة لا تعبر عن SHH ولم فصل من جيرانهم (الشكل 3B) 8. : المحافظة على together.within صفحة = &quot;1&quot;&gt; <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53474/53474fig1.jpg" /> الشكل 1. الأنابيب العصبية مسطحة شنت من X. المورق وX. مداري الأجنة كله يشن ISH المزدوج (A - D). يتم تنفيذ WM-ISH باستخدام fezf2، barhl2، irx1، irx3، وSHH كما تحقيقات على (A - C) X. المورق الأجنة في المراحل 30 و 32 و 35 و (D) X. مداري الجنين في المرحلة 35 كما أشار. يتم تشريح الأنابيب العصبية للأجنة التمثيلية وشقة شنت كما هو موضح في بروتوكول 1. تظهر الأنابيب العصبية تشريح من وجهة نظر الجانب، الظهرية يصل، اليسار الأمامي. يشار إلى علامات ومراحل. يشار إلى حدود منقاري والذيلية من P2 مع السهام. (AC) شريط النطاق لتقف على 0.5 مم. (D) والصورةشريط كال لتقف على 0.1 مم. . (E) رسم تخطيطي للعلامات الدماغ الأمامي في st.30 يشار barhl2 مجال التعبير في خطوط تحاك؛ وتظهر مجالات التعبير عن fezf2 (وردي)، SHH (الحمراء)، irx3 (الصفراء) وirx1 (الخضراء). ص تقف على prosomere. يظهر الغدة الصنوبرية التي تقع على رأس p2. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53474/53474fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53474/53474fig2.jpg" /> تم إعداد الشكل 2. الحث التعبير SHH في إإكسبلنتس برمجتها عن طريق الاتصال مع الخرز راتنج تبادل أنيون. أجهزة التكييف الصغيرة من الأجنة المحقونة مع ترميز مرنا للرأس، barhl2، otx2، وirx3، مع في Gfp كما التتبع. AAC يقف وأو Anteriorised كاب الحيوان. لل explants AAC معربا عن Barhl2، Otx2 وIrx3 (AAC BOI3) يتم تربيتها لمدة 48 ساعة في اتصال مع حبة غارقة في المتوسط ​​مكيفة (CM) إما تحتوي على N-Shh على، أو لا، كما هو مبين. ويتم تحليل لل explants التي ISH للتعبير عن القيطم (X) SHH. شريط النطاق لتقف على 0.5 مم. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53474/53474fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53474/53474fig3.jpg" /> الشكل 3. تحليل السلوك الفصل الخلية في تجميع إعادة إإكسبلنتس. (A) &#160; يتم حقن الأجنة X. المورق مع ترميز مرنا للرأس، otx2، barhl2 وirx3 كما هو مبين. تستخدم ßGal و GFP كما التتبع. في مرحلة تعد 09/08 أجهزة التكييف الصغيرة<html> ، فصلها وإعادة تجميعها لتوليد إإكسبلنتس مصنوعة من في Gfp / ßGal أنواع الخلايا المختلطة. لل explants يتم تربيتها لمدة 48 ساعة على 18 درجة مئوية وكشف النشاط ßGal (الحمراء). (B - E) إإكسبلنتس التمثيلية يتألف من خلايا مختلطة معربا عن البروتينات كما هو مبين ترد. AAC لتقف على Anteriorised كاب الحيوان. (B، C) الخلايا أجهزة التكييف معربا عن رأس وOtx2 (ßGal) تنتشر بشكل عشوائي عند مزجه مع خلايا اللجان الاستشارية معربا عن رأس (GFP). (C) عرض موسع لل(B). الخلايا (D) AACS معربا عن Barhl2، Otx2 وIrx3 (BOI3) (ßGal) تجمعوا من جديد وفصلها عن الخلايا AACS معربا عن Otx2 (GFP). (E) عرض موسع لل(D). (B، D) ويبلغ شريط مقياس 0.5 مم. (C، E) ويبلغ شريط مقياس 0.2 مم.ز &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/53474/53474fig4.jpg" /> الرقم 4. المبرمجة إإكسبلنتس يحمل ملامح تطورها عندما المطعمة في لوحة العصبية للجنين المرحلة 14 (A) مخطط التجريبي: مستعدون AACS من الأجنة المحقونة مع من mRNAs كما هو مبين. في مرحلة ما فصلها 8/9 الخلايا من سقف blastocoel وإعادة تجميعها لتوليد إإكسبلنتس مصنوعة من أنواع الخلايا المختلطة معربا عن ßGal (الحمراء). لل explants يتم تربيتها حتى وصلت أشقائهم المرحلة 14. قطعة صغيرة من يزدرع المختلط (المستطيل الأخضر) هو موضع شق داخل لوحة العصبية الأمامية. تزرع الأجنة تعمل حتى يتم تحليل المرحلة 35. الأجنة تشغلها WM-ISH باستخدام X. المورق SHH (Xshh) كما التحقيق. وكشف النشاط ßGal في لجنة التنسيق الإدارية الأحمرأوردينج إلى 30. (B، C) وترد 35 الأنابيب العصبية تمثيلية الجانبين المطعمة المرحلة، عرض الجانب، الظهرية يصل، اليسار الأمامي. (B) المطعمة مع AACS مختلطة معربا عن Otx2 وN-Shh على. (C) المطعمة مع AACS مختلطة معربا عن Barhl2، Otx2، Irx3 (BOI3) وN-Shh على. يشار إلى الخلايا المطعمة مع نجمة داود الحمراء. النجم الوردي يدل على الدماغ البيني المحتملين. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53474/53474fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

الخلايا الجذعية مثل<em&gt; القيطم</em&gt; الجنينية إإكسبلنتس إلى الدراسة في وقت مبكر العصبية التنموية الميزات<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

stem-cell-like-xenopus-embryonic-explants-to-study-early-neural

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

7.9K Views.  Institut Curie. In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. 

Video: Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

فهم توالد المبكر باستخدام المبسطة<em&gt; في الموقع</em&gt; بروتوكول التهجين في<em&gt; القيطم</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell migration. However, when explants are established, these cells also move collectively, maintaining many of the features which make individual keratocytes an attractive model to study migration: rapid rates of motility, extensive actin-rich lamellae with a perpendicular actin cable, and relatively constant speed and direction of migration. In early explants, the rapid interconversion of cells migrating individually with those migrating collectively allows the study of the role of cell-cell adhesions in determining the mode of migration, and emphasizes the molecular links between the two modes of migration. Cells in later explants lose their ability to migrate rapidly and collectively as an epithelial to mesenchymal transition occurs and genes associated with wound healing and inflammation are differentially expressed. Thus, keratocyte explants can serve as an in vitro model for the reepithelialization that occurs during cutaneous wound healing and can represent a unique system to study mechanisms of collective cell migration in the context of a defined program of gene expression changes. A variety of mutant and transgenic zebrafish lines are available, which allows explants to be established from fish with different genetic backgrounds. This allows the role of different proteins within these processes to be uniquely addressed. The protocols outlined here describe an easy and effective method for establishing these explant cultures for use in a variety of assays related to collective cell migration.

Zebrafish keratocytes migrate in cell sheets from explants and provide an in vitro model for the study of the mechanisms of collective cell migration in the context of epithelial wound healing. These protocols detail an effective way to establish primary explant cultures for use in collective cell migration assays.

الزرد خلية قرنية إإكسبلنتس لدراسة الهجرة الجماعية خلية وعودة التظهرن في شفاء الجروح الجلدية

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

التلاعب و<em&gt; في المختبر</em&gt; نضوج<em&gt; القيطم المورق</em&gt; البويضات، تلاه سهم داخل الهيولى حقن الحيوانات المنوية، لدراسة التطور الجنيني

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

التمايز العصبي للماوس الخلايا الجذعية الجنينية في المصل خالية أحادي الطبقة الثقافة

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often located distally from the regulated gene in intergenic regions or even within the body of another gene. The position independent nature of enhancer activity makes it difficult to match enhancers with the genes they regulate. Deletion of an enhancer region provides direct evidence for enhancer activity and is the gold standard to reveal an enhancer's role in endogenous gene transcription. Conventional homologous recombination based deletion methods have been surpassed by recent advances in genome editing technology which enable rapid and precisely located changes to the genomes of numerous model organisms. CRISPR/Cas9 mediated genome editing can be used to manipulate the genome in many cell types and organisms rapidly and cost effectively, due to the ease with which Cas9 can be targeted to the genome by a guide RNA from a bespoke expression plasmid. Homozygous deletion of essential gene regulatory elements might lead to lethality or alter cellular phenotype whereas monoallelic deletion of transcriptional enhancers allows for the study of cis-regulation of gene expression without this confounding issue. Presented here is a protocol for CRISPR/Cas9 mediated deletion in F1 mouse embryonic stem (ES) cells (Mus musculus129 x Mus castaneus). Monoallelic deletion, screening and expression analysis is facilitated by single nucleotide polymorphisms (SNP) between the two alleles which occur on average every 125 bp in these cells.

Experimental validation of enhancer activity is best approached by loss-of-function analysis. Presented here is an efficient protocol that uses CRISPR/Cas9 mediated deletion to study allele-specific regulation of gene transcription in F1 ES cells which contain a hybrid genome (Mus musculus129 x Mus castaneus).

توليد كريسبر / Cas9 ساطة Monoallelic الحذف لدراسة وظيفة محسن في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transcriptome على من التنميط<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; إنتاج الأبقار الأجنة قبل الزرع عن طريق اللونين ميكروأري منصة

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

تقنية لاستهداف حقن مكروي إلى البلدان النامية<em&gt; القيطم</em&gt; الكلى

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema and diminished visual acuity. However, human CECs are prone to compromised proliferative potential. Furthermore, stimulation of cell growth is often complicated by gradual endothelial-mesenchymal transition (EnMT). Therefore, understanding the mechanism of EnMT is necessary for facilitating the regeneration of CECs with competent function. In this study, we prepared a primary culture of bovine CECs by peeling the CECs with Descemet's membrane from the corneal button and demonstrated that bovine CECs exhibited the EnMT process, including phenotypic change, nuclear translocation of &#946;-catenin, and EMT regulators snail and slug, in the in vitro culture. Furthermore, we used a rat corneal endothelium cryoinjury model to demonstrate the EnMT process in vivo. Collectively, the in vitro primary culture of bovine CECs and in vivo rat corneal endothelium cryoinjury models offers useful platforms for investigating the mechanism of EnMT.

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

A primary culture of bovine corneal endothelial cells was used to investigate the mechanism of corneal endothelial-mesenchymal transition. Furthermore, a rat corneal endothelium cryoinjury model was used to demonstrate corneal endothelial-mesenchymal transition in vivo.

في المختبر وفي النماذج الحية لدراسة الانتقال القرنية غشائي-الوسيطة

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

التصور والتحليل الكمي من الأوعية الدموية الجنينية في<em&gt; زينوبوس تروبيكاليس</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic lamellae and smooth muscle cells (SMCs), and an outer layer of fibroblasts and extracellular matrix. In contrast to the widespread study of pathological models (e.g., atherosclerosis) in the adult aorta, much less is known about the embryonic and perinatal aorta. Here, we focus on SMCs and provide protocols for the analysis of the morphogenesis and pathogenesis of embryonic and perinatal aortic SMCs in normal development and disease. Specifically, the four protocols included are: i) in vivo embryonic fate mapping and clonal analysis; ii) explant embryonic aorta culture; iii) SMC isolation from the perinatal aorta; and iv) subcutaneous osmotic mini-pump placement in pregnant (or non-pregnant) mice. Thus, these approaches facilitate the investigation of the origin(s), fate, and clonal architecture of SMCs in the aorta in vivo. They allow for modulating embryonic aorta morphogenesis in utero by continuous exposure to pharmacological agents. In addition, isolated aortic tissue explants or aortic SMCs can be used to gain insights into the role of specific gene targets during fundamental processes such as muscularization, proliferation, and migration. These hypothesis-generating experiments on isolated SMCs and the explanted aorta can then be assessed in the in vivo context through pharmacological and genetic approaches.

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Protocols for studying the embryonic and perinatal murine aorta using in vivo clonal analysis and fate mapping, aortic explants, and isolated smooth muscle cells are detailed here. These diverse approaches facilitate the investigation of the morphogenesis of the embryonic and perinatal aorta in normal development and the pathogenesis in disease.

استخدام في فيفو والأنسجة والخلايا Explant نهج لدراسة Morphogenesis وأمراض الشريان الاورطي الجنينية والولادة

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...