Yazarlar filme yardım için ses kayıtları, çizimler M. Borczyk, virüs üretimi A. Trąbczyńska, genotipleme M. Ziókowska ve A. Mirgos M. Steczkowski teşekkür etmek istiyorum. KR K. Deisseroth gelen CAMK promoterinin kontrolü altında floresan protein mCherry rekombinant adeno-ilişkili virüs (AAV) tür hediye kabul eder. Bu proje Avrupa Birliği tarafından finanse edilen CEPT altyapısı kullanılarak, Doku Yapısı ve İşlevi, Nörobiyoloji, Deneysel Biyoloji Nencki Enstitüsü Merkezi&#39;nin Hayvan Modelleri ve Laboratuvar Laboratuvarı çekirdek tesislerinde gerçekleştirildi - Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu içinde 2007-2013 Operasyonel Programı &quot;Yenilikçi Ekonomi&quot;. Bu çalışma, Ulusal Bilim Merkezi&#39;ne hibe ile desteklenmiştir: Sonata Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013/08 / G / KR ve Sonata Bis 2014 NZ24 / 00691 / 14 / E / NZ4 / 00172 RC

Aşağıda açıklanan tüm deneysel prosedürleri Deneysel Biyoloji Nencki Enstitüsü, Polonya Bilimler Akademisi Yerel Etik Kurulu tarafından kabul edildi. Not: ilişkili videoda bazı sahneler hızlanır. Hız faktörü bu sahneler gösterilir. 1. Cerrahi Hazırlık <ol><li> otoklav sıvıların ve pamuklu için tüm araçları, cam kapları sterilize. vazgeçilebilir eldiven kullanın. Cerrahi tablo, stereotaksik çerçeve ve% 70 etanol ile tüm çevresi temizleyin. tüm sterilize ekipmanlar için steril bir alan yaratmak için steril cerrahi takımını kullanın. Küçük parçalar halinde gelfoam kesin ve steril tuzlu su içinde bekletin. Not: Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu göre, etanol sterilant ne de üst düzey dezenfektan ne olduğunu. Sadece daha önceden sterilize edilmiş yüzeyler üzerinde bir temizleme / yağ ayırma maddesi olarak kullanılır. </li><li> th hayvan koymake indüksiyon odası ve / dk 2 L% 5 izofluran seviyesini ve oksijen akışını ayarlayın. Bu işlem yaklaşık 3 dakika sürer. </li><li> indüksiyon odasının dışında hayvan alın. Hayvan tamamen uyuşturulmuş sağlamak amacıyla kuyruk ya da ayak Kıstırmaları kullanın. </li><li> kesin bir düzeltici gözlerine kadar (kulak arası) başın arka saç tıraş kullanma. </li><li> stereotaksik çerçeve hayvan koyun ve kulak çubukları ile baş stabilize. </li><li> % 1.5-2 izofluran ve 0.3 L / dk oksijen anestezi seviyelerini ayarlayın. </li><li> göz merhemi sürün. </li><li> sırasıyla, iltihap, ağrı ve enfeksiyonu önlemek için Tolfedine (4 mg / kg), Butomidor (2 mg / kg) ve Baytril (5 mg / kg) ile, hayvan deri altına enjekte edilir. </li><li> Beyin şişmesini önlemek Deksametason hayvan intramüsküler (0.2 mg / kg) enjekte edilir. Not: Deksametazon deri altından enjekte ya da periton boşluğu içine, kas hasarını önlemek mümkündür. </li><li> s kullanarak cilt temizlemekBetadine ile terile pamuklu% 70 etanol ile izledi. </li><li> eldiven değiştirin ve% 70 etanol ile sprey. Not: Steril alan dokunmayın atılabilir eldivenler kullanırken. Sadece steril cerrahi aletler ve steril bezlerden uçları ile hayvan dokunun. </li></ol> 2. Kafa Pencere Cerrahisi <ol><li> forseps ile cilt kaldırın ve mikro makas gözler arasında ön noktaya eğik sonra kafa tabanı boyunca yatay olarak cilt insizyon ve kullanma. flep çıkarın. </li><li> aşırı kanama ve ağrıyı önlemek için periost üzerinde steril bir bez ile lidokain merhem sürün. </li><li> periost kaldırmak için steril pamuklu çubuklarla veya bir neşter kullanın. Steril bezlerden ile kafatası kurulayın. </li><li> Steril bir iğne kullanarak onları hareketsiz ve diş çimento ile temas önlemek için deri kenarlarında yoğun siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın. tutkal kurumasını bekleyin. </li><li> t üzerinde steril, 3 mm coverglass Laylambdoidea&#39;nın sütür ile öne o kafatası. RSC de lamel merkezi koordinatları: AP, Bregma -2.8; ML, steril bir iğne ile kafatası yüzeyi çizilmeye tarafından 0. Mark lamel kenarları bregma. % 70 etanol ile, steril kap içine geri coverglass koyun. </li><li> 3 mm çaplı daire anahat küçük çaplı çapak ile yüksek hızlı diş matkap kullanın. steril tuzlu batırılmış çubuklar ile kemik tozundan sondaj sahasını temizleyin. zaman zaman kanamayı durdurmak ve kemik temizlemek için gelfoam ve bezlerden kullanın. </li><li> sondaj arasında hafifçe kemik daire dokunmadan ve hareketliliğini kontrol ederek ince forseps ile kemik kalınlığı kontrol edin. Kemik sütür alanının üzerinde kalın olduğunu unutmayın. Kemik daire mobil ve kemik sadece bir hatta ince tabaka çevresi üzerinde bırakıldığında sondaj durdurun. tuzlu batırılmış çubuklar ile kalan tüm kemik tozu operasyonel alanını temizleyin. </li><li> delinmiş CIR kapsayan, delme alanına steril tuz bırakındöngü. Dikkatlice sonra yavaşça ince forseps ve kemik daire gözetlemek ama sıkıca yukarıya doğru kaldırarak kemiği kaldırmak. dura olası hasarları önlemek için kaldırarak kemik daire çarpık için dikkatli olun. </li><li> Yavaşça kanamayı durdurmaya yardımcı olmak için dura üzerine steril serum fizyolojik ile ıslatılmış gelfoam uygulayın. Tüm kanama tamamen durana kadar bekleyin. Dikkatle pıhtılaşma sürecini rahatsız etmeyecek gelfoam kaldırın. Not: Bu noktada kanama derin olarak kanıtlamak olabilir bu yüzden dikiş alanı, çok kanlanan olduğunu. Kanama tamamen durdurmak için yeterli bir süre beklemek gereklidir. Buz üzerine yerleştirerek soğutulan tuzlu batırılmış gelfoam tutmak için yararlıdır. </li></ol> 3. Virüs enjeksiyonundan <ol><li> stereotaktik kuleye infüzyon pompası takın ve denetleyici bağlayın. </li><li> şırınga içine 35G iğne takın. sterilize etanol şırıngayı 10 kez yıkayın ve steril tuzlu su ile 10 kat e izlerini silmek için-metanol. şırınga hava kabarcıklarını çıkarın. pompası içine şırınga yerleştirin. Not: diğer dezenfektanların kullanmayı düşünün. </li><li> (10 12 pfu tavsiye edilir) RAAV2 / 1 MCherry hazırlanması tek doz çözülme ve buz üzerinde tutmak. virüs çözümü ile şırınga doldurun. </li><li> Bregma üzerinde iğne ortalamak ve sonra yavaşça aşağıdaki koordinatları kullanarak hipokampus takın: AP -2, ML +/- 1.0, DV -1. Bu koordinatlar Kraniotomi kenarına yakın yer alacaktır. Doku stabilize etmek için 5 dakika bekleyin. </li><li> 50 nl / dak oranında rAAV2 / 1 MCherry çözeltisi 0.7 ul enjekte edilir. Virüs tamamen adsorbe için 10 dakika bekleyin. Yavaşça iğneyi çıkartın. Kanama oluşursa gelfoam ile kurulayın. kontralateral site ile tekrarlayın. </li></ol> 4. Kafa Pencere İmplantasyonu <ol><li> delinmiş daire çerçeve içinde dura üstüne steril, kuru coverglass yatıyordu. Forc ile coverglass tutuneps hafifçe dura düzleştirmek ve coverglass getirmek için &#39;kafatası yüzeye yakın kenarları. Not: coverglass pıhtı ve kanama devam eder bozan mümkündür. Bu durumda ise, coverglass asansör alkol, kuru yerleştirin ve 2.9 adıma geri dönün. </li><li> steril bir iğne coverglass kenarlarında yoğun siyanoakrilat yapıştırıcı uygulamak kullanılarak kafatası onları takmak için. tutkal kurumasını bekleyin. </li><li> Kafatasının ön kısmında bir sabitleme çubuğu (M2 somunu veya ısmarlama tasarım) yerleştirin. bar kenarlar üzerinden siyanoakrilat tutkal sürün. tutkal kurumasını bekleyin. <ol><li> oturumu görüntüleme sırasında kafatası pencerenin yatay konumlandırma sağlayacak bir konuma tespit çubuğunu yerleştirin. penceresinden mümkün olduğunca uzak yerleştirin. o pencereye çok yakın yerleştirilirse, ısmarlama tutucu ile bağlayan çubuk ve vida görüntüleme işlemi sırasında hedefi için bir engel olarak poz olabilir. </li></ol></li><li&gt; diş akrilik hazırlayın ve camın etrafında kafatası yüzeyinde uygulayın. Pencere etrafında bir krater benzeri şeklini yararlıdır. Su amacı ile görüntüleme için daha sonra uygulanacak su için bir oyuk oluşturur. </li><li> kranial pencerenin etrafında krater takviye operasyonel alanda, deri kenarları, tespit çubuğunun geri kalanını kapsayan diş akrilik bir kap oluşturun. Diş çimento sertleşmesine bekleyin. </li><li> stereotaksik çerçeve hayvan çıkarın ve kurtarma odasına koydu. </li><li> fizyolojik fonksiyonlarını izlerken hayvan ameliyatın bekleyin. </li><li> 48 saat boyunca post-operatif analjezi (karprofen, 10 mg / kg) ve antibiyotik tedavisi (Baytril, 5 mg / kg) uygulanır. </li></ol> 5. Görüntüleme <ol><li> kadar güç mikroskobu, Sapphire lazer: Ti başlatın. Bu deneyde kullanılan sistem bir iki-fotonlu lazer, OPO sistemi ve çift GaAsP PMT ile donatılmıştır. </li><li> induc hayvan koyunyon odası ve anestezi neden. </li><li> mikroskop altında gaz anestezi maskesi indüksiyon odası ve yerden hayvan çıkarın. 0.3 L / dak oksijen akışını ve% 1.5-2 izofluran konsantrasyonu azaltır. </li><li> M2 vida (veya başka bir özel sistemi) ile özel mikroskop çerçeveye hayvan sabitleyin. kranial pencereyi dengeleyin. Not: Belirli özel kare daha iyi sonuçlar (geliştirilmiş kafa istikrar, kronik deney sırasında birden oturumlarda sabit konumlandırma) verir rağmen, mikroskop üreticinin baş sabitleme sistemini kullanmak mümkündür. </li><li> retrosplenial korteksin kenarlarından birinde widefield mikroskop ayarları ve düşük büyütme objektif merkezi görünümü kullanarak ve lamel yüzey üzerine odaklanır. </li><li> krater benzeri akrilik kuyuya bir su damlasının uygulanır. Bir uzun mesafe suya daldırma hedefi geçin. Su menisküs con kadar kafatası pencereye doğru hedefe taşımaknumune ve objektif nects. </li><li> iki foton ayarlarına geçin ve en düşük zum kullanarak alt numune üst taramaya başlar. dura mater geçiş yüksek spesifik olmayan sinyalin bir parlama olarak görünür olacaktır. </li><li> tüm dinamik aralığını karşılamak için floresan hücrelerden sinyal gücüne göre her iki kanal (GFP ve mCherry) mikroskop satın alma ayarlarını yapın. </li><li> (Diğer hücrelerden ayrılmıştır dendritik ağaç ile) uygun bir nöron bulduktan sonra düşük zum ve 5 mikron z mesafe sadece GFP filterset kullanarak bir ilk tarama yapar. </li><li> Taranan yığınının maksimum projeksiyon elde etmek ve (ters renkleri kullanarak) ek açıklamalar için yazdırabilirsiniz. </li><li> İstenilen morfolojik ayrıntıları görüntüye sağlayacak bir değere zum ayarlayın. Görüntü rehber olarak maksimum projeksiyon kullanılarak GFP ve mCherry kanallarında tüm dendritik ağaç. </li></ol>

<ol>
	<li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neocortical+neurons+through+a+chronic+cranial+window.">Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).</li><li>Chow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+and+compartmental+regulation+of+dendritic+growth+in+mature+cortex.">Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex.</a> Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).</li><li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+and+storage+of+spatial+information+in+the+retrosplenial+cortex.">Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).</li><li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superficially+projecting+principal+neurons+in+layer+V+of+medial+entorhinal+cortex+in+the+rat+receive+excitatory+retrosplenial+input.">Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input.</a> J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Couey, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+inhibitory+circuitry+as+a+mechanism+for+grid+formation.">Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation.</a> Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).</li><li>Miyashita, T., Rockland, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+projections+from+the+hippocampus+to+the+retrosplenial+cortex+in+the+rat.">GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat.</a> European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).</li></ol>

Yazarlar (KL, MR, KR) patent haklarını Bu maddede kullanılan Tutucu çerçeve için (PL410001) bekleyen var.

Geçerli yazıda kranial pencereden RSC sinaptik giriş ve postsinaptik hedeflerin in vivo görüntüleme eş zamanlı iki foton için bir protokol mevcut. implantasyon prosedürü birkaç anahtar aşamadan oluşmaktadır. İlk olarak, hayvan derin anestezi ve stereotaktik çerçeve sabittir, daha sonra RSC üzerinde kafatası belirgin bir dairesel çizgiler boyunca matkap ve dairesel kemik kaldırılır ile inceltilir. Kanama durdurulduktan sonra, RAAV2 / 1 MCherry hipokampus enjekte edilir ve kapak cam delinmiş alana kafatasına sabitlenir. Son olarak sabitleme çubuğu kafasına sabitlenmiştir ve hayvan 48 saat boyunca geri odasına yerleştirilir. yaklaşık 2-3 hafta virüs ekspresyon için gerekli sonra RSC görselleştirilebilir. Görüntüleme protokolü, aşağıdaki adımlardan oluşur. İlk olarak, hayvan anestetize edilmiş ve bir mikroskop altında giderilmiştir. sonra widefield mikroskop kullanılarak ayarlanır odak, sistem swi olduğunuİki foton moduna tched ve ilgi kanalları (GFP ve mCherry) görüntülenmiştir. sunulan teknik daha önce açıklanan protokoller üzerinde büyük bir gelişme sunuyor. Standart bir yaklaşımda, bir etiket yalnızca tek bir tip tespit edilebilir. Bu görüntü, yerel akson projeksiyonları ve dendritik ağaçlar için kullanılır olabilir, ancak hiçbir uzun menzilli bağlantı çalışmaları mümkün idi. İki floresan proteinleri birleştirerek biz pre-ve postsinaptik unsurların aynı anda izleme sağladı. Bu farazi sinaptik bağlantıların in vivo izlenmesi uzun süreli sağlar. tarif edilen prosedürde en iyi sonuçları elde etmek için, birkaç kritik adımlar dikkat etmek önemlidir. inflamasyona neden ve kafatası pencerenin şeffaflığını bozabilir adım 2.8 dura herhangi bir zarar kemik daire kaldırma sırasında. Adım 2.9 veya prosedürün başka aşamada kanama Yetersiz durması, kan Birikimli sonuçlanırpencerenin altında iyon ve önemli ölçüde görüş alanını azaltır. virüs enjekte ettikten sonra sadece enjeksiyon yerinde doku içine demlenmeye virüsün sırayla, iğneyi çıkarmadan önce en az 10 dakika beklemek zorunda hayati önem taşımaktadır. Bu iğne çıkarılması sırasında virüs ile kortekste istenmeyen enfeksiyon olasılığını sınırlandırır. Viral transfeksiyon alan beyin dokusunun post hoc histolojik analiz ile muayene edilmelidir. İğne izi boyunca hücrelerin herhangi MCherry sentezleme kaçınılmalıdır. Standart iyileşme süresi 3 haftadır. Virüs sinaptik projeksiyonlar istikrarlı ifadesini ulaşmak ve kafatası pencere tamamen iyileşmek ve stabilize etmek için bu sürenin yeterli olacaktır. hayvanların tek kafes arkadaşları tarafından kafatası pencere implantın çıkarılmasını önlemek için muhafaza edilmelidir. büyütülmüş kafes kullanımı metal çubuklar vurarak kafatası pencerenin kazara zarar görmesini önlemek için düşünülebilir. mou ve stabil tespitmikroskop altında SE gereklidir. solunum hareketleri de dahil olmak üzere herhangi bir baş hareketi, elde edilen görüntülerin kalitesinde belirgin azalmaya neden olabilir. Objektif yatay kranial pencereyi konumlandırmak için pencerenin tüm düzlemi eşit odak edinme ile olası sorunları sınırlamak için de yararlıdır. çözme dikenler ve BOUTONS için net kriterler uygulanmalıdır. Genel olarak, BOUTONS önceki elyaf 7 en az 3 kat daha büyük bir çapa sahip olan aksonal şişlikler olarak tanımlanır. Dikenler, bir bombeli kafa içeren dendrit mili açıkça ayırt çıkıntılar olarak tanımlanır. İnce, küt, mantar ve dallı dikenler nüfusu içine daha fazla bölünme 3 mümkündür. Nedeniyle iki foton mikroskopi nispeten zayıf eksenel çözünürlük, optik eksen boyunca proje dikenler analizi 3 kaçınılmalıdır. Açıkça post hoc immün fonksiyonel boutons ve dikenler, ayırt etmek içinöncesi ve postsinaptik belirteçler 7 tanımlamak için yapılabilir. sunulan protokol deneysel tasarımlar en uygun olduğu kanıtlanmıştır rağmen, farklı deneysel hedeflerine uygun için bunu değiştirmek mümkündür. Bazen yerine izofluran (örneğin ketamin-Xylazin gibi) enjektabl anestezi kullanmak daha uygundur, ama yeterince farklı suşları, yaş ve cinsiyet fareler arasındaki ilaç duyarlılık zihin farklılıkları tutarak, dozunu ayarlamak için önemlidir. Bur yerine delme için küresel bir birinin bir trepan kullanmak mümkündür, ancak dura zarar görme riskini artırabilir. Steril tuzlu su başarıyla yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) ile değiştirilir, ancak hazırlanması ve işletilmesi sırasında her zaman steril tutmak için önemlidir olabilir. ACSF hazırlandıktan sonra 3-4 hafta boyunca istikrarlı ve herhangi bir kirlenme bu süreden önce ortaya çıkarsa derhal atılmalıdır. Farklı kafa fixaticihazlarda iki foton mikroskop altında uyanık fare gözlemleme olasılığı da dahil olmak üzere, deneysel tasarım bağlı olarak uygulanabilir. başka herhangi bir teknik olarak, bu aynı zamanda sınırlamaları vardır. İki foton mikroskop dura yüzeyinden 500 mikron derin beyin dokusu kadar görselleştirme sağlar. derin beyin yapılarının incelenmesi için ek modifikasyonlar uygulanmalıdır. Bizim protokol RSC çoğuna erişim sağlar, ancak superior sagittal sinüs altında gizli yapısının bir parçası hala erişilebilir değil. İki foton mikroskop çözünürlüğü belirli bir sinaps tanımlanması ve dendritik dikenler ayrıntılı morfolojik analiz için yeterli değildir. Böyle bağıntılı elektron mikroskobu gibi ek teknikler, şüpheli bir yapının varlığını doğrulamak için uygulanmalıdır. Oldukça zor bir cerrahi tekniktir olduğunu belirtmek de önemlidir ve Reco değilBir tecrübesiz operatör için mmended. sunulan teknik deneylerin geniş bir aralıkta uygulanabilir. Bu iki foton mikroskopu ile erişilebilir olan, değişik beyin bölgelerinde araştırılması için modifiye edilebilir. Bu fizyolojik ve patolojik devletler bilişsel süreçlere dahil ve yaşlanma veya nörolojik ve psikiyatrik durumların ilerlemesi çeşitli sırasında akson ve dendritik değişiklikler aynı anda izlenmesini sağlar. Bu kesin olarak tanımlanmış nöronal altkümelerini kaynaklanan projeksiyonları görselleştirmek için hücre spesifik yararlanıcı kullanımına izin verir. Aynı zamanda uyanık ve davranış hayvanlar üzerinde deneyler protokolleri uyacak şekilde ayarlanabilir. Bundan başka, kalsiyum ya da pH-duyarlı proteinler, sadece nöronal morfoloji görselleştirmek için beyinde eksprese edilebilir, ancak, aynı zamanda, hücre aktivitesi ve fonksiyon değişir. yaklaşımın başka bir muhtemel değişikliğe MCherry ekspresyonu için farklı bir rAAV serotip kullanılmasıdır. Kimerik 2/1 serotip provides yeterince hızlı başlangıçlı (2-3 hafta) ile enjeksiyon yerinde sağlam anlatım. MCherry seviyeleri ilk başlangıcından sonra en az 12 hafta süreyle stabil kaldı ve hiçbir retrograd etiketleme bizim deneylerde tespit edildi. retrograd etiketleme elde etmek için, başka bir serotip örneğin rAAV9 olarak kullanılabilir. görüntüleme oturumları en az 24 saat aralığı anestezi sonrasında hayvanın uygun kurtarma sağlamak amacıyla tavsiye edilir ancak en, herhangi bir frekansta yapılabilir. doğru uygulandığı takdirde, bu tekniğin birkaç ay boyunca aynı bölgede birden fazla görüntüleme oturumları performans sağlar. Uzun süreli deneyler (6 aydan uzun), bir CRE / LoxP sistemi floxed GFP fare hattı AAV vektörü ile birlikte rekombinaz kullanılabilir.

İki foton mikroskopi yaşayan ve hayvanları davrandığını beyin aktivitesinin gözlem devrim. 1990 yılında piyasaya sunulmasından bu yana hızla popülerlik kazanmıştır ve şimdi in vivo 1,2 beyin aktivitesinin birçok yönleriyle incelenmesi yönünde en ilginç ve yenilikçi yaklaşımlarından biri olarak uygulanır. Bu uygulamalar ve nöronal hücrelerin morfolojisi (kalsiyum seviyesi göstergeleri veya erken genler ifade kullanarak, örneğin) kan akım ölçümleri, nöronal aktivasyon dahildir. Laboratuvarların sayısı giderek artıyor in vivo beyin görüntüleme için yeni bir standart olarak bilimsel dünyada tekniği uygulayan, iki foton mikroskopları kullanın. Standart yaklaşım kafatası pencere implantasyon varil ya da fare beyninin 3 görsel korteks üzerinde (bir kapak camı ile kapatılmış kafatasına bir yuvarlak delik) içerir. Daha sonra, deney protokolüne göre, MMse zaman 4,5 üzerinde beyin aktivitesi ve nöronal morfoloji değişiklikleri izlemek için izin, görselleştirme ve davranışsal eğitim oturumları bir dizi uğrar. Her iki durumda da kraniyotomi sadece sütürler geçmeden, parietal kemik etkiler. Büyük ölçüde tekniğin başlıca dezavantajı, bu tür hazne ya da görsel korteksin kolayca erişilebilir korteks için sınırlı bir uygulama olduğuna inanılmaktadır. diğer bölgelere göre kraniyal pencere implantasyonu nedeniyle aşırı kanama ve / veya uzaysal engel için, zorluklar bir çok oluşturmaktadır. Bu yazıda in vivo mikroskopi 6 iki-foton ilgi başka bir olası bölge olarak retrosplenial korteks (RSC) Yukarıdaki kraniyal pencere implantasyonu öneriyoruz. RSC uzaysal oluşumundan sorumlu beyin devresinin önemli bir unsurdur. Anatomik, RSC kortikal, hipokampal ve talamik bölgeleri 7 bağlayan bir nöronal ağın bir parçasıdır. Buağır gibi uzamsal öğrenme ve nesli yanı sıra mekansal navigasyon 6 gibi davranışların, bir dizi çıkıyor. Nöronların morfolojik değişikliklerini görselleştirmek için biz Thy1 promoteri altında yeşil floresan protein (GFP) eksprese eden bir transgenik fare hattı kullanır. Bu farelerde, GFP iki foton mikroskopi 8 kullanarak kortikal akson ve dendritler net görüntülenmesi için izin beyindeki nöronların yaklaşık% 10 olarak ifade edilir. Biz teklif Başka bir yenilik RSC projelendirme beynin derin yapılara bir nöron spesifik CaMKII promotör 9 altında kırmızı floresan proteini (mCherry) kodlama bir rekombinant adeno-ilişkili virüs serotipi 2/1 (/ 1 RAAV2) enjekte edilmesidir hipokamp gibi. Thy1-GFP fare hipokampusunda rAAV2 / 1 mCherry sentezleme Hippocampo-cortica öncesi ve postsinaptik elemanlarının aynı anda görüntülenmesi sağlarl 10 sinapsların. Protein aksonal terminallerde yeterli düzeyde ulaşmasını mCherry rAAV güdümlü ifade iki ila üç hafta gerektirir. Bu süre Kraniotomi kurtarma için gerekli her zamanki saatinde ile tutarlıdır.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Drug&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>5-2% pre-operative</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>1.5-2% during surgery</td></tr><tr><td>Dexametasone</td><td>Scan Vet</td><td>Dexasone 2mg/ml</td><td>0.2 mg/kg intramuscular</td></tr><tr><td>Baytril</td><td>Bayer</td><td>2.50%</td><td>5 mg/kg subcutaneously</td></tr><tr><td>Tolfedine</td><td>Vetoquinol</td><td>4%</td><td>4 mg/kg subcutaneously</td></tr><tr><td>Butomidor</td><td>Richter Pharma</td><td>10 mg/ml</td><td>2 mg/kg subcutaneously</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>KRKA-Polska</td><td>Rycarfa 50mg/ml</td><td>10 mg/kg subcutaneously</td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>Jelfa</td><td>Lignocainum</td><td>topically</td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>Jelfa</td><td>20 mg/g</td><td>topically</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Surgery&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Ethicon</td><td>Spongostan dental; REF MS0005</td><td></td></tr><tr><td>Eye ointment</td><td>Dedra</td><td>Lubrithal</td><td>topically</td></tr><tr><td>CA glue</td><td>Pelikan Daniel</td><td>20G Huste</td><td></td></tr><tr><td>Dental acrylic</td><td>SpofaDental</td><td>Duracryl Plus</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxic frame</td><td>Stoelting</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tool&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverglass</td><td>Harvard Apparatus</td><td>HSE-64-0720</td><td>3 mm diameter</td></tr><tr><td>Dental drill</td><td>Sigmed</td><td>Keystone KVet</td><td></td></tr><tr><td>Fixation bar</td><td>Custom made</td><td>N/A</td><td>M2 or M3 screw nuts could be used</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Renex</td><td>PN-7B-SA</td><td></td></tr><tr><td>Micro scissors</td><td>Falcon</td><td>BM.183.180</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>KOZO</td><td>XTL6445T</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Imaging&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Holder frame</td><td>Custom made</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Two-photon microscope</td><td>Zeiss</td><td>Upright Axio Examiner Z1</td><td>Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Virus</td><td>gift from K. Deisseroth</td><td></td><td>Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter</td></tr></tbody></table>

simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Thy1-GFP raportör fare nöronların bir alt GFP tanımı kortikal dendrit ve RSC lokal akson çıkıntıların in vivo görüntüleme karşılaştırın. Şekil 1A görebilir birden GFP pozitif dendritler ile görüntülerin bir yığının en projeksiyon gösterir. Hücre gövdesi bir arter altında kalmıştır. Şekil 1B 1A belirtilen dendritik şube tek bir düzlem uzaklaştırdınız görüntü (dijital zoom 3x) gösterir. dendritik morfoloji (dikenler, filopodia) Detayları açıkça görülebilir. GFP kanal bant geçiren emisyon filtresi 500-550 nm kullanılarak elde edilir. Dorsal hipokampusun içine RAAV2 / 1 mCherry bir enjeksiyon RSC sonlanan hipokampal akson ve sinaptik BOUTONS görselleştirme sağlar. Bu terminaller MCherry kanalı (band geçiren emisyonu 570-610 nm filtre) tespit edilebilir. Şekil 1. RSC nöronlar ve RSC hipokampal çıkıntı in vivo iki foton görüntüleme İki kanal (A). RSC bir fragman (renkle gösterilen resim) GFP-ifade eden hücrelerin bir bakış. düşük büyütme (0.7x dijital zoom) alınan 100 mikron kalınlığında yığının gösterilen maksimum projeksiyon. GFP kanalında yüksek büyütme (3x dijital zoom) edinilen (B), (A) bendinde belirtilen fragmanın tek optik düzlem. MCherry alıcı ayarlar kullanılarak (c) (a) &#39;de gösterilen tek optik bir düzlem parçası. Algılama filtreleri ayrıntılar için Protokol bakın. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53528/53528fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex at JoVE.com

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Eşzamanlı İki foton<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

simultaneous-two-photon-vivo-imaging-synaptic-inputs-postsynaptic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

11.4K Görüntüleme.  Nencki Institute of Experimental Biology. This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Video: Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

Belirli Fonksiyonel İçsel Sinyal birleştiren tarafından neokorteks Mikro-etki ve İki foton Görüntüleme nöronlar Hedefli Etiketleme

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

Nörobilim

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from subcellular to network levels and at temporal scales from milliseconds to weeks. In addition, two-photon imaging can be combined with a variety of behavioral tasks to explore the causal relationships between brain function and behavior. However, in mammals, limited penetration and scattering of light have limited two-photon intravital imaging mostly to superficial brain regions, thus precluding longitudinal investigation of deep-brain areas such as the hippocampus. The hippocampus is involved in spatial navigation and episodic memory and is a long-standing model used to study cellular as well as cognitive processes important for learning and recall, both in health and disease. Here, a preparation that enables chronic optical access to the dorsal hippocampus in living mice is detailed. This preparation can be combined with two-photon optical imaging at cellular and subcellular resolution in head fixed, anesthetized live mice over several weeks. These techniques enable repeated imaging of neuronal structure or activity-evoked plasticity in tens to hundreds of neurons in the dorsal hippocampal CA1. Furthermore, this chronic preparation can be used in combination with other techniques such as micro-endoscopy, head-mounted wide field microscopy or three-photon microscopy, thus greatly expanding the toolbox to study cellular and network processes involved in learning and memory.

This method describes a chronic preparation that allows optical access to the hippocampus of living mice. This preparation can be used to perform longitudinal optical imaging of neuronal structural plasticity and activity-evoked cellular plasticity over a period of several weeks.

Canlı fareler içinde dorsal hipokampal CA1 uzunlamasına Iki foton görüntüleme

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

Davranış

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Sinirsel aktivite Thy1kullanarak birincil somatosensor kortekste Imaging-GCaMP6s transgenik fareler

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

Fare Beyin Dilimlerinde Uzun Menzilli Girdilerin Optogenetik Stimülasyonu için Vivo İntraserebral Stereotaksik Enjeksiyonlarda

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupiller İki Foton Fare Retinasının In vivo Görüntülenmesi

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

<meta charset="utf8"></head><body>Fare Duyusal Korteks Geliştirmede Nöronal Aktivite Haritalaması

In Vivo Visualization of Spontaneous Activity in Neonatal Mouse Sensory Cortex at a Single-Neuron Resolution

The mammalian brain undergoes dynamic developmental changes at both the cellular and circuit levels throughout prenatal and postnatal periods. Following the discovery of numerous genes contributing to these developmental changes, it is now known that neuronal activity also substantially modulates these processes. In the developing cerebral cortex, neurons exhibit synchronized activity patterns that are specialized to each primary sensory area. These patterns markedly differ from those observed in the mature cortex, emphasizing their role in regulating area-specific developmental processes. Deficiencies in neuronal activity during development can lead to various brain diseases. These findings highlight the need to examine the regulatory mechanisms underlying activity patterns in neuronal development. This paper summarizes a series of protocols to visualize primary sensory areas and neuronal activity in neonatal mice, to image the activity of individual neurons within the cortical subfields using two-photon microscopy in vivo, and to analyze subfield-related activity correlations. We show representative results of patchwork-like synchronous activity within individual barrels in the somatosensory cortex. We also discuss various potential applications and some limitations of this protocol.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: İki Foton Mikroskobu ve Tek Nöron Görüntülemeden Nöral Devre Oluşumunun Deşifre Edilmesi

Primary sensory areas in the neocortex exhibit unique spontaneous activities during development. This article describes how to visualize individual neuron activities and primary sensory areas to analyze area-specific synchronous activities in neonatal mice in vivo.

Yenidoğan Fare Duyusal Korteksinde Tek Nöron Çözünürlükte Spontan Aktivitenin İn vivo Görselleştirilmesi

The mammalian brain undergoes dynamic developmental changes at both the cellular and circuit levels throughout prenatal and postnatal periods. Following ...

Eşzamanlı İki foton

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Belirli Fonksiyonel İçsel Sinyal birleştiren tarafından neokorteks Mikro-etki ve İki foton Görüntüleme nöronlar Hedefli Etiketleme

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

Canlı fareler içinde dorsal hipokampal CA1 uzunlamasına Iki foton görüntüleme

İki-Foton

Sinirsel aktivite Thy1kullanarak birincil somatosensor kortekste Imaging-GCaMP6s transgenik fareler

Fare Beyin Dilimlerinde Uzun Menzilli Girdilerin Optogenetik Stimülasyonu için Vivo İntraserebral Stereotaksik Enjeksiyonlarda

Transpupiller İki Foton Fare Retinasının In vivo Görüntülenmesi

Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi

Yenidoğan Fare Duyusal Korteksinde Tek Nöron Çözünürlükte Spontan Aktivitenin İn vivo Görselleştirilmesi

Yenidoğan Fare Duyusal Korteksinde Tek Nöron Çözünürlükte Spontan Aktivitenin İn vivo Görselleştirilmesi