Os autores gostariam de agradecer a M. Steczkowski para gravações de voz, M. Borczyk para desenhos, A. Trąbczyńska para a produção de vírus, M. Ziókowska para genotipagem e A. Mirgos de assistência com as filmagens. KR reconhece o presente tipo do vírus adeno-associado recombinante (rAAV) que expressam a proteína fluorescente mCherry sob o controlo do promotor de CaMK K. Deisseroth. Este projeto foi realizado nas instalações centrais do Laboratório de modelos animais e Laboratório de Estrutura do tecido e função, Centro de Neurobiologia, Nencki Instituto de Biologia Experimental, com a utilização da infra-estrutura da CEPT, financiado pela União Europeia - Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional no âmbito do Programa Operacional &quot;Economia inovadora&quot; para o período 2007-2013. Este trabalho foi apoiado por subsídios da National Science Centre: Sonata Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02.996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00691 para KR e Sonata Bis 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 a RC

Todos os procedimentos experimentais descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê de Ética local no Instituto Nencki of Experimental Biology, da Academia Polonesa de Ciências. Nota: Algumas das cenas do vídeo associado são acelerados. fator de velocidade é indicado nestas cenas. 1. Cirurgia Preparação <ol><li> Esterilizar todas as ferramentas, recipientes de vidro para líquidos e cotonetes na autoclave. Use luvas dispensáveis. Limpar a mesa cirúrgica, o quadro estereotáxico e toda a área circundante com 70% de etanol. Usar uma almofada cirúrgica estéril para criar um espaço estéril para todo o equipamento esterilizado. Corte gelfoam em pedaços pequenos e mergulhe-os em solução salina estéril. Nota: De acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, o etanol não é nem um esterilizante nem um desinfectante de alto nível. Ele só deve ser usado como um agente de limpeza / desengorduramento em superfícies previamente esterilizados. </li><li> Coloque o animal em thcâmara de indução e e definir o nível de isoflurano a 5% e fluxo de oxigênio a 2 L / min. Este procedimento deve demorar cerca de 3 min. </li><li> Levar o animal para fora da câmara de indução. Use cauda ou dedo do pé pitadas, a fim de assegurar que o animal é completamente sedado. </li><li> Usando um aparador preciso raspar o cabelo a partir da parte de trás da cabeça (entre as orelhas) até os olhos. </li><li> Colocar o animal na moldura estereotáxica e estabilizar a cabeça com barras de ouvido. </li><li> Definir níveis de anestesia para 1,5-2% isoflurano e 0,3 L / min de oxigênio. </li><li> Aplicar a pomada. </li><li> Injectar o animal com Tolfedine subcutaneamente (4 mg / kg), Butomidor (2 mg / kg) e Baytril (5 mg / kg) para prevenir a inflamação, dor e infecção, respectivamente. </li><li> Injectar a intramuscularmente animal com Dexametasona (0,2 mg / kg) para evitar inchaço cérebro. Nota: É possível injectar dexametasona por via subcutânea ou por via intraperitoneal, para evitar danos do músculo. </li><li> Limpe a pele com scotonetes terile com Betadine seguido por 70% de etanol. </li><li> Alterar as luvas e pulverizá-los com 70% de etanol. Nota: Enquanto estiver usando luvas descartáveis ​​não toque no campo estéril. Toque o animal apenas com as pontas dos instrumentos cirúrgicos estéreis e compressas estéreis. </li></ol> Cirurgia 2. Cranial Janela <ol><li> Levantar a pele com fórceps e tesouras utilizando micro incisar a pele horizontalmente ao longo da base da cabeça e, em seguida, obliquamente para a frente ponto entre os olhos. Remova o retalho de pele. </li><li> Aplicar lidocaína pomada com uma zaragatoa estéril no periósteo para evitar sangramento excessivo e dor. </li><li> Use cotonetes estéreis ou um bisturi para remover o periósteo. Seque o crânio com compressas estéreis. </li><li> Usando uma agulha estéril aplicar cola de cianoacrilato densa sobre as bordas da pele para os imobilizar e para evitar o contacto com cimento dental. Aguarde até que a cola secar. </li><li> Coloque uma lamela 3 milímetros estéril sobre tele crânio anteriormente à sutura lambdoid. Centralizar a lamela na RSC coordenadas: AP, bregma -2.8; ML, bregma 0. Mark as bordas lamela arranhando a superfície do crânio com uma agulha estéril. Coloque a lamela de volta para o recipiente esterilizado com 70% de etanol. </li><li> Use uma broca dental de alta velocidade com pequenas rebarbas diâmetro para delinear um círculo 3 mm de diâmetro. Limpe o local de perfuração a partir do pó de osso com solução salina estéril cotonetes mergulhados. Use o gelfoam e cotonetes para parar o sangramento ocasional e limpar o osso. </li><li> No meio de perfuração verificar a espessura do osso com uma pinça fina, tocando suavemente o círculo óssea e verificar sua mobilidade. Tenha em atenção que o osso é mais espesso na área da sutura. Pare a perfuração quando o círculo osso é móvel e só um mesmo, fina camada de osso é deixado sobre a circunferência. Limpar o campo operacional de todos os pó de osso restante com compressas de soro fisiológico mergulhado. </li><li> Largue a solução salina estéril na área de perfuração, cobrindo o cir perfuradocle. Cuidadosamente retire o círculo osso com uma pinça fina e, em seguida, delicadamente mas com firmeza remover o osso, levantando-o para cima. Tenha cuidado para não distorcer o círculo de osso ao levantar-lo para evitar possíveis danos ao dura. </li><li> Gentilmente aplicar o gelfoam embebido em soro fisiológico estéril sobre a dura para ajudar a parar o sangramento. Espere até que todos sangramento está totalmente parado. Retire cuidadosamente o gelfoam para não perturbar o processo de coagulação. Nota: A área de sutura é altamente vascularizado, de modo que o sangramento neste momento pode vir a ser profundo. É essencial para esperar o tempo suficiente para que o sangramento parar completamente. É útil para manter o Gelfoam embebido em solução salina arrefecido colocando-o sobre gelo. </li></ol> Injeção 3. Virus <ol><li> Fixe a bomba de infusão para a torre estereotáxica e ligar o controlador. </li><li> Inserir a agulha 35G para a seringa. Lave a seringa 10 vezes com etanol para esterilizar e 10 vezes com solução salina estéril para remover vestígios de eThanol. Retirar as bolhas de ar a partir da seringa. Inserir a seringa para dentro da bomba. Nota: Considere o uso de outros desinfectantes. </li><li> Descongelar uma dose única de rAAV2 / 1 Preparação mCherry (10 12 pfu é recomendado) e mantê-lo em gelo. Encher a seringa com a solução de vírus. </li><li> Centralizar a agulha na bregma e insira suavemente no hipocampo utilizando as seguintes coordenadas: AP -2, ML +/- 1.0, DV-1. Estas coordenadas será localizada perto da borda da craniotomia. Espera durante 5 min para o tecido para estabilizar. </li><li> Injectar 0,7 mL da solução rAAV2 / 1 mCherry à taxa de 50 nl / min. Esperar 10 minutos para que o vírus adsorver totalmente. Remova cuidadosamente a agulha. Seque com gelfoam se o sangramento ocorre. Repita com o site contralateral. </li></ol> 4. Cranial Janela Implantação <ol><li> Colocar a lamela esterilizada, secou-se sobre a parte superior da dura-máter no quadro do círculo perfurado. Segure a lamela com a forceps para achatar suavemente a dura e trazer lamela &#39;bordas mais perto da superfície do crânio. Nota: É possível que a lamela perturba o coágulo e os currículos sangramento. Se for esse o caso, levantar a lamela, coloque-o em álcool, seco e volte para o passo 2.9. </li><li> Usando uma agulha estéril aplicar a cola de cianoacrilato densa nas bordas lamela para anexá-los ao crânio. Aguarde até que a cola secar. </li><li> Coloque uma barra de fixação (porca M2 ou um projeto feito sob encomenda) na parte frontal do crânio. Aplicar a cola de cianoacrilato sobre as bordas da barra. Aguarde até que a cola secar. <ol><li> Coloque a barra de fixação numa posição que permita o posicionamento horizontal da janela craniana durante a imagem sessão. Coloque-o tão distante quanto possível a partir da janela. Se for colocado muito perto da janela, o bar e o parafuso conectando-o com o porta-feito sob medida pode representar um obstáculo para o objectivo, durante o processo de imagem. </li></ol></li><lI&gt; Prepara-se o acrílico dental e aplicá-lo sobre a superfície do crânio em torno do vidro. É útil para formar uma forma semelhante a cratera em torno da janela. Ele vai criar uma cavidade para água aplicada mais tarde para a imagem latente com o objetivo de água. </li><li> Criar um tampão com o acrílico dental, cobrindo o resto da área operacional, bordas da pele, barra de fixação, o que reforça a cratera em torno da janela craniana. Aguarde até que o cimento dental para endurecer. </li><li> Remover o animal a partir do quadro estereotáxico e colocá-lo na câmara de recuperação. </li><li> Aguarde até que o animal se recuperar da cirurgia, respeitando as funções fisiológicas. </li><li> Aplicar analgesia pós-operatória (carprofeno, 10 mg / kg) e tratamento antibióticos (Baytril, 5 mg / kg) durante 48 horas. </li></ol> 5. Imagiologia <ol><li> Comece o laser de Ti: safira, poder-se o microscópio. O sistema utilizado nesta experiência é equipado com um laser de dois fotões, sistema OPO e PMT GaAsP dupla. </li><li> Coloque o animal no Induccâmara ção e induzir a anestesia. </li><li> Remover o animal a partir da câmara de indução e em lugar da máscara de anestesia de gás sob o microscópio. Diminuir o fluxo de oxigênio para 0,3 L / min ea concentração de isoflurano a 1,5-2%. </li><li> Corrigir o animal ao corpo do microscópio personalizado com um parafuso M2 (ou outro sistema personalizado). Nivelar o janela craniana. Nota: É possível usar o sistema de fixação de cabeça do fabricante do microscópio, embora a custom frame específica dá melhores resultados (maior estabilidade cabeça, posicionamento constante em várias sessões durante uma experiência crônica). </li><li> Usando as configurações de microscópio e uma ampliação widefield centro objectiva de baixa o ponto de vista de um dos lados do córtex retroesplenial e concentrá-la sobre a superfície da lamela. </li><li> Aplicar uma gotícula de água para dentro do poço acrílico tipo cratera. Mudar para uma objectiva de imersão em água de longa distância. Mova o objectivo para a janela do crânio até o menisco de água conNECTS o espécime e objetiva. </li><li> Mudar para as definições de dois fótons e começar a digitalizar o topo da amostra para baixo usando menor zoom. O cruzamento de dura-máter será visível como um brilho elevado de sinal não específico. </li><li> Ajustar as configurações de aquisição de microscópio em ambos os canais (GFP e mCherry) de acordo com a intensidade do sinal a partir de células fluorescentes, a fim de cobrir toda a gama dinâmica. </li><li> Depois de encontrar um neurônio adequado (com a árvore dendrítica separada de outras células) realizar uma verificação inicial usando apenas o filterset GFP com menor zoom e z-distância de 5 microns. </li><li> Obter uma projeção máxima da pilha digitalizado e imprimi-lo para anotações (usando cores invertidas). </li><li> Ajuste de zoom para um valor que irá permitir à imagem os detalhes morfológicos desejados. Imagem toda a árvore dendrítica nos canais GFP e mCherry usando projeção máxima como guia. </li></ol>

<ol><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neocortical+neurons+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).</li>
<li>Chow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+and+compartmental+regulation+of+dendritic+growth+in+mature+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex.</a> Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).</li>
<li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+and+storage+of+spatial+information+in+the+retrosplenial+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).</li>
<li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superficially+projecting+principal+neurons+in+layer+V+of+medial+entorhinal+cortex+in+the+rat+receive+excitatory+retrosplenial+input%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input.</a> J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Couey, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+inhibitory+circuitry+as+a+mechanism+for+grid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation.</a> Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).</li>
<li>Miyashita, T., Rockland, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+projections+from+the+hippocampus+to+the+retrosplenial+cortex+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat.</a> European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).</li>
</ol>

Os autores (KL, MR, KR) têm direitos de patente pendentes (PL410001) para o chassis de suporte usado neste artigo.

No presente trabalho apresentamos um protocolo para a utilização simultânea de dois fótons de imagem in vivo das entradas sinápticas e metas pós-sinápticos em RSC através de uma janela craniana. O procedimento de implantação consistem em vários passos-chave. Em primeiro lugar, o animal é anestesiado profundamente e fixada na moldura estereotáxica, em seguida, o crânio sobre RSC é diluído com uma broca ao longo das linhas circulares marcados e o osso circular é removido. Após a hemorragia é pa...

microscopia de dois fótons revolucionou a observação de atividade cerebral em viver e se comportar animais. Desde a sua introdução, em 1990, rapidamente ganhou popularidade e agora é implementado como uma das abordagens mais interessantes e inovadores no sentido de exame dos vários aspectos da atividade do cérebro in vivo 1,2. Estas aplicações incluem medições de fluxo de sangue, ativação neuronal (por exemplo, usando indicadores de nível de cálcio ou genes precoces imediatos de expressão) e a morfologia das células neuronais. Um número crescente de laboratórios usam microscópios de dois fótons, implementando a técnica em todo o mundo científico como um novo padrão para in vivo de imagens do cérebro. A abordagem padrão envolve o implante da janela cranial (um buraco redondo no crânio coberto com uma tampa de vidro) sobre o tambor ou córtex visual do cérebro do rato 3. Em seguida, dependendo do protocolo experimental, o mouse sofre uma série de visualização e sessões de treinamento comportamental, permitindo monitorar as mudanças na atividade cerebral e morfologia neuronal ao longo do tempo 4,5. Em ambos os casos, a craniotomia só afecta o osso parietal, sem atravessar as suturas. Acredita-se largamente que a principal desvantagem da técnica é a sua aplicação limitada a córtices facilmente acessíveis, tais como o barril ou córtex visual. Implantação da janela craniana sobre outras regiões levanta uma série de dificuldades, devido a hemorragia excessiva e / ou impedimento espacial. Neste trabalho, propomos a implantação da janela do crânio acima do córtex retrosplï¿½ico (RSC) como outra possível região de interesse para dois fótons em microscopia vivo 6. RSC é um elemento importante do circuito do cérebro responsável pela formação da memória espacial. Anatomicamente, CER é uma parte de uma rede neuronal cortical de ligação, do hipocampo, do tálamo e as regiões 7. Isto éfortemente envolvido em uma série de comportamentos, tais como a aprendizagem e extinção espacial, bem como navegação espacial 6. Para visualizar as alterações morfológicas dos neurônios usamos uma linha de rato transgénico expressando a proteína fluorescente verde (GFP) sob o promotor Thy1. Nestes ratos, GFP é expressa em aproximadamente 10% dos neurônios no cérebro que permitem a visualização clara dos axônios e dendritos corticais por meio de microscopia de dois fótons 8. Uma outra inovação que propomos consiste na injecção de um adeno-associado recombinante de vírus de serotipo 2/1 (rAAV2 / 1) que codifica uma proteína fluorescente vermelha (mCherry) sob um promotor específico de neurónios CaMKII 9 nas estruturas mais profundas do cérebro que se projectam para RSC , tal como o hipocampo. A expressão de rAAV2 / 1 mCherry no hipocampo de rato Thy1-GFP permite a visualização simultânea de elementos pré- e pós-sinápticos do Hippocampo-Cortical sinapses 10. A expressão de rAAV-driven de mCherry requer duas a três semanas para a proteína para alcançar um nível suficiente nos terminais axonais. Este período é consistente com o tempo habitual necessário para a recuperação de craniotomia.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Drug&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>5-2% pre-operative</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>1.5-2% during surgery</td></tr><tr><td>Dexametasone</td><td>Scan Vet</td><td>Dexasone 2mg/ml</td><td>0.2 mg/kg intramuscular</td></tr><tr><td>Baytril</td><td>Bayer</td><td>2.50%</td><td>5 mg/kg subcutaneously</td></tr><tr><td>Tolfedine</td><td>Vetoquinol</td><td>4%</td><td>4 mg/kg subcutaneously</td></tr><tr><td>Butomidor</td><td>Richter Pharma</td><td>10 mg/ml</td><td>2 mg/kg subcutaneously</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>KRKA-Polska</td><td>Rycarfa 50mg/ml</td><td>10 mg/kg subcutaneously</td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>Jelfa</td><td>Lignocainum</td><td>topically</td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>Jelfa</td><td>20 mg/g</td><td>topically</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Surgery&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Ethicon</td><td>Spongostan dental; REF MS0005</td><td></td></tr><tr><td>Eye ointment</td><td>Dedra</td><td>Lubrithal</td><td>topically</td></tr><tr><td>CA glue</td><td>Pelikan Daniel</td><td>20G Huste</td><td></td></tr><tr><td>Dental acrylic</td><td>SpofaDental</td><td>Duracryl Plus</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxic frame</td><td>Stoelting</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tool&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverglass</td><td>Harvard Apparatus</td><td>HSE-64-0720</td><td>3 mm diameter</td></tr><tr><td>Dental drill</td><td>Sigmed</td><td>Keystone KVet</td><td></td></tr><tr><td>Fixation bar</td><td>Custom made</td><td>N/A</td><td>M2 or M3 screw nuts could be used</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Renex</td><td>PN-7B-SA</td><td></td></tr><tr><td>Micro scissors</td><td>Falcon</td><td>BM.183.180</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>KOZO</td><td>XTL6445T</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Imaging&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Holder frame</td><td>Custom made</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Two-photon microscope</td><td>Zeiss</td><td>Upright Axio Examiner Z1</td><td>Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Virus</td><td>gift from K. Deisseroth</td><td></td><td>Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter</td></tr></tbody></table>

simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

A expressão de GFP em um subconjunto de neurónios no ratinho repórter Thy1-GFP permite a imagem in vivo dos dendritos corticais e projecções axonais locais no RSC. A Figura 1A mostra a projecção máxima de uma pilha de imagens múltiplas com dendrites GFP positivas visíveis. O corpo da célula é obscurecida por uma artéria. A Figura 1B mostra uma imagem ampliada único plano (zoom digital de 3x) do ramo dendríticas indicado no 1A. Det...

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Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultânea de dois fótons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Synaptic Entradas e metas pós-sinápticos no córtex do rato retrosplï¿½ico

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

11.4K visualizações.  Nencki Institute of Experimental Biology. This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Vídeo: Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

Rotulagem alvo de neurônios em um específico domínio funcional de Micro-do neocórtex por Combinando sinal intrínseco e dois fótons de imagem

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

Neurociência

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from subcellular to network levels and at temporal scales from milliseconds to weeks. In addition, two-photon imaging can be combined with a variety of behavioral tasks to explore the causal relationships between brain function and behavior. However, in mammals, limited penetration and scattering of light have limited two-photon intravital imaging mostly to superficial brain regions, thus precluding longitudinal investigation of deep-brain areas such as the hippocampus. The hippocampus is involved in spatial navigation and episodic memory and is a long-standing model used to study cellular as well as cognitive processes important for learning and recall, both in health and disease. Here, a preparation that enables chronic optical access to the dorsal hippocampus in living mice is detailed. This preparation can be combined with two-photon optical imaging at cellular and subcellular resolution in head fixed, anesthetized live mice over several weeks. These techniques enable repeated imaging of neuronal structure or activity-evoked plasticity in tens to hundreds of neurons in the dorsal hippocampal CA1. Furthermore, this chronic preparation can be used in combination with other techniques such as micro-endoscopy, head-mounted wide field microscopy or three-photon microscopy, thus greatly expanding the toolbox to study cellular and network processes involved in learning and memory.

This method describes a chronic preparation that allows optical access to the hippocampus of living mice. This preparation can be used to perform longitudinal optical imaging of neuronal structural plasticity and activity-evoked cellular plasticity over a period of several weeks.

Imagem latente longitudinal do dois-fotão do hipocampal dorsal CA1 em ratos vivos

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

Comportamento

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de espinhas dendríticas no Rato Cortex Usando um desbaste-crânio Preparação

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imagem de atividade Neural no córtex somatossensorial primário usando Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

In vivo intracerebral injeções Estereotaxicas para estimulação Optogenética de entradas de longo alcance em fatias de cérebro de rato

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Imagem transpupilar de dois fótons in vivo da retina do rato

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

Imagem Simultânea da Dinâmica Microglial e Atividade Neuronal em Camundongos Acordados

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

<a href='https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/61970/transpupillary-two-photon-in-vivo-imaging-of-the-mouse-retina'>Source: Wang, Z., et al.&#160;Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp.&#160;(2021).</a>This video demonstrates a technique for in vivo retinal imaging using two-photon microscopy. Anesthetized mice are prepared for imaging by securing their heads, Applying eye lubricant, and placing a coverslip over the eye. Retinal ganglion cells (RGCs) expressing fluorescent proteins are first visualized using epifluorescence for alignment. Finally, two-photon imaging is employed, allowing for high-resolution visualization of RGCs.

Source: Wang, Z., et al.&#160;Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp.&#160;(2021).This video demonstrates a technique ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroimaging

Live Imaging & In Vivo Tracking

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in an Awake Mouse

Simultânea de dois fótons

Resumo

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