فإن الكتاب أود أن أشكر السيد Steczkowski لتسجيلات صوتية، M. Borczyk للرسومات، A. Trąbczyńska لإنتاج الفيروس، M. Ziókowska عن التنميط الجيني وA. Mirgos للحصول على المساعدة مع التصوير. KR يعترف هدية النوع من الفيروس المؤتلف الغدة المرتبطة (rAAV) التعبير عن بروتين فلوري mCherry تحت سيطرة المروج CaMK من K. Deisseroth. تم تنفيذ هذا المشروع في المرافق الأساسية من مختبر النماذج الحيوانية ومختبر بنية الأنسجة وظيفة، مركز علم الأعصاب، معهد نينكي علم الأحياء التجريبي، مع استخدام البنية التحتية CEPT بتمويل من الاتحاد الأوروبي - صندوق التنمية الإقليمية الأوروبي في البرنامج التشغيلي &quot;المبتكرة الاقتصاد&quot; للفترة 2007-2013. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المركز الوطني للعلوم: سوناتا مكرر 2012/05 / E / NZ4 / 02996، هارمونيا 2013/08 / M / NZ3 / 00861، Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00691 لKR وسوناتا مكرر 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 لRC

وقد وافق جميع الإجراءات التجريبية المبينة أدناه من قبل لجنة الأخلاقية المحلية في معهد نينكي البيولوجيا التجريبية، أكاديمية العلوم البولندية. ملاحظة: يتم تسارع بعض المشاهد في الفيديو المرتبطة. يشار عامل السرعة في هذه المشاهد. 1. جراحة التحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم جميع الأدوات والعبوات الزجاجية للسوائل ومسحات القطن في الأوتوكلاف. استخدام قفازات يمكن الاستغناء عنها. تنظيف طاولة الجراحة، والإطار التجسيمي وجميع المناطق المحيطة بها مع 70٪ من الإيثانول. استخدام وسادة الجراحية المعقمة لخلق مساحة معقمة لجميع المعدات المعقمة. قطع جلفوم إلى قطع صغيرة وينقع في محلول ملحي. ملاحظة: وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، الإيثانول يست المعقمات ولا مطهر رفيع المستوى. وينبغي أن تستخدم فقط كعامل تنظيف / defatting على الأسطح تعقيم سابقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوان في الالبريد غرفة تحريض وتعيين مستوى الأيزوفلورين إلى 5٪ وتدفق الأوكسجين إلى 2 لتر / دقيقة. هذا الإجراء ينبغي أن يستغرق حوالي 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خذ الحيوان من غرفة تحريض. استخدام الذيل أو أخمص القدمين القرصات من أجل التأكد من أن الحيوان مخدرا تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الانتهازي الدقيق يحلق الشعر من مؤخرة الرأس (بين الأذنين) ما يصل الى العينين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوان في إطار التجسيمي وتحقيق الاستقرار في الرأس بقضبان الأذن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد مستويات التخدير إلى 1.5-2٪ الأيزوفلورين و 0.3 لتر / دقيقة الأكسجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق مرهم العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن تحت الجلد الحيواني مع Tolfedine (4 ملغ / كلغ)، Butomidor (2 ملغ / كلغ) وBaytril (5 ملغ / كلغ) لمنع التهاب والألم والعدوى، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن في العضل الحيوان مع ديكساميثازون (0.2 ملغ / كلغ) لمنع تورم الدماغ. ملاحظة: من الممكن لحقن ديكساميثازون تحت الجلد أو داخل الغشاء البريتونى لمنع تلف العضلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف الجلد باستخدام الصورةمسحات القطن terile مع Betadine تليها 70٪ من الإيثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير القفازات وترشها مع 70٪ من الإيثانول. ملاحظة: أثناء استخدام القفازات القابل للتصرف لا تلمس المجال المعقم. لمس الحيوان فقط مع نصائح من الأدوات الجراحية المعقمة ومسحات معقمة. </li></ol> جراحة 2. الجمجمة النافذة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع الجلد مع ملقط واستخدام المقص الصغير شق الجلد أفقيا على طول قاعدة من الرأس ومن ثم بشكل غير مباشر إلى النقطة الأمامية بين العينين. إزالة رفرف الجلد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق يدوكائين مرهم مع مسحة معقمة على السمحاق لمنع النزيف والألم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام قطعة قطن معقمة أو مشرط لإزالة السمحاق. تجفيف الجمجمة مع مسحات معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام إبرة معقمة تطبيق كثيفة الغراء cyanoacrylate على حواف الجلد لشل حركة لهم، ومنع من الاتصال مع الاسمنت الأسنان. انتظر الغراء لتجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العقيمة ساترة 3 مم أنحاء رانه الجمجمة الأمامية إلى الدرز اللامي. توسيط ساترة في RSC تنسق: AP، bregma -2.8. ML، bregma 0. كافة حواف ساترة من خدش سطح الجمجمة بإبرة معقمة. وضع ساترة مرة أخرى في حاوية معقمة مع 70٪ من الإيثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام حفر الأسنان عالية السرعة مع لدغ قطرها صغير لوضع الخطوط العريضة لدائرة قطرها 3 مم. تنظيف موقع الحفر من الغبار العظام مع ملحي معقم مسحات تراجع. استخدام جلفوم ومسحات لوقف النزيف في بعض الأحيان وتنظيف العظام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بين الحفر فحص سماكة العظام مع ملقط غرامة عن طريق لمس بلطف دائرة العظام وفحص التنقل به. نضع في اعتبارنا أن العظام هي أكثر سمكا في منطقة خياطة و. وقف الحفر عند دائرة العظام هي النقالة وتركت فقط حتى، طبقة رقيقة من العظم على محيط. تنظيف الميدان العملي من كل الغبار العظام المتبقية مع المياه المالحة انخفض مسحات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إسقاط ملحي معقم على منطقة الحفر، والتي تغطي سي آي آر حفرشركة كلي. بعناية نقب دائرة العظام مع ملقط غرامة ثم بلطف ولكن بحزم إزالة العظام من خلال رفع لأعلى. يجب الحرص على عدم تحريف دائرة العظام في حين رفع لمنع الضرر المحتمل لالجافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف تطبيق جلفوم غارقة في المياه المالحة عقيمة على الجافية للمساعدة في وقف النزيف. انتظر حتى يتم إيقاف جميع النزيف تماما. إزالة بعناية جلفوم لا تعكر صفو عملية التخثر. ملاحظة: المنطقة خياطة هي أوعية دموية للغاية، وبالتالي فإن النزيف في هذه المرحلة قد يثبت أن تكون عميقة. لا بد من الانتظار لوقت كاف للنزيف لوقف تماما. ومن المفيد للحفاظ على جلفوم غارقة في المياه المالحة المبردة عن طريق وضعه على الجليد. </li></ol> 3. الفيروسات حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق مضخة التسريب إلى برج المجسم وربط وحدة تحكم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ادخال الإبرة 35G في حقنة. تدفق الحقنة 10 مرات مع الإيثانول لتعقيمها و 10 مرات مع ملحي معقم لإزالة آثار هthanol. إزالة فقاعات الهواء من الحقنة. إدراج الحقنة في مضخة. ملاحظة: النظر في استخدام المطهرات الأخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد جرعة واحدة من rAAV2 / 1 إعداد mCherry (ينصح 10 12 PFU) والحفاظ على الجليد. ملء المحاقن مع الحل فيروس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توسيط إبرة على bregma ثم تضاف برفق في قرن آمون باستخدام الإحداثيات التالية: AP -2، ML +/- 1.0، DV -1. وسيكون مقر هذه الإحداثيات بالقرب من حافة حج القحف. الانتظار لمدة 5 دقائق للأنسجة لتحقيق الاستقرار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضخ 0.7 ميكرولتر من الحل mCherry rAAV2 / 1 بمعدل 50 نيكولا لانغ / دقيقة. انتظر 10 دقيقة للفيروس إلى كثف تماما. إزالة بلطف الإبرة. وصمة عار مع جلفوم في حالة حدوث نزيف. كرر مع الموقع المقابل. </li></ol> 4. الجمجمة النافذة زرع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العقيمة، ساترة المجففة على رأس الجافية في إطار دائرة حفر. عقد ساترة مع forcالعائد على السهم إلى تتسطح بلطف الجافية وجلب ساترة &#39;حواف أقرب إلى سطح الجمجمة. ملاحظة: من الممكن أن ساترة يعطل جلطة ونزيف السير الذاتية. إذا كان هذا هو الحال، ورفع ساترة، وضعه في الكحول وجافة والعودة إلى الخطوة 2.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام إبرة معقمة تطبيق الغراء cyanoacrylate كثيفة على حواف ساترة لضمها إلى الجمجمة. انتظر الغراء لتجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع شريط التثبيت (الجوز M2 أو تصميم حسب الطلب) في الجزء الأمامي من الجمجمة. تطبيق الغراء cyanoacrylate على حواف العارضة. انتظر الغراء لتجف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع شريط التثبيت في المنصب الذي سيمكن وضع أفقي من نافذة في الجمجمة أثناء التصوير الدورة. وضعه بعيدة قدر الإمكان من النافذة. إذا ما وضعت قريبة جدا من النافذة، ونقابة المحامين، والمسمار الذي يربط مع صاحب العرف قد تشكل عائقا لتحقيق الهدف أثناء عملية التصوير. </li></ol></li><lط&gt; إعداد الاكريليك الأسنان وتطبيقه على سطح الجمجمة حول الزجاج. ومن المفيد لتشكيل شكل يشبه فوهة البركان حول النافذة. فإنه سيتم إنشاء تجويف للمياه تطبيقها في وقت لاحق للتصوير مع الهدف المياه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء سقف مع الاكريليك الأسنان التي تغطي باقي المساحة التشغيلية، وحواف الجلد، شريط التثبيت، وتعزيز الحفرة حول نافذة في الجمجمة. انتظر الاسمنت الأسنان لتتصلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحيوان من الإطار التجسيمي ووضعها في غرفة الإنعاش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتظار للحيوان للتعافي من الجراحة مع مراعاة الوظائف الفسيولوجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق تسكين بعد العملية (كاربروفين، 10 ملغ / كلغ) والعلاج المضادات الحيوية (baytril، 5 ملغ / كلغ) لمدة 48 ساعة. </li></ol> 5. التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تي: ليزر الياقوت، قوة تصل المجهر. وقد تم تجهيز النظام المستخدم في هذه التجربة مع ليزر ثنائي الفوتون، نظام OPO والمزدوج PMT GaAsP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوان في inducغرفة نشوئها وإحداث التخدير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحيوان من غرفة تحريض ومكان في قناع التخدير الغاز تحت المجهر. انخفاض تدفق الأكسجين إلى 0.3 لتر / دقيقة وتركيز الأيزوفلورين إلى 1.5-2٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الحيوان إلى الإطار المجهر مخصصة مع المسمار M2 (أو نظام مخصص آخر). مستوى النافذة في الجمجمة. ملاحظة: من الممكن استخدام نظام رئيس تثبيت الصانع المجهر، على الرغم من أن إطار مخصص محدد يعطي نتائج أفضل (تحسين الاستقرار الرأس، وتحديد المواقع المستمر في جلسات متعددة خلال تجربة المزمنة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام إعدادات المجهر widefield وانخفاض مركز موضوعي التكبير وجهة النظر على أحد جانبي القشرة خلف الطحال والتركيز على سطح ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق قطرة من الماء في البئر الاكريليك تشبه فوهة البركان. التحول إلى هدف غمر المياه لمسافات طويلة. نقل الهدف نحو النافذة الجمجمة حتى يخدع الغضروف المفصلي المياهnects العينة والهدف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل إلى إعدادات ثنائي الفوتون والبدء في مسح رأس العينة إلى أسفل باستخدام أدنى التكبير. سوف عبور جافية تكون واضحة كما مرأى ومسمع من ارتفاع في إشارة غير محددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط إعدادات اكتساب المجهر في كل قنوات (GFP وmCherry) وفقا لقوة الإشارة من الخلايا فلوري من أجل تغطية النطاق الديناميكي بأكمله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد العثور على الخلايا العصبية مناسبة (مع الشجرة شجيري فصلها عن الخلايا الأخرى) إجراء المسح الأولي فقط باستخدام filterset GFP مع أدنى التكبير وض مسافة 5 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على إسقاط الحد الأقصى لكومة الممسوحة ضوئيا وطباعته الشروح (باستخدام الألوان المقلوب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط التكبير إلى قيمة من شأنها أن تسمح لصورة تفاصيل الشكلية المطلوبة. صورة الشجرة شجيري كامل في قنوات GFP وmCherry باستخدام الحد الأقصى إسقاط كدليل. </li></ol>

<ol>
	<li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neocortical+neurons+through+a+chronic+cranial+window.">Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).</li><li>Chow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+and+compartmental+regulation+of+dendritic+growth+in+mature+cortex.">Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex.</a> Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).</li><li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+and+storage+of+spatial+information+in+the+retrosplenial+cortex.">Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).</li><li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superficially+projecting+principal+neurons+in+layer+V+of+medial+entorhinal+cortex+in+the+rat+receive+excitatory+retrosplenial+input.">Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input.</a> J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Couey, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+inhibitory+circuitry+as+a+mechanism+for+grid+formation.">Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation.</a> Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).</li><li>Miyashita, T., Rockland, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+projections+from+the+hippocampus+to+the+retrosplenial+cortex+in+the+rat.">GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat.</a> European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).</li></ol>

الكتاب (KL، MR، KR) لديها حقوق لبراءات الاختراع في انتظار (PL410001) لإطار حامل المستخدمة في هذه المادة.

في هذه الورقة نقدم بروتوكول لفي وقت واحد ثنائي الفوتون في التصوير المجراة من مدخلات متشابك والأهداف بعد المشبكي في RSC من خلال نافذة في الجمجمة. تتكون إجراء زرع عدة خطوات رئيسية. أولا، هذا الحيوان هو تخدير عميق وثابت في إطار المجسم، ومن ثم ضعفت الجمجمة على RSC مع حفر على طول خطوط دائرية ملحوظ وإزالة العظام دائري. بعد توقف النزيف، يتم حقن rAAV2 / 1 mCherry في الحصين، ويتم إصلاح الغطاء الزجاجي في الجمجمة على منطقة حفر. وأخيرا يتم تأمين شريط التثبيت على الرأس ويوضع الحيوان في غرفة الإنعاش لمدة 48 ساعة. بعد حوالي 2-3 أسابيع في حاجة للتعبير عن الفيروس، وRSC يمكن تصور. ويضم البروتوكول التصوير من الخطوات التالية. أولا، يتم تخدير الحيوان وثابتة تحت المجهر. التركيز ثم يتم تعيين باستخدام المجهر widefield، فإن هذا النظام مفاتtched في وضع ثنائي الفوتون وتصور قنوات الفائدة (GFP وmCherry). تقدم تقنية عرض تحسنا كبيرا خلال البروتوكولات المذكورة سابقا. في نهج موحد، يمكن أن يتم الكشف عن نوع واحد فقط من التسمية. ويمكن استخدامه لصورة محلية التوقعات محور عصبي وأشجار شجيري، ولكن لا توجد دراسات الاتصال بعيدة المدى الممكن. من خلال الجمع بين اثنين من البروتينات الفلورية نحن تمكين تتبع في وقت واحد من العناصر قبل وبعد المشبكي. وهذا يسمح المدى الطويل في رصد المجراة من الاتصالات المشبكية المفترضة. من أجل الحصول على أفضل النتائج في إجراءات وصفها، من المهم أن تولي اهتماما لعدة خطوات حاسمة. خلال رفع دائرة العظام في الخطوة 2.8 أي ضرر للالجافية قد يسبب التهاب ويضعف الشفافية في نافذة الجمجمة. المحتسب بدل الضائع كافية من نزيف في الخطوة 2.9 أو في أي خطوة أخرى من الإجراء يؤدي إلى تتراكم في الدمايون تحت النافذة، ويخفف كثيرا من مجال الرؤية. بعد حقن الفيروس فمن الأهمية بمكان أن ننتظر لمدة 10 دقيقة على الأقل قبل إزالة الإبرة، وذلك للكشف عن الفيروس للبث في الأنسجة في موقع الحقن فقط. أنه يحد من إمكانية الإصابة غير المرغوب فيها من القشرة مع الفيروس خلال إزالة إبرة. يجب فحص منطقة ترنسفكأيشن الفيروسية مع التحليل اللاحق النسيجي لأنسجة المخ. وينبغي تجنب أي تعبير mCherry في الخلايا على أثر إبرة. الوقت الانتعاش هو معيار 3 أسابيع. هذه الفترة كافية للكشف عن الفيروس لتصل إلى التعبير استقرارا في توقعات متشابك وللنافذة الجمجمة للشفاء تماما وتستقر. الحيوانات يجب أن يضم واحدة من أجل منع إزالة زرع نافذة في الجمجمة من قبل زملائه في قفص. ويمكن النظر في استخدام قفص الموسع وذلك لتجنب الضرر العرضي من نافذة في الجمجمة عن طريق ضرب بقضبان معدنية. تثبيت مستقر من مذكرة التفاهمحد ذاتها تحت المجهر أمر ضروري. أي حركة الرأس، بما في ذلك حركات التنفس، قد يسبب انخفاضا كبيرا في نوعية الصور التي تم الحصول عليها. ومن المفيد أيضا لوضع نافذة في الجمجمة أفقيا إلى الهدف، للحد من المشاكل المحتملة مع اكتساب التركيز على قدم المساواة للطائرة بأكملها من النافذة. وينبغي أن تطبق معايير واضحة لتسوية العمود الفقري وحبات. عموما، يتم تعريف حبات كما تورمات محور عصبي التي يبلغ قطرها لا يقل عن 3 مرات أكبر من الألياف السابقة 7. يتم تعريف العمود الفقري مثل نتوءات مميزة بوضوح من رمح التغصنات التي تحتوي على رأس منتفخ. مزيد من الانقسام إلى سكان رقيقة، قصير، الفطر والعمود الفقري تشعبت ممكن 3. نظرا لدقة محوري فقيرة نسبيا من اثنين من الفوتون المجهري، وينبغي تجنب تحليل العمود الفقري أن المشروع على طول المحور البصري 3. من أجل التمييز بوضوح حبات والعمود الفقري وظيفية، وظيفة خاصة immunolabelingلا يمكن أن يؤديها من أجل تحديد علامات قبل وبعد المشبكي 7. على الرغم من أن بروتوكول المعروضة أثبت أنه الأكثر ملاءمة في تصاميم تجريبية لدينا، فإنه من الممكن تعديله لكي تناسب أهداف تجريبية مختلفة. أحيانا هو أكثر ملاءمة لاستخدام التخدير عن طريق الحقن (مثل الكيتامين-xylasine) بدلا من الأيزوفلورين، ولكن من المهم أن ضبط كاف الجرعة، مع الأخذ في الاعتبار الاختلافات في قابلية المخدرات بين الفئران من مختلف السلالات والأعمار والجنس. ومن الممكن استخدام ينقب بر بدلا من واحدة كروية لحفر، ولكن يمكن أن تزيد من خطر الأضرار التي لحقت الجافية. يمكن استبدال ملحي معقم بنجاح مع السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF)، ولكن من المهم أن يبقيه عقيمة في جميع الأوقات خلال إعداد وتشغيل. ACSF غير مستقر لمدة 3-4 أسابيع بعد التحضير، وإذا حدث أي تلوث قبل هذا الوقت يجب أن يكون التخلص منها فورا. fixati رئيس مختلفةعلى الأجهزة يمكن تطبيقها، اعتمادا على التصميم التجريبي، بما في ذلك إمكانية مراقبة الماوس مستيقظا تحت المجهر ثنائي الفوتون. مثل أي تقنية أخرى، هذا واحد أيضا حدوده. المجهر ثنائي الفوتون يسمح لرؤية الدماغ الأنسجة تصل إلى 500 ميكرون عميقة من سطح الجافية. لفحص هياكل الدماغ أكثر عمقا يجب تطبيق تعديلات إضافية. يسمح بروتوكول لدينا إمكانية الوصول إلى أكثر من RSC، ولكن جزءا من الهيكل مخبأة تحت الجيب السهمي العلوي لا يزال لا يمكن الوصول إليها. حل المجهر ثنائي الفوتون لا يكفي لتحديد المشبك محدد وكذلك التحليل الصرفي مفصل من العمود الفقري شجيري. تقنيات إضافية، مثل المجهر الإلكتروني مترابط يجب أن تطبق من أجل تأكيد وجود هيكل المشتبه بهم. ومن المهم أيضا أن نذكر أن هذا هو تقنية جراحية صعبة نسبيا وليس ريكوmmended للعامل غير مجرب. ويمكن تطبيق هذه التقنية المعروضة في مجموعة واسعة من التجارب. فإنه يجوز تعديلها للتحقيق في مناطق الدماغ المختلفة الوصول إليها مع المجهر ثنائي الفوتون. فإنه يمكن رصد في وقت واحد من محور عصبي والتعديلات شجيري خلال مجموعة متنوعة من الدول الفسيولوجية والمرضية بما في ذلك العمليات المعرفية والشيخوخة أو التقدم للعصبية والحالات النفسية. وهو يتيح للاستخدام المروجين خلية محددة لتصور التوقعات الناشئة في مجموعات فرعية العصبية محددة بدقة. ويمكن أيضا أن تعديلها لتتناسب مع البروتوكولات من التجارب على الحيوانات المستيقظة والتصرف. وعلاوة على ذلك، والبروتينات الحساسة أو الكالسيوم pH- يمكن التعبير عنها في الدماغ من أجل رؤية ليس فقط مورفولوجيا الخلايا العصبية ولكن أيضا تغييرات في نشاط الخلايا وظيفة. تعديل آخر محتمل لهذا النهج هو استخدام النمط المصلي rAAV مختلفة للتعبير عن mCherry. وخيالية العلاقات العامة 01/02 المصليovides التعبير القوي في موقع الحقن مع بداية سريعة بما فيه الكفاية (2-3 أسابيع). ظلت مستويات mCherry مستقرة لمدة 12 أسابيع على الأقل بعد ظهور الأولي ولم يتم اكتشاف أي وضع العلامات إلى الوراء في تجاربنا. من أجل الحصول على وضع العلامات إلى الوراء، والمصلي مختلفة يمكن استخدامها، مثل rAAV9. لا يمكن أن يؤديها في جلسات التصوير في أي تردد، ومع ذلك ينصح أقل فترة 24 ساعة من أجل السماح باستعادة السليم من الحيوان بعد التخدير. إذا ما طبقت بشكل صحيح، وهذا الأسلوب يسمح أداء جلسات التصوير متعددة من نفس المنطقة على مدى عدة أشهر. لإجراء التجارب على المدى الطويل (أطول من 6 أشهر)، وهو نظام لجنة المساواة العرقية / LoxP يمكن استخدامها مع recombinase تسليمها مع ناقلات AAV في خط GFP الماوس floxed.

ثورة ثنائي الفوتون المجهري مراقبة نشاط الدماغ في العيش والتصرف الحيوانات. منذ إطلاقها في عام 1990 وسرعان ما اكتسب شعبية ويتم تنفيذه الآن واحدة من الطرق الأكثر إثارة للاهتمام ومبتكرة من أجل النظر في جوانب عديدة من نشاط الدماغ في الجسم الحي 1،2. وتشمل هذه التطبيقات قياس تدفق الدم، وتنشيط الخلايا العصبية (على سبيل المثال، وذلك باستخدام مؤشرات مستوى الكالسيوم أو الجينات في وقت مبكر فورية التعبير) ومورفولوجيا الخلايا العصبية. عدد متزايد من المختبرات استخدام المجهر ثنائي الفوتون، وتنفيذ تقنية في جميع أنحاء العالم العلمي كمعيار جديد للتصوير في الجسم الحي الدماغ. ينطوي على نهج موحد زرع نافذة في الجمجمة (حفرة مستديرة في الجمجمة مغطاة غطاء زجاجي) على برميل أو القشرة البصرية في الدماغ الماوس 3. المقبل، اعتمادا على بروتوكول التجريبية، ومذكرة التفاهمحد ذاته يخضع لسلسلة من التصور والدورات التدريبية السلوكية، مما يسمح لرصد التغيرات في نشاط الدماغ ومورفولوجيا الخلايا العصبية على مر الزمن 4،5. في كلتا الحالتين يؤثر على حج القحف فقط العظم الجداري، دون عبور الغرز. ويعتقد إلى حد كبير أن العيب الرئيسي لهذه التقنية هو التطبيق المحدود لاللحاء يمكن الوصول إليها بسهولة مثل برميل أو القشرة البصرية. زرع نافذة في الجمجمة على مناطق أخرى يطرح الكثير من الصعوبات، بسبب النزيف و / أو إعاقة المكاني. في هذه الورقة نقترح زرع نافذة في الجمجمة فوق قشرة خلف الطحال (RSC)، ومنطقة أخرى ممكنة من الفائدة لمدة الفوتون في الجسم الحي المجهري 6. RSC هو عنصر هام من الدائرة الدماغ المسؤولة عن تكوين الذاكرة المكانية. تشريحيا، RSC هو جزء من شبكة الخلايا العصبية التي تربط القشرية، الحصين، والمناطق مهادي 7. أنهشارك بقوة في مجموعة من السلوكيات، مثل التعلم المكاني والانقراض وكذلك الملاحة الفضائية 6. من أجل تصور التغيرات المورفولوجية من الخلايا العصبية التي نستخدمها خط الماوس المعدلة وراثيا التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) تحت المروج thy1. في هذه الفئران، ويتم التعبير عن GFP في ما يقرب من 10٪ من الخلايا العصبية في الدماغ مما يسمح لتصور واضح للمحاور القشرية والتشعبات باستخدام اثنين من الفوتون المجهري 8. آخر الابتكارات التي نقترحها هي حقن المؤتلف الغدة المرتبطة المصلي فيروس 2/1 (rAAV2 / 1) الترميز بروتين أحمر فلوري (mCherry) تحت الخلايا العصبية المحددة كمكي المروج 9 في هياكل العميقة من الدماغ إسقاط لRSC ، مثل الحصين. التعبير عن rAAV2 / 1 mCherry في حصين الماوس Thy1-GFP يسمح لتصور في وقت واحد من العناصر قبل وبعد المشبكي من hippocampo-corticaل نقاط الاشتباك العصبي 10. التعبير مدفوعة rAAV من mCherry يتطلب 2-3 أسابيع للبروتين لتصل إلى مستوى كاف في محطات محور عصبي. هذه الفترة هي متسقة مع الوقت المعتاد المطلوبة للانتعاش من حج القحف.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Drug</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>AErrane 8DG9623</td>
			<td>5-2% pre-operative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>AErrane 8DG9623</td>
			<td>1.5-2% during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexametasone</td>
			<td>Scan Vet</td>
			<td>Dexasone 2mg/ml</td>
			<td>0.2 mg/kg intramuscular</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>2.50%</td>
			<td>5 mg/kg subcutaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tolfedine</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>4%</td>
			<td>4 mg/kg subcutaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butomidor</td>
			<td>Richter Pharma</td>
			<td>10 mg/ml</td>
			<td>2 mg/kg subcutaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>KRKA-Polska</td>
			<td>Rycarfa 50mg/ml</td>
			<td>10 mg/kg subcutaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>Jelfa</td>
			<td>Lignocainum</td>
			<td>topically</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>Jelfa</td>
			<td>20 mg/g</td>
			<td>topically</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Spongostan dental; REF MS0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Dedra</td>
			<td>Lubrithal</td>
			<td>topically</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CA glue</td>
			<td>Pelikan Daniel</td>
			<td>20G Huste</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental acrylic</td>
			<td>SpofaDental</td>
			<td>Duracryl Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>HSE-64-0720</td>
			<td>3 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Sigmed</td>
			<td>Keystone KVet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation bar</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>M2 or M3 screw nuts could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Renex</td>
			<td>PN-7B-SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>BM.183.180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>KOZO</td>
			<td>XTL6445T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder frame</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Upright Axio Examiner Z1</td>
			<td>Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus</td>
			<td>gift from K. Deisseroth</td>
			<td></td>
			<td>Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

<html> التعبير عن GFP في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية في مراسل الماوس Thy1-GFP يسمح في التصوير المجراة من التشعبات القشرية والتوقعات محور عصبي المحلية في RSC. ويبين الشكل 1A أقصى الإسقاط من كومة من الصور مع العديد من التشعبات GFP إيجابية واضحة. تحجب خلايا الجسم عن طريق الشريان. ويبين الشكل 1B صورة أسرع طائرة واحدة (تقريب رقمي 3X) من فرع شجيري مبين في 1A. تفاصيل التشكل شجيري (العمود الفقري، أرجل كاذبة خيطية) هي واضحة للعيان. ويكتسب قناة GFP باستخدام تصفية الانبعاثات تمرير الفرقة 500-550 نانومتر. حقنة من rAAV2 / 1 mCherry في الحصين الظهرية يسمح التصور من محاور الحصين وحبات متشابك تنتهي في RSC. ويمكن الكشف عن هذه المحطات في قناة mCherry (انبعاث الفرقة تمرير تصفية 570-610 نانومتر). SS = &quot;jove_content&quot; FO: المحافظة على together.within الصفحات = &quot;1&quot;&gt; <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53528/53528fig1.jpg" /> Figure1. القناة الثانية في الجسم الحي اثنين الفوتون التصوير من الخلايا العصبية RSC والتوقعات الحصين إلى RSC (أ) لمحة عامة عن الخلايا معربا عن GFP في جزء من RSC (صورة هو مبين في الألوان المقلوب). إسقاط الحد الأقصى هو مبين من كومة سميكة 100 ميكرون التي اتخذت في تضخم منخفضة (0.7X التكبير الرقمي). (ب) طائرة البصرية واحدة من جزء مبين في الفقرة (أ) المكتسبة في تضخم عالية (زوم رقمي 3X) في قناة GFP. (C) واحد جزء طائرة البصرية المشار إليها في (أ) باستخدام الإعدادات اكتساب mCherry. انظر بروتوكول للحصول على تفاصيل من المرشحات الكشف. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53528/53528fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex at JoVE.com

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

في وقت واحد ثنائي الفوتون<em&gt; في فيفو</em&gt; تصوير متشابك المدخلات والأهداف بعد المشبكي في اللحاء ماوس خلف الطحال

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

simultaneous-two-photon-vivo-imaging-synaptic-inputs-postsynaptic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

11.4K Views.  Nencki Institute of Experimental Biology. This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Video: Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

في التصوير المجراة من الحبل الشوكي عن طريق الماوس ثنائي الفوتون المجهري

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

كشف عن نقص الأكسجة Microregional في اللحاء المخي الفأر بواسطة التصوير ثنائي الفوتون من الإسفار NADH الذاتية

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

في الجسم الحي ثنائي الفوتون التصوير من الخبرة التي تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية القشرية

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

في فيفو الميكروسكوب ثنائي الفوتون من النهايات العصبية في الجلد واحدة

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

التصوير حية من الانقسام في تطوير الجنينية الماوس اللحاء

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

ثنائي الفوتون<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من العمود الفقري شجيري في اللحاء باستخدام الماوس الجمجمة ضعفت إعداد

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

التصوير ثنائي الفوتون الخلوية ديناميكية في الحبل الشوكي ماوس

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

متزامنة<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; اختبار وظيفي اثنين من شبكية العين من قبل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; نظام مخطط كهربية

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

تصوير الكالسيوم اثنين-فوتون في Dendrites العصبية في الدماغ شرائح

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

في فيفو اثنين-فوتون تصوير الخلايا العصبية القشرية في الفئران حديثي الولادة

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...