نود أن نشكر LHW ستيفتونغ، في تريزين ليختنشتاين، لدعم ماليا أبحاثنا على الاكسدة.

تمت الموافقة على الدراسات المتعلقة مقايسة المذنب أجريت في جامعة بازل قسم العيون من قبل اللجنة الأخلاقية المحلية من بازل 1. إعداد الكواشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (كا ++، والمغنيسيوم ++ مجاني) حل عن طريق إضافة PBS (1 L حزمة) و 990 مل من درهم 2 O إلى وسائل الإعلام. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4. تخزين في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل الناشر: إعداد 1000 مل إضافة 2.5 M كلوريد الصوديوم (146.1 ز)، و 100 ملي EDTA (37.2 غرام) و 10 ملي Trizma قاعدة (1.2 غرام) في DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العازلة الكهربائي (300 ملي هيدروكسيد الصوديوم / 1 ملم EDTA) وذلك بإضافة 30 مل من 10 M هيدروكسيد الصوديوم و 7.5 مل من EDTA 0.2M، QS إلى 1500 مل درهم 2 O وتخلط جيدا. الحجم الكلي يعتمد على قدرة مربع هلام. قبل استخدامها، وقياس الرقم الهيدروجيني للعازلة لضمان درجة حموضة&gt; 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العازلة تحييد تحتوي على 0.4 M تريس (المضافة 48.5 جرام إلى ~ 800 مل درهم 2 O، وضبط درجة الحموضة إلى 7.5)، تتركز (&amp; #62؛ 10 M حمض الهيدروكلوريك) في 1000 مل مع DH 2 O. تخزين الحل في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل تلطيخ. لإيثيديوم بروميد (EtBr، 10X المالية، 20 ميكروغرام / مل) إضافة 10 ملغ من EtBr في 50 مل درهم 2 O وتخزينها في RT. ل1X المالية - مزيج 1 مل مع 9 مل درهم 2 O. الحذر! التعامل مع EtBr بحذر كاف كما هو مادة مسرطنة معروفة. </li></ol> 2. عزل الكريات البيضاء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على عينات دم الإنسان (20 مل) مع مكافحة تجلط الدم مثل الهيبارين باستخدام ثقب الوريدي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الخلايا اللمفية باستخدام فاصل الخلايا التدرج الكثافة مثل Histopaque. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفترة وجيزة، وتمييع الدم في نسبة 1: 1 مع برنامج تلفزيوني أو RPMI (بدون FBS) وطبقة أكثر من 600 ميكرولتر فاصل الخلايا السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي 1800 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. نضح معطف &quot;الشهباء&quot; في 3-5 مل من PBS / RPMI وطرد في 300 x ج لمدة 10 دقيقة لتكوير الخلايا الليمفاوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد الخلايا الليمفاوية من فوق الحدود بين PBS (RPMI) وسائل فاصل الخلايا، باستخدام pipettor. إزالة العصابات الكريات البيض من واجهة بين البلازما وطبقات فصل الخلايا السائلة من كل أنبوب وجمع في أنبوب واحد 50 مل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب الحجم الإجمالي إلى 50 مل من البرد Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM). غسل تعليق الخلية ثلاث مرات مع DMEM في 300 x ج لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الأرقام الإجمالية للخلايا باستخدام Haemocytometer. تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني وaliquote في أنابيب microcentrifuge في 10 7 خلية / أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة 0،4 مل من الخلايا في البلاستيك 5 مل أنبوب المتاح. إضافة 1.2 مل 1٪ منخفضة التبلور درجات الحرارة الاغاروز عند 40 درجة مئوية. مزيج بسرعة والماصة 1،2 مل من تعليق خلية على سطح مغطى الاغاروز شريحة المغلفة مسبقا. تجنب إنتاج فقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للالاغاروز لجل لحوالي 2 دقيقة. أن تكون متسقة مع الوقت ودرجة الحرارة المستخدمة في التبلور، وضمان أن يتم تعيين الاغاروز بالكامل قبل غمر في حل تحلل. بعد تماما الصورةوآخرون، يغرق في الناشر الحل في ~ 4 درجة مئوية. </li></ol> 3. تحلل والكهربائي ملاحظة: الإجراء المبين هو لالكهربائي في ظل ظروف درجة الحموضة&gt; 13 القلوية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد لا يقل عن 2 ساعة على ~ 4 درجات مئوية، وإزالة بلطف الشرائح من الحل الناشر. مكان الشرائح جنبا إلى جنب على مربع هلام الأفقي قرب نهاية واحدة، انزلاق لهم أقرب معا ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء خزانات عازلة مع تقدم طازجة درجة الحموضة عازلة&gt; 13 الكهربائي حتى يغطي مستوى السائل تماما الشرائح (تجنب فقاعات على الاغاروز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح الشرائح الجلوس في المخزن المؤقت القلوية لمدة 20 دقيقة للسماح للاسترخاء من الحمض النووي والتعبير عن الضرر القلوي عطوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على إمدادات الطاقة إلى 25 فولت (~ 0.75 V / سم) وضبط الحالي إلى 300 مل أمبير من خلال رفع أو خفض مستوى العازلة. Electrophorese الشرائح لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف الطاقة. رفع بلطف الشرائح من المخزن المؤقت وصالحذاء على صينية هجرة. إسقاط معطف الحكمة الشرائح مع تحييد العازلة. السماح للشرائح على الجلوس لمدة 5 دقائق على الأقل. استنزاف الشرائح وكرر مرتين أخريين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار على الشرائح مع 80 ميكرولتر 1X إيثيديوم بروميد (EtBr) ويترك لمدة 5 دقائق ثم تراجع في الماء المقطر البارد لإزالة وصمة عار الزائدة. ثم وضع ساترة على الشريحة وتخزينها على الفور. متجر الشرائح لمدة شهر في RT في الظروف الجافة. ملاحظة: بقع DNA أخرى (على سبيل المثال،-SYBR الأخضر) يمكن أن تستخدم أيضا. الحذر! ارتداء قفازات واقية لأن معظم الأصباغ هي مطفرة. </li></ol> 4. الكمي للفواصل DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصور الحمض النووي من التلف، ومراقبة الشريحة DNA EtBr الملون تحت المجهر 40X الفلورسنت موضوعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم الحمض النووي من التلف كميا في الخلايا عن طريق قياس طول الحمض النووي للهجرة ونسبة DNA هاجر (الشكل 1A). تحديد الحمض النووي من التلف (الشكل 1B) من اللحظة Tail- والزيتون الأحمقالإقليم الشمالي. سبق تعاريف للالذيل لحظة والزيتون -Moment 10/08. ملاحظة: في تجربتنا يكفي لعصا من قبل إحدى المعلمات. يتم تصويرها الخلايا عن طريق تعيين أداة آلية التي تفحص أكثر من الخلايا شريحة المجهر والصور الفوتوغرافية. ويمكن أن يتم التحديد الكمي للفواصل DNA من قبل حزم برمجيات تحليل الصور. هناك العديد من حزم البرامج المختلفة التي تصنع حسب الطلب لالتقاط صورة من الخلايا وتحديد الحمض النووي من التلف. نوصي باستخدام حزمة البرامج نفسها في كافة مراحل التجربة. يحدد فني مختبر خلية سليمة أو المذنب أن يسجل على الكمبيوتر وينقر بالماوس على ذلك. ثم سجلت الخلية المذنب أو سليمة تلقائيا. </li></ol>

<ol>
	<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Phillips, J. L., Singh, N. P., Lai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electromagnetic+fields+and+DNA+damage.">Electromagnetic fields and DNA damage.</a> Pathophysiology. 16 (2-3), 79-88 (2009).</li><li>Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet+assay:+a+reliable+tool+for+the+assessment+of+DNA+damage+in+different+models.">Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models.</a> Cell Biol Toxicol. 25 (1), 5-32 (2009).</li><li>Aiub, C. A., Pinto, L. F., Felzenszwalb, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-repair+genes+and+vitamin+E+in+the+prevention+of+N-nitrosodiethylamine+mutagenicity.">DNA-repair genes and vitamin E in the prevention of N-nitrosodiethylamine mutagenicity.</a> Cell Biol Toxicol. 25 (4), 393-402 (2009).</li><li>Bartsch, H., Nair, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+inflammation+and+oxidative+stress+in+the+genesis+and+perpetuation+of+cancer:+role+of+lipid+peroxidation,+DNA+damage,+and+repair.">Chronic inflammation and oxidative stress in the genesis and perpetuation of cancer: role of lipid peroxidation, DNA damage, and repair.</a> Langenbecks Arch Surg. 391 (5), 499-510 (2006).</li><li>Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+repair:+relevance+to+mechanisms+of+neurodegeneration.">DNA damage and repair: relevance to mechanisms of neurodegeneration.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67 (5), 377-387 (2008).</li><li>Choy, C. K., Benzie, I. F., Cho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV-mediated+DNA+strand+breaks+in+corneal+epithelial+cells+assessed+using+the+comet+assay+procedure.">UV-mediated DNA strand breaks in corneal epithelial cells assessed using the comet assay procedure.</a> Photochem Photobiol. 81 (3), 493-497 (2005).</li><li>Mozaffarieh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comet+assay+analysis+of+single-stranded+DNA+breaks+in+circulating+leukocytes+of+glaucoma+patients.">Comet assay analysis of single-stranded DNA breaks in circulating leukocytes of glaucoma patients.</a> Mol Vis. 14, 1584-1588 (2008).</li><li>Mozaffarieh, M., Konieczka, K., Hauenstein, D., Schoetzau, A., Flammer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half+a+pack+of+cigarettes+a+day+more+than+doubles+DNA+breaks+in+circulating+leukocytes.">Half a pack of cigarettes a day more than doubles DNA breaks in circulating leukocytes.</a> Tob Induc Dis. 8 (14), (2010).</li><li>Mozaffarieh, M., Schotzau, A., Josifova, T., Flammer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+ranibizumab+versus+photodynamic+therapy+on+DNA+damage+in+patients+with+exudative+macular+degeneration.">The effect of ranibizumab versus photodynamic therapy on DNA damage in patients with exudative macular degeneration.</a> Mol Vis. 15, 1194-1199 (2009).</li><li>Pertynska-Marczewska, M., Merhi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+Advanced+Glycation+End+Products+With+Cardiovascular+Disease+in+Menopausal+Women.">Relationship of Advanced Glycation End Products With Cardiovascular Disease in Menopausal Women.</a> Reprod Sci. , (2014).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells).">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells).</a> Exp Cell Res. 175, 184-191 (1988).</li><li>Gaiv&#227;o, I., Sierra, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+comet+assay:+insights,+uses,+and+future+perspectives.">Drosophila comet assay: insights, uses, and future perspectives.</a> Front Genet. 5, 304 (2014).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+in+lens+epithelial+cells+and+peripheral+lymphocytes+from+age-related+cataract+patients.">DNA damage in lens epithelial cells and peripheral lymphocytes from age-related cataract patients.</a> Ophthalmic Res. 51 (3), 124-128 (2014).</li><li>Huet, S. A., Vasseur, L., Camus, S., Chesn&#233;, C., Fessard, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+comet+and+micronucleus+assays+in+metabolic+competent+HepaRG+cells+to+predict+in+vivo+genotoxicity.">Performance of comet and micronucleus assays in metabolic competent HepaRG cells to predict in vivo genotoxicity.</a> Toxicol Sci. 138 (2), 300-309 (2014).</li><li>Danson, S., Ranson, M., Denneny, O., Cummings, J., Ward, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+the+comet-X+assay+as+a+pharmacodynamic+assay+for+measuring+DNA+cross-linking+produced+by+the+novel+anticancer+agent+RH1+during+a+phase+I+clinical+trial.">Validation of the comet-X assay as a pharmacodynamic assay for measuring DNA cross-linking produced by the novel anticancer agent RH1 during a phase I clinical trial.</a> Cancer chemotherapy and pharmacology. 60, 851-861 (2007).</li><li>Moller, P., Moller, L., Godschalk, R. W., Jones, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+and+reduction+of+comet+assay+variation+in+relation+to+DNA+damage:+studies+from+the+European+Comet+Assay+Validation+Group.">Assessment and reduction of comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay Validation Group.</a> Mutagenesis. 25, 109-111 (2010).</li><li>Chan, S. W., Chevalier, S., Aprikian, A., Chen, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+of+mitochondrial+DNA+damage+and+copy+number+in+circulating+blood:+a+sensitive+approach+to+systemic+oxidative+stress.">Simultaneous quantification of mitochondrial DNA damage and copy number in circulating blood: a sensitive approach to systemic oxidative stress.</a> BioMed Res Int. , 157-547 (2013).</li><li>Sanchez-Quesada, J. L., Perez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+lipoproteins+as+biomarkers+of+cardiovascular+risk+in+diabetes+mellitus.">Modified lipoproteins as biomarkers of cardiovascular risk in diabetes mellitus.</a> Endocrinol Nutr. 60, 518-528 (2013).</li><li>Gandhi, G., Kaur, G., Nisar, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-sectional+case+control+study+on+genetic+damage+in+individuals+residing+in+the+vicinity+of+a+mobile+phone+base+station.">Cross-sectional case control study on genetic damage in individuals residing in the vicinity of a mobile phone base station.</a> Electromagn Biol Med. 9, 1-11 (2014).</li><li>Cabarkapa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+dry+olive+leaf+extract+in+adrenaline+induced+DNA+damage+evaluated+using+in+vitro+comet+assay+with+human+peripheral+leukocytes.">Protective effect of dry olive leaf extract in adrenaline induced DNA damage evaluated using in vitro comet assay with human peripheral leukocytes.</a> Toxicol In Vitro. 28 (3), 451-456 (2014).</li></ol>

لا شيء.

كان علماء سويديون أوستلينج وجوهانسون الأولى من نوعها في مجال عملهم لاستخدام مقايسة المذنب لتحديد الحمض النووي من التلف في الخلايا 1. شروط محايدة اثنين من العلماء تستخدم، ولكن فقط يسمح للكشف عن فواصل الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل. سينغ وآخرون. تكييفها في وقت لاحق مقايسة للاستخدام تحت الظروف القلوية، التي أنتجت نسخة الحساسة التي يمكن تقييم فواصل الحمض النووي المزدوج والمفرد الذين تقطعت بهم السبل وكشف مواقع القلويات عطوب 12. منذ تطوره الأولية، تم تعديل مقايسة على الخطوات المختلفة لجعلها مناسبة لتقييم أنواع من الحمض النووي من التلف في أنواع مختلفة من الخلايا 13-15. كما هو الحال مع جميع التقنيات، مع إيلاء اهتمام دقيق إلى التفاصيل الفنية المهم للحصول على نتائج دقيقة 16. بناء على خبرتنا، ويتم الحصول على أفضل النتائج إذا كل خطوة من إعداد المنهجية حل لالمذنب والكمي التي يقوم بها المختبر ميتاليك الخبراءicians. استخدام وسائل الإعلام الجديدة واستعداد بشكل صحيح، وتقنيات pipetting لالكافية، والتوقيت الدقيق و(كما ذكر سابقا في قسم النتائج) استخدام الطازجة الكريات البيض ضرورية من أجل تحلل وهلام الكهربائي للحصول على نتائج دقيقة 17. كل الخطوات الفردية في هذا الاختبار هي نفس القدر من الأهمية للحصول على نتائج موثوقة. 16 وفي أفضل النتائج العامة ويتم الحصول على إذا يتم تنفيذ كل خطوة منهجية واحدة من إعداد حل حتى الكمي المذنب خبير technicians.Important مختبر ويبدو أن استخدام وسائل الإعلام الجديدة ومستعدة بشكل صحيح والتقنيات pipetting لكافية، التوقيت الدقيق وكما سبقت الإشارة إليه في القسم نتائج استخدام الكريات البيض الطازج للتحلل وهلام الكهربائي للحصول على نتائج كافية من فحص 17. كما يفعل منهجيات أخرى، وتقنية الفحص المذنب لديها يمضي بهاتاغس وعيوب. كونها طريقة حساسة، وفحص عرضة لعوامل (على سبيل المثال، وعلى ضوء الأشعة فوق البنفسجية) والتي يمكن أن تزيد فواصل DNA وبالتالي تؤثر على النتائج. أي العوامل التي قد تعزز الاكسدة، باستثناء تلك التي يجري بحثها، ينبغي تجنبها. يمكن الضغوطات زيادة مستوى الإجهاد التأكسدي ليس فقط في الكريات البيض ولكن أيضا في جميع وسائل الدم وغيرها من الخلايا الليمفاوية. كما ذكر في وقت سابق أن هناك العديد من الطرق المختلفة وأكثر مباشرة لقياس الإجهاد التأكسدي 18،19. مقايسة المذنب هو واحد من العديد من الطرق التي لديها بعض المزايا. وتشمل هذه تكلفته النسبية منخفضة، وعدد قليل من الخلايا المطلوبة (&lt;10000 الخلايا) وبالتالي عينات صغيرة من الدم المطلوبة لكل مريض، وخلال فترة قصيرة نسبيا من الوقت اللازم لتحديد الحمض النووي من التلف في الخلايا (حوالي 3 أيام)، حساسيته ولها اسعة الانتشار تطبيقها على الحمض النووي من التلف الحمير في مختلف أنواع الخلايا. في الماضي نختار للعمل مع الكريات البيض منذ كان لدينا تجربة مع هذاكان من نوع الخلية وذلك ينطبق على دراسة معينة المخطط لها. ميزة أخرى للمقايسة المذنب هو أنه يمكن استخدامها للكشف عن أنواع ومستويات الحمض النووي من التلف المختلفة، وبالتالي يمكن تطبيقها في مناطق أخرى مختلفة من الدراسات إلى جانب الاكسدة مثل دراسات إصلاح الحمض النووي، والتجارب مكملات أو دراسات السمية الوراثية. يتم الاعتراف الاكسدة الآن كما لعب دورا حاسما في التسبب في أمراض متعددة. طريقة الفحص المذنب، في حين أن أحد طرق عديدة لقياس الإجهاد التأكسدي 18،19، هو بسيط نسبيا، وتنوعا وغير مكلفة. عندما يتقن، وهذه الطريقة يمكن استخدامها في جميع مجالات الطب التي الاكسدة يلعب دورا 8-10،20،21.

وقد وضعت مقايسة المذنب أول مرة من قبل علماء سويديون أوستلينج وجوهانسون 1. الحمض النووي هو جزيء سالبة الشحنة. خلال الكهربائي، أصغر، شظايا الحمض النووي التالف السفر أسرع نحو القطب الموجب موجبة الشحنة +2. أصغر شظايا الحمض النووي، وأسرع هجرتها نحو القطب الموجب لتشكيل &quot;المذنب&quot; نموذجي مع &quot;الرأس&quot; تتألف من حالها، DNA التالفة و &quot;ذيل&quot; مؤلفة من شظايا الحمض النووي التالف 3. يمكن اصلاحها الحمض النووي التي تضررت من الآليات المختلفة في الجسم 4، والتي تبقي توليد فواصل DNA متوازنة إلى حد ما 5. إذا، ومع ذلك، فإن التوازن هو في صالح فواصل DNA، يمكن فواصل تتراكم وسوف تسهم في نهاية المطاف إلى تطور المرض. DNA لدينا يعاني حوالي 0.000165 الضرر٪ في وقت معين 6. فواصل الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحدة تشير إلى وجود خلل في واحد من اثنين من خيوط الحلزون المزدوج DNAبينما هي سبب فواصل الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل عند تلف كل من خيوط الحلزون المزدوج DNA. هناك العديد من العوامل التي قد تعزز كمية فواصل DNA في وقت معين مثل عمر الخلية، ودخان السجائر، الأدوية المختلفة أو الإجهاد التأكسدي 7-9. إذا وتحفظ كل العوامل التي تؤدي إلى فواصل DNA تعزيز المستمر، ثم القياس الكمي للفواصل DNA عن طريق فحص المذنب هو معلمة جيدة غير المباشرة من الاكسدة. يتم استخدام طريقة الفحص المذنب على نحو متزايد اليوم في الطب بما في ذلك طب العيون. وأحد أسباب ذلك هو أن الاكسدة هو المزيد والمزيد من الاعتراف كآلية إمراضي لمختلف الأمراض 8-11 ومقايسة المذنب هو أسلوب واحد التي الأكسدة الإجهاد يمكن أن يكون كميا بشكل غير مباشر.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>(CPW59)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium EDTA</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(RM1370)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>(E-8751)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>(1077-1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(TS1006)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Ranbaxy Rankem</td>
			<td>(S0160)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>BDH-Merck</td>
			<td>(89021)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(RM 845)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Spectrochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials required for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Melting Agarose (NMA)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(RM273)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melting Point Agarose (LMPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>(A9414)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol - Qualigens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm)</td>
			<td>Blue Star</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>(500010)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettor and Tips</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comet assay as an indirect measure of systemic oxidative stress

كائنات حقيقية النواة أعلى لا يمكن ان يعيش بدون أكسجين؛ بعد، للمفارقة، الأكسجين يمكن أن تكون ضارة لهم. جزيء الأكسجين كيميائيا خامل نسبيا لأنه يحتوي على اثنين من الإلكترونات المفردة تقع في مختلف المدارات بي * مكافحة الترابط. هذه الالكترونات لهما يدور موازية، وهذا يعني أنها تدور في نفس الاتجاه حول المحاور الخاصة بهم. هذا هو السبب في أن جزيء الأكسجين ليس رد الفعل جدا. قد تحدث تفعيل الأوكسجين من قبل اثنين من آليات مختلفة. إما عن طريق تخفيض عبر إلكترون واحد في (خفض أحادي التكافؤ) مرة، أو عن طريق امتصاص الطاقة كافية لعكس اتجاه دوران واحد من الإلكترونات المفردة. وهذا يؤدي إلى إنتاج الأنواع المؤكسدة رد الفعل (ROS). هناك عدد من الطرق التي يمكن للجسم البشري يلغي ROS في حالته الفسيولوجية. إذا تجاوز إنتاج ROS القدرة إصلاح، والنتائج الاكسدة والأضرار جزيئات مختلفة. هناك العديد من الطرق المختلفة التي الاكسدة يمكن أن يكون ليasured. وتركز هذه المخطوطة على إحدى الطرق اسمه الكهربائي هلام الخلية، والمعروفة أيضا باسم &quot;مقايسة المذنب&quot; الذي يسمح بقياس فواصل DNA. إذا يتم الاحتفاظ جميع العوامل المعروفة يسبب التلف في الحمض النووي، وغيرها من الاكسدة المستمر، وكمية من الحمض النووي من التلف تقاس مقايسة المذنب هو معلمة جيدة من الاكسدة. مبدأ بسيط ويعتمد على حقيقة أن جزيئات DNA وسالبة الشحنة. جزيء DNA سليمة لديه مثل حجم كبير أنه لا تهاجر خلال الكهربائي. فواصل DNA، ولكن، إذا كانت النتيجة الحالية في أجزاء أصغر والتي تتحرك في مجال كهربائي نحو القطب الموجب. شظايا أصغر تهاجر أسرع. كما شظايا وأحجام مختلفة النتيجة النهائية للالكهربي ليست خط واضح بل سلسلة متصلة مع شكل مذنب. النظام يسمح لتقدير حجم الناتج &quot;المذنب&quot; وبالتالي فواصل DNA في الخلية.

على الرغم من أن طريقة الفحص المذنب يجعل النتائج استنساخه، فإنه يمكن أن تتأثر مجموعة متنوعة من العوامل. أحد هذه العوامل هو ما إذا كان أو لم يتم cryopreserved الكريات البيض قبل تحلل وهلام الكهربائي أو ما إذا كان يتم تنفيذ هذه الخطوة على الطازجة الكريات البيض الشكل 2 يدل على أن في المجموعة 2، حيث تم cryopreserved الكريات البيض قبل DNA تحلل والكهربائي للهلام SS- وكانت فواصل أعلى بكثير، مما كانت عليه في المجموعة 1 حيث يتم تحلل وهلام -electrophoresis على الخلايا الطازجة. ويمكن أيضا فحص استخدامها لتقييم بشكل غير مباشر الاكسدة النظامية. ويبين الجدول 1 الإحصاءات الوصفية لTail- حظة وOlive- حظة في المدخنين والأصحاء. يكشف البيانات أن تدخين نصف علبة سجائر يوميا أكثر من الضعف فواصل ssDNA في الكريات البيض المتداولة 9. <img alt="الشكل 1A" src= &quot;/ ملفات / ftp_upload / 52763 / 52763fig1A.jpg&quot; /&gt; <img alt="الرقم 1B" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig1B.jpg" /> الشكل 1. (A) يصور الاداة المستخدمة خلال تحليل مقايسة المذنب. (B) Δ يصور &quot;المذنب&quot; نموذجي مع رئيس مشرق والذيل (تلف الحمض النووي شظايا أصغر). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52763/52763fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig2.jpg" /> وكانت الشكل 2. فواصل ssDNA أعلى بكثير عندما cryopreserved الكريات البيض (المجموعة 2) مما كانت عليه عندما كانت تستخدم طازجة الكريات البيض قبل تحلل وهلام الكهربائي. <imgALT = &quot;الجدول 1&quot; SRC = &quot;/ ملفات / ftp_upload / 52763 / 52763table1.jpg&quot; /&gt; كان الجدول 1. المدخنون أكثر من ضعف عدد ssDNA يكسر بالمقارنة مع العمر والجنس يقابل صحي غير المدخنين.

Watch this Scientific Journal Video about Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress at JoVE.com

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

يقيس الفحص المذنب فواصل DNA، الناجم عن عوامل مختلفة. إذا يتم الاحتفاظ جميع العوامل (باستثناء الاكسدة) مما تسبب في أضرار الحمض النووي المستمر، وكمية من الحمض النووي من التلف معلمة جيدة غير المباشرة من الاكسدة. والهدف من هذا البروتوكول هو استخدام مقايسة المذنب لقياس غير مباشر من الإجهاد التأكسدي.

المذنب الفحص كتدبير غير مباشر من الجهازية الاكسدة

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

comet-assay-as-an-indirect-measure-of-systemic-oxidative-stress

Research

JoVE Journal

Biology

29.2K Views.  University of Basel.  يقيس الفحص المذنب فواصل DNA، الناجم عن عوامل مختلفة. إذا يتم الاحتفاظ جميع العوامل (باستثناء الاكسدة) مما تسبب في أضرار الحمض النووي المستمر، وكمية من الحمض النووي من التلف معلمة جيدة غير المباشرة من الاكسدة. والهدف من هذا البروتوكول هو استخ...

Video: Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

والفحص السلوكية لقياس الاستجابة للاسماك الزرد إلى التغيرات في شدة الضوء

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

الموقع محلية الصنع تطفير موجه من البلازميدات الجامعة

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of aerobic life. Molecular oxygen is essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many damaging reactions within living organisms. The combination of aerobic metabolism and iron, which is another vital compound for life, is enough to produce radicals through Fenton chemistry and degrade cellular components. DNA degradation is arguably the most damaging process involving intracellular radicals, as DNA repair is far from trivial. The assay presented in this article offers a quantitative technique to measure and visualize the effect of molecules and enzymes on radical-mediated DNA damage.
The DNA protection assay is a simple, quick, and robust tool for the in vitro characterization of the protective properties of proteins or chemicals. It involves exposing DNA to a damaging oxidative reaction and adding varying concentrations of the compound of interest. The reduction or increase of DNA damage as a function of compound concentration is then visualized using gel electrophoresis. In this article we demonstrate the technique of the DNA protection assay by measuring the protective properties of the DNA-binding protein from starved cells (Dps). Dps is a mini-ferritin that is utilized by more than 300 bacterial species to powerfully combat environmental stressors. Here we present the Dps purification protocol and the optimized assay conditions for evaluating DNA protection by Dps.

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

The DNA-binding protein from starved cells (Dps) plays a crucial role in combating bacterial stress. This article discusses the purification of E. coli Dps and the protocol for an in vitro assay demonstrating Dps-mediated protection of DNA from degradation by reactive oxygen species.

تطبيق على<em&gt; في المختبر</em&gt; الحمض النووي الفحص حماية لتصور الإجهاد خصائص الوساطة من البروتين DPS

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

تحليل الاكسدة في الزرد الأجنة

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

طريقة لتقييم الآثار المترتبة على مجموعة من موجات وشدة الأحمر / الأشعة تحت الحمراء القريبة العلاج بالضوء على الإجهاد التأكسدي<em&gt; في المختبر</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

قياس مقاومة الاكسدة من<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; في 96-جيدا لوحات عيار مكروي

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

المناعي غير المباشر على أقسام المجمدة من الماوس الغدة الثديية

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

في المختبر الفحص لقياس فسفاتيديل إيثانولامين ناقلة ميثيل آخر

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

في فيفو القلوية المذنب الفحص وأنزيم المعدلة القلوية المذنب الفحص لقياس فواصل حبلا الحمض النووي والحمض النووي الضرر التأكسدي في كبد الفئران

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to stress conditions, are implicated in various aspects of cell metabolism and survival. SGs modulate cellular signaling pathways, post-transcriptional gene expression, and stress response programs. The formation of these mRNA-containing granules is directly connected to cellular translation. SG assembly is triggered by inhibited translation initiation, and SG disassembly is promoted by translation activation or by inhibited translation elongation. This relationship is further highlighted by SG composition. Core SG components are stalled translation pre-initiation complexes, mRNA, and selected RNA-binding Proteins (RBPs). The purpose of SG assembly is to conserve cellular energy by sequestering translationally stalled housekeeping mRNAs, allowing for the enhanced translation of stress-responsive proteins. In addition to the core constituents, such as stalled translation preinitiation complexes, SGs contain a plethora of other proteins and signaling molecules. Defects in SG formation can impair cellular adaptation to stress and can thus promote cell death. SGs and similar RNA-containing granules have been linked to a number of human diseases, including neurodegenerative disorders and cancer, leading to the recent interest in classifying and defining RNA granule subtypes. This protocol describes assays to characterize and quantify mammalian SGs.

Stress Granules (SGs) are nonmembranous cytoplasmic structures that form in cells exposed to a variety of stresses. SGs contain mRNAs, RNA-binding proteins, small ribosomal subunits, translation-related factors, and various cell signaling proteins. This protocol describes a workflow that uses several experimental approaches to detect, characterize, and quantify bona fide SGs.

طرق لتصنيف البؤر السيتوبلازمية كما حبيبات الإجهاد الثدييات

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...