The authors have no Acknowledgements.

1. خلية التحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نمو الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو د. خلايا discoideum في المتوسط AX في 23 درجة مئوية تحت الضوء في لوحات زراعة الأنسجة. تجنب الاحتفاظ الخلايا بكثافات عالية فوق 75٪ confluency. ملاحظة: للحصول على استجابة المثلى للإجهاد الحراري، والخلايا يجب أن تكون في مرحلة النمو الأسي وألا يكون قد بلغ مرحلة ثابتة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم قبل التصوير، والخلايا تنقسم إلى متوسطة مضان منخفضة (LFM) إلى 1 × 10 4 خلية / مل. ملاحظة: هذه الخطوة غير ضرورية للحد من مضان الخلفية التي تسببها على المدى المتوسط ​​AX. ويمكن تخفيض فترة حضانة لمدة لا تقل عن 2 ساعة. ومع ذلك، يمكن الحويصلات تناولها في المتوسط ​​AX لا تزال تولد بعض الإشارات الخلفية بعد 2 ساعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الخلايا للفحص المجهري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل التصوير، وخلايا الحصاد من لوحة الأنسجة في LFM ونقل عدد كاف من الخلايا في أطباق زجاجية أسفل. ملاحظة: عادة،1 × 10 5 خلية / مل غير كاف. ومع ذلك، إذا كان الإعداد التجريبية يتطلب فترات التصوير الطويلة (أطول من 8 ساعات)، تحتاج أعداد الخلايا إلى تعديل بعناية، ود. وخلايا discoideum الانتقال إلى دورة التنموية والبدء في تيار ومجموع المباراتين إذا أعداد الخلايا مرتفعة بينما المواد الغذائية منخفضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للخلايا ليستقر لمدة 20 دقيقة. إزالة الخلايا غير مسددة عن طريق استبدال بعناية الوسيلة المستخدمة مع المتوسط ​​الطازجة. </li></ol></li></ol> 2. التصوير ملاحظة: بروتوكول يمكن استخدامها في أنظمة واسعة المجال وكذلك في الاجهزة المجهر مبائر. استخدام مربع حضانة التحكم في درجة حرارته تغطي الأهداف والمسرح المجهر مفيد، ولكن ليس من الضروري التحكم في درجة حرارة. يتم تعيين درجة حرارة مربع الحضانة إلى أعلى درجة حرارة المستخدمة في التجربة، على سبيل المثال، إلى 40 درجة مئوية إذا يتم تنفيذ الإجهاد الحراري. وإلا، يتم ضبط درجة الحرارة إلى 256؛ C. وينبغي بذل التغيرات في درجات الحرارة في وقت مبكر يسمح النظام للتكيف، والتغيرات في درجات الحرارة أثناء التصوير يمكن أن تؤثر على التركيز. ملاحظة: أثناء التصوير، ويتم التحكم في درجة الحرارة باستخدام غرفة التبريد. درجة الحرارة الافتراضية لتصوير الخلايا غير المجهدة هي 23 درجة مئوية. لظروف الإجهاد الحراري، وزيادة درجة الحرارة وفقا لذلك إلى المستوى المطلوب. العنصر بيزو في غرفة التبريد يمكن أن تستجيب بسرعة جدا من التحول درجة الحرارة. ومع ذلك، فإن التركيز على الصور تتغير قليلا (يمكن أن تحيد لتصل إلى 20 ميكرون تبعا لتغير درجة الحرارة). وبالتالي مطلوب إعادة التركيز اليدوي في الدقائق الأولى من الحصول على الصور، إلا إذا تم تجهيز الاداة المستخدمة مع التركيز التلقائي الأجهزة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الصور في ظل ظروف غير وشدد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا صورة في ظل ظروف غير أكدت في 23 درجة مئوية، والحصول على ما لا يقل عن 6 مجالات عرض (FOVs). ملاحظة: حالة عدم الإجهاد يمكن أن يكون visualizإد إما عن طريق تسجيل قصيرة الوقت الفاصل بين (5-30 دقيقة) أو الحصول على اللقطات التمثيلية. لكل حالة أو خلية خط امتلاك حد أدنى من 6 مجالات عرض (FOVs). ملاحظة: في حالة الخلايا الفردية هي من مصلحة أو مركز الخلايا منها في منتصف مجال الرؤية وتسجيل سلسلة بلاط 3 × 3 مع فوف التي تحتوي على خلايا الفائدة في منتصف د. خلايا discoideum هي متحركة وقد تهاجر من فوف. ومع ذلك، فإن سلسلة بلاط 3 × 3 يزيد من مساحة يحتمل أن تستكشف من قبل خلية من الاهتمام وأنها لا تزال يمكن عزوها لفترات زمنية الفاصل بين ~ 6 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على مداخن Z من أقصى 7 ميكرون في 1-،25 ميكرون خطوات للقبض على وحدة التخزين بالكامل من الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صورة مرجع حقل مشرق لتقييم العدد الكلي للخلايا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الصور عن الإجهاد الحراري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة حرارة غرفة التبريد إلى 30 درجة مئوية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد عرض درجة الحرارة وصلت القيمة المطلوبة، إعادة تركيز يدويا في قناة الحقل مشرق وتحقق من كل FOVs سجلت قبل البدء في الوقت الفاصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء الوقت الفاصل عن 4 ساعات من الإجهاد الحراري مع فاصل زمني من 5-10 دقيقة بين نقاط الوقت. تحقق من التركيز الصحيح خلال الاستحواذ على النقطتين الأولى الساعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الصور أثناء الانتعاش <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الإجهاد الحراري، والحد من درجة الحرارة إلى 23 درجة مئوية، والانتظار لعرض درجة الحرارة لضبط وإعادة التركيز يدويا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سجل الوقت الفاصل بين الأفلام في مرحلة الانتعاش لمدة 8-10 ساعة في 10-20 فترات زمنية دقيقة. تحقق من التركيز الصحيح خلال الاستحواذ على نقطة لأول مرة. </li></ol></li></ol> تحليل 3. صورة ملاحظة: لتحديد عدد الخلايا إيواء بؤر عصاري خلوي، تقييم العدد الكلي للخلايا وعدد من الخلايا التي تحتوي على بؤر عصاري خلوي في كل مرةهيكل. ويرجع ذلك إلى صعوبة تقسيم الخلايا من الصور الحقل مشرق، يحتاج الكمي الذي يتعين القيام به يدويا. في ما يلي، يتم وصف وتحليل البيانات لحزمة معالجة الصور مجانية ((http://fiji.sc/Fiji). ويتطلب البرنامج المساعد &quot;خلية مكافحة&quot; (http://fiji.sc/Cell_Counter). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم العدد الكلي للخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل مشرق صورة حقل كومة (XYT) بالنقر على &quot;ملف&quot; و &quot;فتح&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح &quot;خلية مكافحة&quot; المساعد ( &quot;الإضافات&quot; - &quot;خلية مكافحة&quot;). تحميل كومة الصورة عن طريق النقر على &quot;تهيئة&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار النوع المناسب من العدادات وذلك بوضع علامة في الخانة المناسبة. ملاحظة: استخدام نوع (1)، مضادة للعدد الكلي للخلايا والنوع 2 كما مضادة للخلايا مع بؤر عصاري خلوي. عدد جميع الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ علامات بالنقر على &quot;حفظ علامات&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم عدد من الخلايا التي تحتوي على بؤر عصاري خلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"> &lt;لى&gt; تحميل hyperstack صورة مضان (XZYT) ( &quot;ملف&quot; - &quot;فتح&quot;)، وجعل الحد الأقصى لإسقاط كثافة استخدام &quot;Z-العارض&quot; (صورة / الأكوام). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح &quot;خلية مكافحة&quot; المساعد. تحميل الصورة الناتجة كومة (XYT) بالنقر على &quot;تهيئة&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل علامات بالنقر على &quot;علامات الحمل&quot;. تحذير: أسماء ملف الصورة المرجعية وكومة مضان يجب أن تكون متطابقة. إذا لزم الأمر، إعادة تسمية وفقا لذلك قبل تهيئة كومة الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر نوع علامة المناسب (انظر 3.1.3) وعدد الخلايا مع بؤر عصاري خلوي. علامات القائمة يمكن أن تستخدم كدليل إرشادي لمنصب الخلايا الفردية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد عدد من التهم لكل شريحة من خلال النقر على &quot;نتائج&quot; وحفظ التهم في أماكن أخرى لمزيد من العمليات الحسابية. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bonner, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+Formation+of+Cell+Aggregates+by+Chemotaxis+in+the+Development+of+the+Slime+Mold+Dictyostelium+Discoideum.">Evidence for the Formation of Cell Aggregates by Chemotaxis in the Development of the Slime Mold Dictyostelium Discoideum.</a> Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 1-26 (1947).</li><li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+during+development+of+Dictyostelium.">Cell signaling during development of Dictyostelium.</a> Developmental Biology. 391 (1), 1-16 (2014).</li><li>Nichols, J. M. E., Veltman, D., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+of+a+model+organism:+progress+with+Dictyostelium.">Chemotaxis of a model organism: progress with Dictyostelium.</a> Current Opinion in Cell Biology. 36, 7-12 (2015).</li><li>Williams, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+finds+new+roles+to+model.">Dictyostelium finds new roles to model.</a> Genetics. 185 (3), 717-726 (2010).</li><li>M&#252;ller-Taubenberger, A., Kortholt, A., Eichinger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+system+-+substantial+share:+The+use+of+Dictyostelium+in+cell+biology+and+molecular+medicine.">Simple system - substantial share: The use of Dictyostelium in cell biology and molecular medicine.</a> European Journal of Cell Biology. 92 (2), 45-53 (2013).</li><li>Malinovska, L., Palm, S., Gibson, K., Verbavatz, J. M., Alberti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+discoideum+has+a+highly+Q/N-rich+proteome+and+shows+an+unusual+resilience+to+protein+aggregation.">Dictyostelium discoideum has a highly Q/N-rich proteome and shows an unusual resilience to protein aggregation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2620-E2629 (2015).</li><li>Malinovska, L., Alberti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding+in+Dictyostelium:+Using+a+freak+of+nature+to+gain+insight+into+a+universal+problem.">Protein misfolding in Dictyostelium: Using a freak of nature to gain insight into a universal problem.</a> Prion. 9 (5), 339-346 (2015).</li><li>Schneider, K., Bertolotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+protein+quality+control+catastrophes+-+from+cells+to+organisms.">Surviving protein quality control catastrophes - from cells to organisms.</a> Journal of Cell Science. 128 (21), 3861-3869 (2015).</li><li>Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+and+misfolding.">Protein folding and misfolding.</a> Nature. 426 (6968), 884-890 (2003).</li><li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar-overlay+immunofluorescence:+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis.">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods in cell biology. 28, 347-356 (1987).</li><li>Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+spinning+disk+microscopy.">Live cell spinning disk microscopy.</a> Microscopy Techniques. 95, 57-75 (2005).</li><li>Samereier, M., Meyer, I., Koonce, M. P., Graef, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell-Imaging+Techniques+for+Analyses+of+Microtubules+in+Dictyostelium.">Live Cell-Imaging Techniques for Analyses of Microtubules in Dictyostelium.</a> Methods in cell biology. 97, 341-357 (2010).</li><li>Herman, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary+phase+in+yeast.">Stationary phase in yeast.</a> Current opinion in microbiology. 5 (6), 602-607 (2002).</li><li>Loomis, W. F., Wheeler, S., Wheeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+response+of+Dictyostelium.">Heat shock response of Dictyostelium.</a> Developmental Biology. 79 (2), 399-408 (1980).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

بروتوكول الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم لدراسة سلوك بروتين معين من الفائدة استجابة للإجهاد الناجم عن الحرارة. تم الإبلاغ عن زيادة درجة الحرارة إلى 30 درجة مئوية لتحريك استجابة الإجهاد الحراري وفي ظل هذه الظروف جدوى د. يتم تقليل discoideum بشكل ملحوظ. التعديلات بروتوكول يمكن تعديلها لمقارنة سلوك البروتينات المختلفة تحت ظروف الإجهاد نفسها. لهذا، يتم نقل الخلايا معربا عن بروتينات مختلفة مع نفس العلامة الفلورسنت في أطباق متعددة أيضا، مثل أربعة أطباق غرفة (القسم 1.3.1). ويمكن أيضا أن تطبق البروتوكول على خلايا المشترك، معربا عن البروتينات مع علامات مختلفة، مثل GFP أو طلب تقديم العروض. هذا يمكن أن يكون على سبيل المثال تستخدم لمراقبة سلوك مختلف مكونات نظام لمراقبة الجودة من البروتين (PQC). الخلايا معربا عن GFP الموسومة علامة التجميع ومختلف مكونات PCQ الموسومة طلب تقديم العروض ويمكن ملاحظة استخدام متعددة جيدازعته للتصوير. وهذا يضمن ظروف الإجهاد نفس (سرعة ارتفاع درجة الحرارة / نقصان، مدة درجة الحرارة زيادة / نقصان) ويسمح للدراسات المقارنة. وعلاوة على ذلك، فإن بروتوكول يمكن استخدامها لدراسة تأثير النظام PQC على استجابة الإجهاد الحراري. نشاط المكونات يمكن التضمين عن طريق تغيير مستويات التعبير باستخدام أدوات الوراثية مثل الضربة القاضية، أو overexpression أو باستخدام مثبطات معينة المتاحة تجاريا 6. وproteasome ويمكن تثبيط بإضافة MG132 (100 ميكرومتر) أو lactacystin (10 ميكرومتر) إلى وسط النمو. كوصي Hsp90 يمكن تحول دون استخدام geldanamycin (6 ميكرومتر) أو radicicol (10 ميكرومتر). كوصي HSP70 يمكن تثبيط مع VER-155088، على الرغم من أننا لا يمكن تأكيد فعالية تثبيط في إعدادات التجريبية لدينا حتى الآن. يجب إضافة مثبطات يوم واحد قبل التصوير ويتم تحضين الخلايا لمدة 14 ساعة. Criti<html> خطوات كال في إطار بروتوكول في خطوة حاسمة لتقييم الاضطراب الناجم عن الحرارة وحالة الخلايا السابقة للتجربة التصوير. وأظهرت دراسات في الخميرة أن الخلايا تكتسب مقاومة لمجموعة متنوعة من الضغوط البيئية خلال مرحلة ثابتة 13. نحن أيضا لاحظ الحد الأدنى من القدرة على الاستجابة للإجهاد الحراري المطبق إذا د. قد خلايا discoideum بلغت مرحلة ثابتة قبل التصوير. لذلك، والحفاظ على عدد الخلايا المستمر &lt;5 × 10 5 خلية / مل أمر بالغ الأهمية. وعلاوة على ذلك، يمكن أن أعداد الخلايا عالية لحث على الانتقال من دورة الخضري من د. discoideum لدورة التنموية، مما اثار مسارات الموت جوعا، والتي قد تؤدي إلى استجابة مختلفة للإجهاد الحراري. إذا تم التوصل إلى أرقام الهواتف المحمولة عالية في مرحلة الانتعاش بعد الإجهاد الحراري، تدفق وخلايا تجميع يمكن أن تتداخل مع تحليل البيانات وتتحرك الخلايا من التركيز (انظر الشكل 4). محتوى &quot;&gt; الحد من تقنية فقدان التركيز هي عنق الزجاجة للبروتوكول. خلال التغيرات في درجات الحرارة، ويمكن للطائرة الوصل تحول جذري، الأمر الذي يتطلب إعادة تركيز اليدوي في فترة زمنية فورا بعد تغيير درجة الحرارة. القفزة في التركيز يمكن أن يكون أحيانا شديد جدا بحيث لا يمكن التغلب عليها عن طريق ضبط تلقائي للصورة البرنامج، وخاصة إذا كان الوقت بين نقاط الوقت مرتفع. ومع ذلك، إذا تم تجهيز المجهر استخدامها مع ضبط تلقائي للصورة الأجهزة، وهذا الاختناق يمكن التحايل عليها. أهمية تقنية فيما يتعلق بأساليب الحالية بالمقارنة مع الاجهزة الموجودة مثل استخدام غرف مكيفة الهواء، وصناديق حضانة التحكم في درجة حرارته تغطي الأهداف والمسرح المجهر أو التحكم في درجة حرارته مراحل والياقات موضوعية، واستخدام غرفة التبريد يوفر تحكم أكثر دقة من المحيط درجة الحرارة. وبلتيير عنصر في غرفة التبريد يمكن الحفاظ على تيم ثابت وموحدperature في جميع أنحاء الإعداد التجريبية. في الاجهزة الكلاسيكية، قد تؤدي الاختلافات في درجة الحرارة المحلية إلى نتائج المراقبة المختلفة. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن أن تستجيب بسرعة وبسرعة مع التغيرات التي يسببها في درجة الحرارة، في حين التكيف مع الاجهزة الكلاسيكية ببطء شديد لتغيرات درجة الحرارة التي يسببها، وخصوصا خفض درجة الحرارة. وبلتيير عنصر في غرفة التبريد يمكن أن تشمل أيضا مجموعة واسعة درجة حرارة (15-40 درجة مئوية) من الاجهزة الكلاسيكية، والتي تصل درجات الحرارة مثل 15 درجة مئوية أو 40 درجة مئوية أمر صعب للغاية. Dictyostelium discoideum حساسة بشكل خاص للصور سمية. الدراسات السابقة استخدمت أسكوربات كما زبال للحد من صور سمية. ومع ذلك، وفترات التصوير الطويلة تتطلب مكملات إضافية. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام أسكوربات يقتصر على الدراسات التي آلية الفائدة لا يتأثر الملحق المضادة للأكسدة. نقترح أن التصوير التي تسيطر عليها درجة الحرارة يمكن أن تستخدم بمثابة appr البديلoach للحد من صور سمية، ويمكن دمجه مع إضافة أسكوربات إلى مزيد من الانخفاض سمية. التأثيرات الضوئية يمكن التقليل من خلال توفير درجة حرارة ثابتة وموحدة من 23 درجة مئوية باستخدام غرفة التبريد. خلايا تصويرها باستخدام التحكم في درجة الحرارة تظهر علامات أقل من الصور سمية، هذا التقريب الخلية، لفترة زمنية أطول. هذا كما يسمح التصوير مع كثافة أعلى، فترات زمنية أصغر أو أكثر من حقول نظر (FOVs). التطبيق العام وقد تبين الإجهاد الحراري في ارتفاع درجات الحرارة ان تثير رد فعل الإجهاد الحراري المختلفة (14). لذلك، وزيادة درجة الحرارة إلى 34 درجة مئوية أو 37 درجة مئوية قد تحفز استجابة مختلفة. بالإضافة إلى الإجهاد الحراري المطبق، ومدة حالة الإجهاد معين يمكن تعديلها لدراسة الاستجابة الفورية أو التكيف على المدى الطويل للإجهاد الحراري. بشكل عام، لا يمكن للبروتوكول وصفها يكونوسعت إلى مجموعة واسعة من التطبيقات. لأن التحكم في درجة الحرارة دقيقة يقلل إلى حد كبير الآثار الصورة السامة، وبروتوكول يمكن استخدامها في الأماكن التي تتطلب الأوقات عالية التعرض و / أو ارتفاع شدة الضوء الإثارة، على سبيل المثال، لتصور البروتينات مع مستوى التعبير منخفضة، أو بالاشتراك مع فترات زمنية قصيرة بين التصوير، على سبيل المثال، خلال الوقت الفاصل بين التصوير. كما يمكن أن يكون مفيدا لتصوير الأجسام التي تغطي الخلية بأكملها، على سبيل المثال، الأنابيب الدقيقة، كما تتطلب هذه الإعدادات على عدد كبير من البصرية ض أقسام.

Dictyostelium discoideum هم الانفرادي الاميبات المعيشة التربة التي تتغذى على البكتيريا والكائنات الدقيقة الأخرى، والتي يتم تناولها عن طريق البلعمة. لها دورة حياة فريدة ورائعة التي كانت مجالا رئيسيا للبحث منذ اكتشافه 1. الفائدة الأولى في التنمية متعددة الخلايا 2 و الأساس الجزيئي الكيميائي 3 استكمل قريبا من الدراسات التي تركز على الحركة الخلية القطبية خلية، مناعة فطرية. وبالإضافة إلى ذلك، D. وقدم discoideum كنظام نموذج ل4،5 البحوث الطبية الحيوية. في الآونة الأخيرة، أنشأنا د. discoideum كنظام جديد لدراسة نظام مراقبة الجودة 6،7 بروتين (PQC). وأثرى بروتيوم في مثل بريون البروتينات المعرضة للتجميع، الأمر الذي يشكل تحديا للبروتين مراقبة الجودة 8. للتحقيق في ما إذا كان د. وقد وضعت discoideum الآليات الجزيئية خاصة للسيطرة على درجة عالية AGالمعرضة للgregation بروتيوم، درسنا سلوك البروتينات علامة المعرضة للتجميع على حد سواء في ظل ظروف النمو الطبيعي وأثناء الإجهاد. ظروف الإجهاد، مثل الإجهاد الحراري، ويمكن استخدامها لزيادة نسبة البروتين misfolding 9. ولذلك، فإننا سعى نظام حيث أننا يمكن أن تحفز التغيرات في درجات الحرارة في وقت واحد اتباع سلوك البروتينات علامة. لهذا الغرض، ونحن الجمع بين التصوير الخلية الحية مع التدفئة تسيطر بلتيير-استخدام (غرفة التبريد) مرحلة الحراري إدراج. يسمح هذا الأسلوب لنا للحفاظ على درجة حرارة ثابتة وموحدة، وكذلك للحث على التغير في درجة الحرارة السريع، وبعد دقيقة و. يستخدم التصوير الخلية الحية لدراسة مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية في د. discoideum. ومع ذلك، يواجه هذا النهج اثنين من القيود الرئيسية. أولا، تعرض الخلايا لحركية عالية وتميل إلى الهجرة خارج مجال الرؤية، وبالتالي تتبع الخلايا الفردية غالبا ما يتطلب التصوير في منطقة واسعة. تنقل الخلية يمكنيمكن خفضها من خلال تراكب آجار 10، ولكن هذه الظروف ليست مناسبة للتصوير على المدى الطويل بسبب انخفاض في قدرتها على البقاء. ثانيا، D. تظهر خلايا discoideum حساسية عالية بشكل خاص للصور سمية، مما يؤدي إلى التقريب الخلية واعتقال الإنقسامية 11. وتناولت البروتوكولات السابقة هذه المشكلة عن طريق إضافة أسكوربات على القضاء على الجذور والحد من التعرض مرة 12. هذا الأخير يمكن أن يكون حاسما إذا ما أعرب عن البروتين من الفائدة عند مستويات منخفضة ويظهر إشارة مضان ضعيفة. ويشير الكتاب أيضا إلى توفير درجة حرارة ثابتة من 21 درجة مئوية إما عن طريق التصوير في غرفة مكيفة الهواء أو باستخدام صناديق حضانة التحكم في درجة حرارته، والتي تغطي الهدف والمجهر المرحلة 12. هنا، نحن تصف طريقة مع تحسين التحكم في درجة الحرارة باستخدام غرفة التبريد وضعت في 23 درجة مئوية. أثناء التصوير لدينا مجموعة المتابعة تعزز بشكل كبير من المقاومة إلى الصورة سمية. هذايسمح استخدام التعرض مرات أعلى وأعلى كثافة الضوء الإثارة. هذا الأمر أهمية خاصة خلال الوقت الفاصل بين التصوير، كما تحتاج إلى فترات زمنية لتكون متوازنة بعناية ضد عدد من مواقع تصوير ووقت التعرض المستخدمة. إمكانية زيادة أعداد مواقف تصوير أيضا يسمح للتغطية منطقة التصوير أوسع ويسهل تتبع الخلايا الفردية على مدى فترة أطول من الزمن.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="587">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AX Medium</td>
			<td style="width:85px;">ForMedium</td>
			<td style="width:119px;">AXM0102</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LoFlo medium</td>
			<td>ForMedium</td>
			<td>LF1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MG132</td>
			<td style="width:85px;">Sigma</td>
			<td>C2211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lactacystin</td>
			<td style="width:85px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L6785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Geldanamycin</td>
			<td style="width:85px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-200617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Radicicol</td>
			<td style="width:85px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-200620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MatTek disch 35 mm</td>
			<td style="width:85px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td>glass bottom imaging dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CellViell cell culture dish</td>
			<td style="width:85px;">Greiner</td>
			<td align="right" style="width:119px;">627870</td>
			<td>4-compartments glass bottom imaging dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thermal Stage Heater/Cooler Insert</td>
			<td style="width:85px;">Warner Istruments</td>
			<td style="width:119px;">TB-3/CCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bipolar temperature controller</td>
			<td style="width:85px;">Warner Istruments</td>
			<td style="width:119px;">CL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Liquid cooling System</td>
			<td style="width:85px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:119px;">LCS-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the protein quality control system of d. discoideum using temperature-controlled live cell imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

بروتوكول التصوير وصفه يمكن استخدامها لتحليل سلوك البروتينات مثل بريون المعرضة للتجميع في الاميبا د. يظهر discoideum أثناء الإجهاد الحراري. الشكل 1 توزيع GFP الموسومة polyglutamine البروتين Q103 في الخلايا تحت ظروف النمو الطبيعية (الشكل 1A)، 2 بعد ساعات من الإجهاد الحراري في 30 درجة مئوية (الشكل 1B) وبعد 6 ساعات من الانتعاش التوتر و النمو في ظروف النمو الطبيعية (الشكل 1C). على ارتفاع درجة الحرارة من 23 درجة مئوية إلى 30 درجة مئوية، وعلامة-Q103 GFP coalesces من توزيع منتشر إلى منقط الهياكل. بعد الإفراج الإجهاد والنمو في درجة الحرارة العادية، وهذه الهياكل تذوب. إعادة توزيع Q103-GFP وتشكيل الحرارة التي يسببها الإجهاد عصاري خلوي بؤر يمكن كميا باستخدام تحليل الصور. ويبين الشكل 2A تحليل FOVs الفردية باستخدام فيجي والمساعد &quot;Cالذراع مكافحة &quot;. ويبين الشكل 2B الكمي لاستجابة الإجهاد الحراري، وهذا يدل على أن عصاري خلوي Q103-GFP زيادة بؤر في عدد مع استمرار الإجهاد الحراري. وخلال الإجهاد الحراري، ومراقبة الجودة البروتين (PQC) النظام هو طغت، وبالتالي aggregation- البروتينات عرضة مثل البروتين Q103 مثل بريون لا يمكن الحفاظ في دولة قابلة للذوبان وعلى نحو متزايد مجموع المباراتين في بؤر عصاري خلوي. الخلايا تظهر أيضا التقريب مميزة، كما هو مبين في الشكل 1B، والحد من بؤر عصاري خلوي بعد إزالة التوتر تشير إلى أن مجمعة تذاب البروتينات. جودة التصوير حساسة لكثافة الخلايا الأولية. ويبين الشكل 3 مثال على الخلايا بعد التعافي من الإجهاد، مقارنة الكثافة المناسبة الأولية الخلية (الشكل 3A) وعالية الكثافة الخلية الأولية (الشكل 3B). إذا كانت كثافة الخلية الأولية مرتفعة جدا، نجم خلاياتيد لتشكيل تيارات كما هو مبين في الشكل 3B. وقد انتقل هذا الذي يفرض صعوبات على القياس الكمي لاحق كما هو الخلايا من البؤري. ويمكن استخدام الطريقة الموصوفة لرصد التغيرات التي يسببها درجة الحرارة كما هو موضح أعلاه. ويمكن أن تستخدم أيضا للحد من صور سمية عند التصوير في درجة حرارة النمو الفسيولوجية الشكل 4 يوضح مقارنة بين الخلايا المصورة في 23 درجة مئوية في تبريد الغرفة (الشكل 4A) والخلايا المصورة دون التحكم في درجة الحرارة في غرفة مكيفة الهواء، تعيين إلى 25 درجة مئوية (الشكل 4B). عند التعرض المستمر للضوء الإثارة، وخلايا تعتقل عندما لا تصويرها تحت ظروف التحكم في درجة حرارته. هذا التغيير في شكل الخلية تشير إلى الإجهاد. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig1.jpg" /> شكل 1: <s<html> ترونج&gt; بروتينات تشبه بريون المعرضة للتجميع تغير توزيع الخلوي أثناء الإجهاد الحراري. وأعرب-GFP الموسومة-polyglutamine الغنية هنتنغتين اكسون 1 (Q103) جوهري في AX2-214 د. خلايا discoideum (إشارة GFP يصور في مقلوب جدول البحث على نطاق والرمادي). (A) في ظل ظروف النمو الطبيعي عند 23 درجة مئوية، Q103-GFP يتم توزيع منتشرة في السيتوبلازم. (ب) بعد 2 ساعة من الإجهاد الحراري في 30 درجة مئوية، Q103-GFP coalesces إلى بؤر عصاري خلوي (الأسهم الحمراء). تظهر الخلايا تغيير شكل مميز وتعتقل. (C) وعند الإفراج التوتر ونمو في 23 درجة مئوية، وحل بؤر عصاري خلوي. بعد 6 ساعات، أي بؤر عصاري خلوي يمكن ملاحظتها. شريط النطاق = 10 ميكرون. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54730/54730fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> الصفحة = &quot;1&quot;&gt; <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig2.jpg" /> الشكل 2: الكمي لتشكيل بؤر عصاري خلوي الناجم عن الحرارة (أ) تحليل الخلايا باستخدام حزمة لمعالجة الصور المجانية فيجي والمساعد &quot;خلية مكافحة&quot;. يتم تحديد المبلغ الكلي للخلايا (نوع 1، علامات مكافحة الزرقاء) في صورة حقل مشرق. يتم تحميل علامات في قناة GFP وعدد من الخلايا التي تحتوي على بؤر عصاري خلوي (نوع 2، علامات مكافحة الحمراء) يتم تحديد. (ب) الكمي بؤر بعد 3 ساعات من الإجهاد الحراري في 30 درجة مئوية و 3 ساعات من الانتعاش الإجهاد في 23 ° C (ن = 4 حقول للعرض، خطأ بار = SD). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54730/54730fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig3.jpg" /> <stron<html> ز&gt; الشكل 3: تأثير كثافة الخلايا على المدى الطويل الوقت الفاصل بين التصوير (A) خلايا تصويرها في كثافة الخلايا الأولية &lt;10 5 خلية / مل. بعد 3 ساعات من الإجهاد الحراري في 30 درجة مئوية و 6 ساعات من الانتعاش الإجهاد في 23 درجة مئوية، والخلايا لا تزال في دورة الخضري والانقسام. فقط عدد قليل من خلايا خروج البؤري. (ب) خلايا تصويرها في كثافة الخلايا الأولية&gt; 10 6 خلية / مل. بعد 9 ساعة من التصوير (الإعدادات كما في A)، وقد دخل خلايا دورة التنموية وبدأ تدفق وتجميع. الخلايا في المجاميع لا يمكن تمييزها بوضوح. جزء كبير من الخلايا مخارج البؤري ولا يمكن تحليلها. شريط النطاق = 10 ميكرون. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54730/54730fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <html> .jpg و&quot;/&gt; الشكل 4: تأثير التحكم في درجة الحرارة على التأثيرات الضوئية (A) خلايا تصويرها لمدة 10 دقيقة مع التحكم في درجة الحرارة عند 23 درجة مئوية: 6 حقول نظر، ض المكدس (المباعدة بين 0.5 ميكرومتر، عينة سماكة 8 ميكرومتر)، والفاصل الزمني (المجموع الوقت 10 دقيقة، انقضاء 1 دقيقة)، قناة GFP (0.07 مللي ثانية وقت التعرض، وكثافة الليزر 10٪)، قناة طلب تقديم العروض (0.1 مللي ثانية وقت التعرض، وكثافة الليزر 10٪). تظهر خلايا أي علامات التغيرات المورفولوجية المميزة المرتبطة بالإجهاد الضوئي السمي. (ب) خلايا تصويرها لمدة 10 دقيقة دون التحكم في درجة الحرارة (نفس الظروف كما هو الحال في A). خلايا يحمل علامات سمية ضيائية الناجم عن التقريب، مشيرا إلى الإجهاد. شريط النطاق = 10 ميكرون. تم تصوير الخلايا على نظام يقوم على المجهر مع الهدف 100X / 1.4 الفتحة العددية (NA). وقد تم جمع الصور مع كاميرا CCD كما 1024 س 1024 بكسل الملفات باستخدام 1 × 1 binning.4large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging at JoVE.com

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

دراسة نظام لمراقبة الجودة من البروتين<em&gt; D. discoideum</em&gt; عن طريق درجة الحرارة التي تسيطر التصوير الخلية الحية

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

studying-protein-quality-control-system-d-discoideum-using

Research

JoVE Journal

Biology

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

6.1K Views.  Max-Planck Institute for Molecular Cell Biology and Genetics. The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Video: Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

باستخدام نظام التقطير GELFREE 8100 لتقطير الوزن الجزيئي وبناء مع مرحلة الانتعاش السائل

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

تعيش خلية التصوير والتحليل الكمي من الخلايا الظهارية في الجنينية القيطم المورق</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

يعيش التصوير من النتوء خلية من البشرة من اسماك الزرد النامية

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

التصوير G - مستقبلات البروتين يقترن (GPCR) بوساطة الأحداث يشير إلى أن التحكم في الانجذاب الكيميائي Dictyostelium Discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D التصوير التجميع البروتين في الخلايا الحية

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

يعيش التصوير خلية من الأحداث الالتهام الذاتي المبكر: Omegasomes وما بعدها

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

نظام الثقافة الماوس الجنين الأمعاء الجامعة ل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; التلاعب في مسارات إشارات وتصوير لايف ثلاثي الأبعاد التنمية الزغبة

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the formation of thrombi that occlude the vasculature and injure organs, with life-threatening consequences. This motivates scientific research on platelet function and the development of methods to track cell-biological processes as they occur under flow conditions.
A variety of flow models are available for the study of platelet adhesion and aggregation, two key phenomena in platelet biology. This work describes a method to study real-time platelet degranulation under flow during activation. The method makes use of a flow chamber coupled to a syringe-pump setup that is placed under a wide-field, inverted, LED-based fluorescence microscope. The setup described here allows for the simultaneous excitation of multiple fluorophores that are delivered by fluorescently labeled antibodies or fluorescent dyes. After live-cell imaging experiments, the cover glasses can be further processed and analyzed using static microscopy (i.e., confocal microscopy or scanning electron microscopy).

This work describes a fluorescence microscopy-based method for the study of platelet adhesion, spreading, and secretion under flow. This versatile platform enables the investigation of platelet function for mechanistic research on thrombosis and hemostasis.

تصوير الخلايا الحية من تحبيب الصفائح الدموية والإفراز تحت التدفق

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic disorder, cardiovascular disease, and kidney disease. Currently, there is no available method to assess LDL uptake while simultaneously monitoring for health of the cells. The current study presents a protocol, using a live cell imaging analysis system, to acquire serial measurements of LDL influx with concurrent monitoring for cell health. This novel technique is tested in three human cell lines (hepatic, renal tubular epithelial, and coronary artery endothelial cells) over a four-hour time course. Moreover, the sensitivity of this technique is validated with well-known LDL uptake inhibitors, Dynasore and recombinant PCSK9 protein, as well as by an LDL uptake promoter, Simvastatin. Taken together, this method provides a medium-to-high throughput platform for simultaneously screening pharmacological activity as well as monitoring of cell morphology, hence cytotoxicity of compounds regulating LDL influx. The analysis can be used with different imaging systems and analytical software.

This protocol provides an efficient approach to measuring LDL cholesterol uptake with real time influx rates using a live cell imaging system in various cell types. This technique provides a platform to screen the pharmacological activity of compounds affecting LDL influx while monitoring for cell morphology and hence potential cytotoxicity.

مقايسة الامتصاص الكولسترول استخدام الخلايا الحية التصوير التحليل مع خلية المراقبة الصحية

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...