This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).

<ol>
	<li>Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Information+processing+by+RNA+polymerase:+recognition+of+regulatory+signals+during+RNA+chain+elongation.">Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation.</a> J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).</li><li>Burgess, R. R., Anthony, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+sigma+docks+to+RNA+polymerase+and+what+sigma+does.">How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does.</a> Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).</li><li>Gusarov, I., Nudler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+intrinsic+transcription+termination+by+N+and+NusA:+the+basic+mechanisms.">Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms.</a> Cell. 107 (4), 437-449 (2001).</li><li>Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NusA+N-terminal+domain+is+necessary+and+sufficient+for+enhancement+of+transcriptional+pausing+via+interaction+with+the+RNA+exit+channel+of+RNA+polymerase.">The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase.</a> J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).</li><li>Yang, X., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+between+RNA+polymerase+and+the+elongation+factor+NusA.">The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA.</a> RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).</li><li>Artsimovitch, I., Henkin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+approaches+to+analysis+of+transcription+termination.">In vitro approaches to analysis of transcription termination.</a> Methods. 47 (1), 37-43 (2009).</li><li>Decker, K. B., Hinton, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+regulation+at+the+core:+Similarities+among+bacterial,+archaeal,+and+eukaryotic+RNA+polymerases.">Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases.</a> Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).</li><li>Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+easy+to+stop+RNA+polymerase?.">Is it easy to stop RNA polymerase?.</a> Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).</li><li>Murakami, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+bacterial+RNA+polymerase.">Structural biology of bacterial RNA polymerase.</a> Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).</li><li>Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transcription+as+a+target+for+antibacterial+drug+development.">Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).</li><li>Yang, X., Ma, C., Lewis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vector+system+that+allows+simple+generation+of+mutant+Escherichia+coli+RNA+polymerase.">A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase.</a> Plasmid. 75, 37-41 (2014).</li><li>Burgess, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+large+scale+purification+of+Escherichia+coli+deoxyribonucleic+acid-dependent+ribonucleic+acid+polymerase.">A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase.</a> J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).</li><li>Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-overexpression+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+subunits+allows+isolation+and+analysis+of+mutant+enzymes+lacking+lineage-specific+sequence+insertions.">Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions.</a> J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).</li><li>Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transcription+inhibitor+of+RNA+polymerase+holoenzyme+formation+by+structure-based+drug+design:+From+in+silico+screening+to+validation.">Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation.</a> ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).</li><li>Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase-induced+remodelling+of+NusA+produces+a+pause+enhancement+complex.">RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex.</a> Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).</li><li>Lewis, P. J., Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+vectors+for+controlled+expression+and+dual+labelling+of+protein+fusions+in+Bacillus+subtilis.">GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis.</a> Gene. 227 (1), 101-110 (1999).</li><li>Artsimovitch, I., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pausing+by+bacterial+RNA+polymerase+is+mediated+by+mechanistically+distinct+classes+of+signals.">Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).</li><li>Vassylyev, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+bacterial+RNA+polymerase+holoenzyme+at+2.6+&#197;+resolution.">Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 &#197; resolution.</a> Nature. 417, 712-719 (2002).</li><li>Artsimovitch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+transcription+regulation+by+alarmone+ppGpp.">Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp.</a> Cell. 117 (3), 299-310 (2004).</li><li>Bordier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+rifampicin-resistant+RNA+synthesis+by+rifampicin-RNA+polymerase+complexes.">Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes.</a> FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).</li><li>Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+assay+to+measure+the+real-time+kinetics+of+nucleotide+incorporation+during+transcription+elongation.">Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation.</a> J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

في جميع الكائنات الحية، والنسخ هو عملية تنظيم محكم. في المختبر وضعت المقايسات النسخ لتوفير منصة لاختبار آثار عوامل النسخ، والجزيئات الصغيرة ومثبطات النسخ. في هذه الورقة الأسلوب، وقد وصفت مقايسة لنسخ البكتيرية العام. المقايسات النسخ جنبا إلى جنب مع تسلسل هلام الكهربائي من النصوص مهمة جدا لدراسات الميكانيكية لأنها تسمح التصور لجميع المنتجات النسخ على طول الخط. ونتيجة لذلك، وهذه الطريقة هي قادرة على تحديد تأثير التغيرات الطفيفة في ظروف التفاعل والكشف عن آلية مقبولة للعمل. وعلاوة على ذلك، يصبح من الممكن تصميم المقايسات النسخ محددة فيما يتعلق ظيفة من عوامل النسخ مع آليات غير معروفة للعمل. في هذه الورقة وصفنا أيضا طريقة لتأكيد آلية عمل مثبط لRNAP holoenتشكيل إنزيم. الطريقة الموصوفة هنا يمكن عرض تغيير كل نسخة الرنا مع مرور الوقت، ومع التعديل المناسب يمكن تمكين اختبار وكلاء المضادة للبكتيريا ضد كل خطوة من النسخ حسب الاقتضاء. مقايسة متعددة على مدار يمكن أن تستخدم النسبي طريقة فحص بسيط لتحديد النسخ التي تستهدف مثبطات جديدة، في حين أن الفحص جولة واحدة يمكن استخدامها لدراسة آلية مثبطات، مثل خصائص تنافسية / غير تنافسية. لاحظ أن تجميع الجزيئات الصغيرة يمكن أن يسبب إصابات إيجابية كاذبة باسم مثبطات غير تنافسية في عملية اكتشاف المخدرات واحدة دراسة الآلية الجولة قد توفير نهج شامل لتقييم الكر إلى الرصاص. ونتيجة لذلك، فإن هذه العملية النسخ تسيطر قادرة على الكشف عن بالضبط كيف يؤثر المانع النسخ، والتي يمكن أن تساعد في دي نوفو تصميم الأدوية ترشيد. جنبا إلى جنب مع معلومات عالية الدقة على مواقع الربط المانع بواسطة الأشعة السينية ستو البلوراتيموت، وتصميم الأدوية العقلاني القائم على بنية تكون قابلة للغاية لتطبيق في اكتشاف المخدرات تستهدف النسخ. وعلى الرغم من النتائج الإنتاجية العالية لا يمكن الحصول عليها مع فحوصات في المختبر النسخ، فهي مفيدة للغاية في تشريح آليات دقيقة المرتبطة السيطرة على النسخ. مكونات وشروط الفحص يمكن تعديلها بسهولة لتلبية الاحتياجات الفردية. عوامل مختلفة (على سبيل المثال، نوسا) 4، 15، جزيئات صغيرة (على سبيل المثال، ppGpp) 19 و / أو النسخ مثبطات (على سبيل المثال، ريفامبيسين) 20 من الفائدة يمكن أن تضاف إلى اختبار وظائف في تنظيم النسخ. قالب الحمض النووي يجب أن تكون مصممة بشكل فردي، مع اختيار دقيق من المروجين قوي، تسلسل وقفة والإنهاء. من أجل تحقيق استنساخ عالية من الفحص، يجب أن البروتينات العالية النقاء وخالية من النشاط ريبونوكلياز المتبقية، والعازلة النسخ، قالب الحمض النووي، وحل سهم يجب أن يتم في DEPC ركائز NTP تعامل المياه. وقد وصفت استخدام هذه البرامج الوطنية المشعة في هذه الورقة، ولكن النيوكليوتيدات الفلورسنت ويمكن أيضا أن تستخدم 21. نوعية القالب الحمض النووي هو أمر حاسم لنجاح فحص النسخ. يجب تضمين تباعد كافية بين المروج / إيقاف مؤقت / فاصل، والسماح للمنتجات النسخ المختلفة لفصلها وفحصها بشكل صحيح. هلام تسلسل يجب أن تصب بشكل صحيح ويجب استخدام عازلة TBE جديدة نسبيا بالنسبة الكهربائي لتحقيق أعلى دقة ممكنة من النصوص الحمض النووي الريبي. إذا لاحظت تدهور المنتج النسخ، ويجب أن تدمج جودة عالية المانع ريبونوكلياز في خليط التفاعل النسخ. أنابيب ونصائح ماصة يجب تعقيمها مزدوجة وقفازات يجب أن ترتديه في جميع الأوقات عند إجراء الفحص، وذلك للحد من إدخال ريبونوكلياز.

النسخ هو العملية التي يتم توليفها من الحمض النووي الريبي DNA قالب معين. في الخلايا حقيقية النواة هناك ثلاثة RNAPs متميزة: RNAP أنا المحاضر السلائف الريباسي، RNAP الثاني هو المسؤول عن تخليق مرنا وبعض الرنا نووية صغيرة، ويتم تنفيذ تركيب 5S الريباسي والحمض الريبي النووي النقال من قبل RNAP الثالث. في البكتيريا، لا يوجد سوى RNAP واحدة مسؤولة عن نسخ من جميع الطبقات من الحمض النووي الريبي. هناك ثلاث مراحل النسخ: بدء، واستطالة وإنهاء الخدمة. النسخ هي واحدة من العمليات الأكثر ينظم غاية في الخلية. كل مرحلة من مراحل دورة النسخ تمثل نقطة تفتيش لتنظيم التعبير الجيني 1. لبدء، RNAP أن اقترانه عامل سيغما لتشكيل عميم الإنزيم، وهو مطلوب لتوجيه الإنزيم إلى مواقع معينة تسمى المروجين 2 لتشكيل مجمع المروج مفتوحة. وفي وقت لاحق، مجموعة كبيرة من عوامل النسخ هي المسؤولة عن تنظيم سالأنشطة و RNAP خلال استطالة وإنهاء مراحل. عامل النسخ فحص هنا هو البروتين الحفظ جدا وأساسي، نوسا. وتشارك في تنظيم التوقف النسخ وإنهاء الخدمة، وكذلك مكافحة إنهاء خلال التوليف الريباسي 3-5. في المختبر تم تطويرها المقايسات النسخ كأدوات قوية لدراسة الخطوات التنظيمية المعقدة خلال النسخ 6. بشكل عام، لا بد من جزء طولي من الحمض النووي بما في ذلك منطقة المروج كقالب لالنسخ. عادة يتم إنشاء قالب الحمض النووي عن طريق PCR أو linearizing البلازميد. ثم تضاف تنقية البروتينات والبرامج الوطنية (بما في ذلك رديولبلد واحد NTP لأغراض الكشف) والمنتج تحليل بعد فترة المطلوبة من الحضانة. باستخدام القوالب المناسبة وظروف التفاعل، وقد تم فحص جميع مراحل النسخ باستخدام هذا النهج الذي مكن التوصيف الجزيئي مفصل من transcription خلال نصف القرن الماضي 7. جنبا إلى جنب مع معلومات عن هيكل 3-الأبعاد من RNAP كان من الممكن أيضا للتحقيق في الآلية الجزيئية لتثبيط النسخ بواسطة المضادات الحيوية ويؤدي للمضادات الحيوية، واستخدام هذه المعلومات في تطوير جديدة، والمخدرات تحسين 8-10. في هذا العمل ونحن تقديم أمثلة عن كيف يمكن استخدام المقايسات النسخ لتحديد آلية التنظيم من قبل النسخ استطالة / عامل إنهاء نوسا، وكيف أن آلية عمل رواية بدء النسخ المانع الرصاص يمكن تحديدها.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Obtain the proteins required for transcription assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli RNAP</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>S90250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of DEPC-treated water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethyl pyrocarbonate (DEPC)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>D5758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion Nuclease-Free Water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA template preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard&#160;Plus&#160;SV Minipreps DNA Purification System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACCUZYME Mix</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-25028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 3300 fluorospectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A6559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>U1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>G3776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>C9274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Purity rNTPs</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27-2025-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-32P UTP&#160;</td>
			<td>PerkinElmer&#160;&#160;</td>
			<td>BLU007C001MC</td>
			<td>Radioactive compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA ladder preparation&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1&#8211;1 kb</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>69003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>DTT-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNAP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;&#160;</td>
			<td>165-3804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmacote&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>SL2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>U6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris(hydroxymethyl)aminomethane&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>154563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boric acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>B7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>ED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/bis-acrylamide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#697;&#8242;,N&#697;&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N",N"-Tetramethylethylenediamine (TEMED) </td>
			<td>Sigma-Aldrich </td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rifampicin&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>R3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F9037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene cyanol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>X4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heparin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>84020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>DTT-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman&#160;3MM Chr Chromatography Paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-714-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioactive decontaminant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decon 90</td>
			<td>decon</td>
			<td>decon90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon Trio+ imager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>63-0055-89</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro transcription assays and their application in drug discovery

في المختبر وتم وضع المقايسات النسخ وتستخدم على نطاق واسع لسنوات عديدة لدراسة الآليات الجزيئية تشارك في النسخ. وتتطلب هذه العملية متعددة فرعية تعتمد على الحمض النووي RNA البلمرة (RNAP) ومجموعة من عوامل النسخ التي تعمل على تعديل نشاط RNAP خلال التعبير الجيني. ويستخدم هلام التسلسل الكهربائي من النصوص رديولبلد لتوفير المعلومات الآلية مفصلة حول كيفية عائدات النسخ، وما هي مواصفات يمكن أن تؤثر عليه. في هذه الورقة وصفنا بروتوكول لدراسة كيفية عامل استطالة ضروري نوسا ينظم التوقف النسخي، وكذلك وسيلة للتعرف على مادة مضادة للبكتريا التي تستهدف بدء النسخ من خلال تثبيط RNAP تشكيل عميم الإنزيم. هذه الأساليب يمكن أن تستخدم كمنصة لتطوير مناهج إضافية لاستكشاف آلية العمل من عوامل النسخ التي ما زالت تزال غير واضحة، وكذلك آجا المضادة للبكتيريا جديدةنهاية الخبر تستهدف النسخ وهو الهدف المخدرات غير مستخدمة بالقدر الكافي في البحث والتطوير للمضادات الحيوية.

كفاءة النسخ يمكن تحديد ذلك عن طريق قياس مستوى الإشعاع في نطاقات في نقاط زمنية مختلفة. فحص التوقف لاختبار وظيفة عامل نوسا تمكين التصور من وقفة، وإنهاء الخدمة، وجريان المنتجات (الشكل 1A). في وجود مجال ن الطرفية نوسا (نوسا الأمراض الاستوائية المهملة، بقايا الأحماض الأمينية 1-137)، تأخر ظهور منتجات RNA بشكل ملحوظ مقارنة التجربة السيطرة تفتقر نوسا. (بقايا K36، K37، R104، Q108، K111، Q112، Q116، وR119) أدى حذف بقايا الأحماض الأمينية 104-137 (اللولب 3) من جزء نوسا، أو تغيير في ألانين من سلسلة من الأحماض الأمينية في كامل فقدان النشاط وقفة نوسا. عرضت الحلزون 3 بقايا R104 و K111 على أنها ضرورية للنشاط وقفة نوسا الأمراض الاستوائية المهملة ومع R104A ويبني K111A إعطاء قفة مماثلة القيم نصف الحياة إلى السيطرة حيث كان نوسا NTD غائب (الشكل 1B). انهاتجدر الإشارة hould معها أن حذف اللولب 3 أو تغيير هذه المخلفات من الأحماض الأمينية هما ليس له تأثير على نوسا ملزمة لRNAP 15. وأشارت ونتيجة لذلك R104 و K111 كانت الأحماض الأمينية الأساسية المطلوبة لتنظيم النشاط وقفة نوسا. وبالمثل، كما هو مبين في الشكل 2A، أظهر منحنى الاستجابة للجرعة تثبيط النسخ في المختبر (متعددة على مدار) باستخدام تركيزات مختلفة من التي تم تشخيصها حديثا النسخ مثبط للبكتيريا C5 14. وقد تم تحديد C5 بعد في شاشة سيليكون من مشروع لاستهداف بعقلانية تفاعل σ 70 مع موقع ملزم كبير على RNAP تسمى المنطقة المشبك اللولب 18. مع إضافة C5 في رد فعل النسخ، ويمكن هذا المركب منافسة σ 70 للربط إلى RNAP، وبالتالي تحول دون النسخ. ميكانيكيا، إضافة C5 إلى RNAP تليها σ &lt;سوب&gt; كان 70 عاملا إلى خليط التفاعل بشكل ملحوظ أكثر كفاءة لتثبيط النسخ من التجربة باستخدام C5 بعد تشكيل عميم الإنزيم RNAP (الشكل 2B). وأظهرت هذه النتائج أن σ 70 لا يمكن أن تحل محل C5 بد أن RNAP، أو أن C5 لا يمكن أن تحل محل σ 70 بد أن RNAP في مقايسة جولة واحدة بكفاءة. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54256/54256fig1.jpg" /> الشكل 1: آثار المسخ نوسا NTD في النسخ (A) المقايسات النسخ وقفة دون نوسا، وذلك باستخدام نوسا NTD (+ نوسا)، نوسا NTD مع الحلزون 3 حذف (Δ اللولب)، ونوسا NTD مع بدائل ألانين في بقايا K36، K37 ، R104، Q108، K111، Q112، Q116، وR119 (جميع علاء). P، الموقع وقفة. T، الموقع الإنهاء؛ ريال عماني، الاعادة. أسافين فوق هلام تظهر نقاط الوقت العينة (0.5، 1، 1.5، 2، 5 و 10 دقيقة) 15؛ (ب) النشاط وقفة من حياة نصف من متحولة نوسا الأمراض الاستوائية المهملة نسبة إلى البرية من نوع البروتين. متوسط ​​3 تجارب مع SD. تم تعديل هذا الرقم من الأحماض النووية بحوث 43 (5)، 2829-2840 (2015). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54256/54256fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54256/54256fig2.jpg" /> الشكل 2: النسخ عن طريق تثبيط C5 مجمع (A) منحنى تثبيط E. القولونية RNAP النسخ التي كتبها C5 مجمع في متعددة على مدار فحص 14. تم تحديد النسبة المئوية للتثبيط من النسخ من قبل المنتج RNA نسبة إلى عنصر تحكم (لا C5 الحاضر) ضد تركيز C5 المستخدمة في رد الفعل. (ب) نسبة النشاط المثبطة من C5 مجمع في الجولة ثلاالمقايسات anscription مع إضافة C5 قبل (مجمع + σ 70، الرمادي) وبعد (عميم الإنزيم + C5، أسود) عميم الإنزيم تشكيل. تم تعديل هذا الرقم من ACS تصيب. ديس 2، 39-46 (2016). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54256/54256fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery at JoVE.com

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

النسخ في المختبر فحوصات وتطبيقها في اكتشاف الأدوية

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

in-vitro-transcription-assays-and-their-application-in-drug-discovery

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

15.0K Views.  University of Newcastle. In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

Video: In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend diseases related to pregnancy. In this protocol, human primary villous cytotrophoblasts freshly isolated from placentas through a standard DNase/trypsin protocol are microporated with small interfering RNA (siRNA). This approach provided greater efficiency for siRNA transfection when compared to a lipofection-based method. Transfected cells can subsequently be analyzed by standard Western blot within a time frame of 3-4 days post-transfection. In addition, using cultured primary villous cytotrophoblasts, Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) analysis was optimized and performed on extracts from days 1 to 4. The use of these cultured primary cells and the protocol described allow for an evaluation of the implication of specific genes and transcription factors in the process of villous cytotrophoblast differentiation into a syncytiotrophoblast-like cell layer. However, the limited time span allowable in culture precludes the use of methods requiring more time, such as generation of a stable cell population. Therefore testing of this cell population requires highly optimized gene transfer protocols.

This protocol describes a method for efficiently transfecting siRNA in freshly isolated human villous cytotrophoblasts using microporation and identifying DNA-protein complexes in these cells. Transfected cells can be monitored by Western blot and EMSA analyses during the 4-day culture time.

سيرنا ترنسفكأيشن وEMSA تحاليل المعزولة حديثا أرومة غاذية خلوية زغبي الإنسان

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

علم البصريات الوراثي الطفرات عشوائية عن طريق هيستون-miniSOG في<em&gt; C. ايليجانس</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

تربية ومزدوجة الذين تقطعت بهم السبل بوساطة الحمض النووي الريبي الجينات ضربة قاضية في إخفاء بيتل،<em&gt; Dermestes المبقعة</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to sleep behavior. In vertebrates, circadian rhythm is controlled by a molecular oscillator that functions in both the suprachiasmatic nucleus (SCN; central pacemaker) and individual cells comprising most peripheral tissues. More importantly, disruption of circadian rhythm by exposure to light-at-night, environmental stressors and/or toxicants is associated with increased risk of chronic diseases and aging. The ability to identify agents that can disrupt central and/or peripheral biological clocks, and agents that can prevent or mitigate the effects of circadian disruption, has significant implications for prevention of chronic diseases. Although rodent models can be used to identify exposures and agents that induce or prevent/mitigate circadian disruption, these experiments require large numbers of animals. In vivo studies also require significant resources and infrastructure, and require researchers to work all night. Thus, there is an urgent need for a cell-type appropriate in vitro system to screen for environmental circadian disruptors and enhancers in cell types from different organs and disease states. We constructed a vector that drives transcription of the destabilized luciferase in eukaryotic cells under the control of the human PERIOD 2 gene promoter. This circadian reporter construct was stably transfected into human mammary epithelial cells, and circadian responsive reporter cells were selected to develop the in vitro bioluminescence assay. Here, we present a detailed protocol to establish and validate the assay. We further provide details for proof of concept experiments demonstrating the ability of our in vitro assay to recapitulate the in vivo effects of various chemicals on the cellular biological clock. The results indicate that the assay can be adapted to a variety of cell types to screen for both environmental disruptors and chemopreventive enhancers of circadian clocks.

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

An in vitro bioluminescence assay to determine cellular circadian rhythm in mammary epithelial cells is presented. This method utilizes mammalian cell reporter plasmids expressing destabilized luciferase under the control of the PERIOD 2 gene promoter. It can be adapted to other cell types to evaluate organ-specific effects on circadian rhythm.

في المختبر فحص الإضاءة الحيوية تميز إيقاع سيركاديان في الخلايا الظهارية الثديية

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in humans, but more tools and research efforts are needed to better elucidate the mechanisms involved. For over a century, the genetically highly tractable model of Drosophila has been instrumental in the discovery of key genes and molecular pathways that proved to be highly conserved across species. Many biological processes and disease mechanisms are functionally conserved in the fly, such as development (e.g., body plan, heart), cancer, and neurodegenerative disease. Recently, the study of obesity and secondary pathologies, such as heart disease in model organisms, has played a highly critical role in the identification of key regulators involved in metabolic syndrome in humans.
Here, we propose to use this model organism as an efficient tool to induce obesity, i.e., excessive fat accumulation, and develop an efficient protocol to monitor fat content in the form of TAGs accumulation. In addition to the highly conserved, but less complex genome, the fly also has a short lifespan for rapid experimentation, combined with cost-effectiveness. This paper provides a detailed protocol for High Fat Diet (HFD) feeding in Drosophila to induce obesity and a high throughput triacylglyceride (TAG) assay for measuring the associated increase in fat content, with the aim to be highly reproducible and efficient for large-scale genetic or chemical screening. These protocols offer new opportunities to efficiently investigate regulatory mechanisms involved in obesity, as well as provide a standardized platform for drug discovery research for rapid testing of the effect of drug candidates on the development or prevention of obesity, diabetes and related metabolic diseases.

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

This is a high fat diet feeding protocol to induce obesity in Drosophila, a model for understanding fundamental molecular mechanisms implicated in lipotoxicity. It also provides a high throughput triacylglyceride assay for measuring fat accumulation in Drosophila and potentially other (insect) models under various dietary, environmental, genetic or physiological conditions.

تغذية حمية الدهون عالية وإنتاجية عالية بالانزيم ترياسيلجليسيريدي في Melanogaster المورفولوجية

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

المراقبة على نطاق الجينوم من أخطاء النسخ في الكائنات الحية حقيقية النواة

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a larger genomic context. Subtractive genomics enables a researcher to isolate a target sequence of interest (T) by comprehensive sequencing and subtracting out known genetic elements (reference, R). The method can be used to identify novel sequences such as mitochondria, chloroplasts, viruses, or germline restricted chromosomes, and is particularly useful when T cannot be easily isolated from R. Beginning with the comprehensive genomic data (R + T), the method uses Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) against a reference sequence, or sequences, to remove the matching known sequences (R), leaving behind the target (T). For subtraction to work best, R should be a relatively complete draft that is missing T. Since sequences remaining after subtraction are tested through quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR), R does not need to be complete for the method to work. Here we link computational steps with experimental steps into a cycle that can be iterated as needed, sequentially removing multiple reference sequences and refining the search for T. The advantage of subtractive genomics is that a completely novel target sequence can be identified even in cases in which physical purification is difficult, impossible, or expensive. A drawback of the method is finding a suitable reference for subtraction and obtaining T-positive and negative samples for qPCR testing. We describe our implementation of the method in the identification of the first gene from the germline-restricted chromosome of zebra finch. In that case computational filtering involved three references (R), sequentially removed over three cycles: an incomplete genomic assembly, raw genomic data, and transcriptomic data.

The purpose of this protocol is to use a combination of computational and bench research to find novel sequences that cannot be easily separated from a co-purifying sequence, which may be only partially known.

اكتشاف رواية تسلسل الجينوم مطروح

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

يصف هستون تعديل بوستترانسلاشونال التعديلات في نماذج بروتينوباثي الأعصاب الخميرة

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant viruses they vector. Despite numerous studies of the biology of these species in different environments, a key life history parameter, offspring sex ratios, has received little attention, yet is important for predicting population dynamics. The primary sex ratio (sex ratio at oviposition) of Bemisia tabaci has never been reported but can be found by determining the egg fertilization rate of this haplodiploid insect. The technique involves the dechorionation of eggs with bleach, a series of fixation steps, and the application of the general DNA fluorescent stain, DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole, a DNA-binding fluorescent dye), to bind to female and male pronuclei. Here, we present the technique, and an example of its application, to test whether an endosymbiotic bacterium, Rickettsia sp. nr. bellii, influenced the primary sex ratio of B. tabaci. This method may assist in population studies of whiteflies, or in determining if sex allocation exists with certain environmental stimuli.

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

We present a simple cytogenetic technique using 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) to determine the fertilization rate and primary sex ratio of the haplodiploid invasive pest Bemisia tabaci.

تحديد "معدل إخصاب البيض" من حيث دراسة استخدام "تقنية الخلوية الوراثية"

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental methods to study protein-nucleic acid interactions require the use of fluorescent tags, radioactive isotopes, or other labels to detect and analyze specific target molecules. Biotin, a non-radioactive nucleic acid label, is commonly used in electrophoretic mobility shift assays (EMSA) but has not been regularly employed to monitor protein activity during nucleic acid processes. This protocol illustrates the utility of biotin labeling during in vitro enzymatic reactions, demonstrating that this label works well with a range of different biochemical assays. Specifically, in alignment with previous findings using radioisotope 32P-labeled substrates, it is confirmed via biotin-labeled EMSA that MEIOB (a protein specifically involved in the meiotic recombination) is a DNA-binding protein, that MOV10 (an RNA helicase) resolves biotin-labeled RNA duplex structures, and that MEIOB cleaves biotin-labeled single-stranded DNA. This study demonstrates that biotin is capable of substituting 32P in various nucleic acid-related biochemical assays in vitro.&#160;

Presented here are protocols for in vitro biochemical assays using biotin labels that may be widely&#160;applicable for studying protein-nucleic acid interactions.

في المختبر الاختبارات البيوكيميائية باستخدام تسميات البيوتين لدراسة تفاعلات البروتين والحمض النووي

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...