Wir möchten die LHW Stiftung zu danken, in Triesen Liechtenstein, für die finanzielle Unterstützung unserer Forschung auf oxidativen Stress.

Studien über Comet-Assay in der Universität Basel durchgeführt, Augenklinik wurden von der lokalen Ethikkommission genehmigt Basel 1. Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Vorbereitung Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (Ca ++, Mg ++ frei) Lösung durch Zugabe von PBS (1 L-Paket) und 990 ml dH 2 O zu den Medien. Den pH-Wert auf 7,4. Lagern bei RT. </li><li> Bereiten Lyselösung: So bereiten 1.000 ml hinzuzufügen 2,5 M NaCl (146,1 g), 100 mM EDTA (37,2 g) und 10 mM Trizma Base (1,2 g) in dH 2 O </li><li> Vorbereitung Elektrophoresepuffer (300 mM NaOH / 1 mM EDTA) durch Zugabe von 30 ml 10 M NaOH und 7,5 ml 0,2 M EDTA, qs bis 1.500 ml dH 2 O und gut mischen. Das Gesamtvolumen hängt von der Gelbox Kapazität. Vor der Verwendung wird Den pH des Puffers auf einen pH-Wert von&gt; 13 zu gewährleisten. </li><li> Vorbereitung Neutralisierungspuffer, enthaltend 0,4 M Tris (48,5 g zugegeben, um ~ 800 ml dH 2 O, Einstellen des pH auf 7,5), eingeengt (&amp; #62; 10 M HCl) in 1.000 ml mit dH 2 O Bewahren Sie die Lösung bei RT. </li><li> Bereiten Färbelösung. Um Ethidiumbromid (EtBr; 10x Lager, 20 ug / ml) in 10 mg EtBr in 50 ml dH 2 O und Speicher bei RT. Für 1x Lager - mischen 1 ml mit 9 ml dH 2 O VORSICHTIG! Griff EtBr mit ausreichender Vorsicht, da es ein bekanntes Karzinogen. </li></ol> 2. Isolierung von Leukozyten <ol><li> Erhalten Humanblutproben (20 ml) mit Anti-Koagulationsmittel, wie Heparin mittels Venenpunktion. </li><li> Trennen Sie die Lymphozyten mit einem Dichtegradienten Zellseparator wie Histopaque. <ol><li> Kurz, verdünnte Blut in Verhältnis 1: 1 mit PBS oder RPMI (ohne FBS) und die Schicht mehr als 600 &amp; mgr; l Zelltrennflüssigkeit. </li><li> Zentrifuge 1.800 xg für 20 min bei 4 ° C. Saugen Sie das &#39;Buffy&#39; Mantel in 3-5 ml PBS / RPMI und bei 300 g für 10 min zentrifugiert, um die Lymphozyten zu pelletieren. </li><li> Abrufen Lymphozyten von knapp über Grenze zwischen PBS (RPMI) Und Zelltrennflüssigkeit, mit einem Pipette. Entfernen Sie die Leukozyten-Bands aus der Schnittstelle zwischen Plasma und den Zellseparator Flüssigkeitsschichten von jedem Röhrchen sammeln und in einen 50-ml-Tube. </li></ol></li><li> Bringen Sie das Gesamtvolumen auf 50 ml mit kaltem Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM). Dreimal mit DMEM Waschen der Zellsuspension bei 300 × g für 10 min. </li><li> Zählen der Gesamtzahl von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers. Die Zellen in PBS und Aliquot in Mikrozentrifugenröhrchen auf 10 7 Zellen / Röhrchen. </li><li> Pipette 0,4 ml der Zellen in einem 5 ml-Einweg-Kunststoffrohr. In 1,2 ml 1% niedriger Temperaturen gelierender Agarose bei 40 ° C. Mischen und schnell und pipettieren 1,2 ml der Zellsuspension auf das Agarose-bedeckten Oberfläche einer vorbeschichteten Folie. Vermeiden Sie Blasen entstehen. </li><li> Ermöglichen die Agarose ca. 2 min gelieren. Im Einklang mit der Zeit und Temperatur zum Gelieren verwendet, und sicherzustellen, dass Agarose vollständig vor Eintauchen in Lyse-Lösung eingestellt. Nach voll set, tauchen in Lyse-Lösung bei ca. 4 ° C. </li></ol> 3. Lysis und Elektrophorese HINWEIS: Die beschriebene Vorgehensweise ist für die Elektrophorese unter pH&gt; 13 alkalischen Bedingungen. <ol><li> Nach mindestens 2 Stunden bei ca. 4 ° C, entfernen Sie vorsichtig Folien aus der Lyselösung. Die Objektträger nebeneinander auf der horizontalen Elektrophoresekammer nahe einem Ende, verschiebbar sie so nahe wie möglich beieinander. </li><li> Füllen Sie die Pufferbehälter mit frisch zubereiteten pH&gt; 13 Elektrophoresepuffer, bis der Flüssigkeitspegel die Folien vollständig (zu vermeiden, Blasen über die Agarose) abdeckt. </li><li> Lassen Folien sitzen im alkalischen Puffer für 20 min bis zum Abwickeln der DNA und die Expression von alkalilabilen Schäden. </li><li> Stromversorgung einschalten, um 25 Volt (~ 0,75 V / cm), und stellen Sie den Strom auf 300 mA durch Anheben oder Absenken der Pufferstufe. Elektrophorese der Objektträger für 30 Minuten. </li><li> Schalten Sie das Gerät. Heben Sie die Folien aus dem Puffer und pSpitze auf einem Auffangwanne. Tropfenweise Beschichtung der Folien mit Neutralisationspuffer. Lassen Sie die Objektträger für mindestens 5 min zu sitzen. Ablassen Rutschen und zwei weitere Male wiederholen. </li><li> Färben die Objektträger mit 80 ul 1x Ethidiumbromid (EtBr) und lassen Sie für 5 Minuten und dann tauchen in gekühltes destilliertes Wasser, um überschüssige Fleck zu entfernen. Dann legen Sie ein Deckglas über den Objektträger und sofort speichern. Shop gleitet für einen Monat bei Raumtemperatur in trockener Umgebung. Hinweis: andere DNA Flecken (zB SYBR-Grün), können ebenfalls verwendet werden. Achtung! Schutzhandschuhe tragen, da die meisten Farbstoffe sind mutagen. </li></ol> 4. Quantifizierung der DNA-Brüche <ol><li> Um die DNA-Schäden zu visualisieren, beobachten die EtBr-gefärbten DNA Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop 40X-Objektiv. </li><li> DNA-Schädigung zu beurteilen quantitativ in den Zellen durch Messen der Länge der DNA-Migration und der Prozentsatz der migrierten DNA (1A). DNA-Schäden zu quantifizieren (1B) von der Schwanz Moment und Olive-moment. Definitionen von Schwanz-Moment und Olive -Moment eine effektvolle wurden bislang 8-10 gegeben. HINWEIS: Nach unserer Erfahrung ist es genug, um von einer der Parameter bleiben. Die Zellen werden durch Setzen des automatisiertes Tool, das über dem Objektträger und Fotografien Zellen scannt fotografiert. Die Quantifizierung der DNA-Brüche können durch Bildanalyse-Software-Pakete durchgeführt werden. Es gibt mehrere verschiedene Softwarepakete, die nach Maß sind, um das Bild der Zellen zu erfassen und zu quantifizieren, DNA-Schäden. Wir empfehlen, mit der gleichen Software-Paket während des Experiments. Die Labor-Techniker identifiziert der intakten Zelle oder Kometen auf dem Computer erzielt werden, und klickt mit der Maus auf sie. Der Komet oder intakte Zelle wird dann automatisch erzielt. </li></ol>

<ol>
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Schwedische Wissenschaftler Ostling und Johanson als erste in ihrem Bereich zu Comet-Assay verwenden, um DNA-Schäden in Zellen 1 zu quantifizieren. Die neutralen Bedingungen, dass die beiden Wissenschaftler nutzten jedoch nur erlaubt den Nachweis von doppelsträngigen DNA-Brüche. Singh et al. Später angepasst den Test für den Einsatz unter alkalischen Bedingungen, die eine empfindliche Version, die Doppel- und Einzelstrang-DNA-Brüche zu bewerten und erkennen alkalilabile Websites 12 könnte hergestellt. Seit der ersten Entwicklung hat der Assay bei verschiedenen Schritten verändert wurde, um für die Bewertung Arten von DNA-Schädigung in verschiedenen Zelltypen 13-15 geeignet zu machen. Wie bei allen Techniken ist wichtig, zahlen viel Liebe zum technischen Details, um genaue Ergebnisse zu erhalten 16. Basierend auf unserer Erfahrung, die besten Ergebnisse erhalten werden, wenn jeder Verfahrensschritt-Lösung von der Vorbereitung bis zur Kometen-Quantifizierung von Experten Labor techn geführticians. Die Verwendung von frischen und richtig vorbereitet Medien, angemessene Pipettiertechniken, exaktes Timing und (wie zuvor im Ergebnisteil erwähnt) die Verwendung von frisch zubereiteten Leukozyten sind von wesentlicher Bedeutung, um für die Lyse und Gelelektrophorese, um genaue Ergebnisse zu erhalten 17. All die einzelnen Schritte in diesem Test sind für den Erhalt zuverlässige Ergebnisse ebenso wichtig. 16 In der Regel die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn jeder einzelne Verfahrensschritt aus der Lösung Vorbereitung bis Kometen Quantifizierung wird von Experten Labor technicians.Important geführt scheint die Verwendung von frischen und richtig vorbereitet Medien , angemessene Pipettiertechniken, exaktes Timing und wie bereits im Ergebnisteil der Einsatz von frisch zubereiteten Leukozyten für die Lyse und Gelelektrophorese, angemessene Ergebnisse aus dem Test 17 ​​zu erhalten bezeichnet. Wie andere Methoden, hat die Comet-Assay-Technik seine ADVANteile und Nachteile. Als eine empfindliche Methode ist der Test anfällig für Faktoren (zB UV-Licht), die DNA-Brüche ergänzen und beeinflussen so Ergebnisse könnten. Jeder Faktor, erhöhen kann oxidativer Stress, außer der, die erforscht wird, sollte vermieden werden. Stressoren können Niveau von oxidativem Stress nicht nur in Leukozyten, sondern auch in allen anderen Blut Medien und Lymphozyten zu erhöhen. Wie bereits erwähnt gibt es viele verschiedene und direktere Methoden zur Messung der oxidativen Stress 18,19. Comet-Assay ist einer der vielen Methoden, die bestimmte Vorteile hat. Dazu gehören ihre relativ geringen Kosten, der geringen Anzahl von Zellen erforderlich ist (&lt;10.000 Zellen) und damit die kleine Proben von Blut pro Patient benötigt, die relativ kurze Zeitdauer erforderlich ist, um DNA-Schäden in Zellen (etwa 3 Tage) zu quantifizieren, dessen Empfindlichkeit und seine weit verbreitete Anwendbarkeit auf Eseln DNA-Schäden in verschiedenen Zelltypen. In der Vergangenheit wählen wir mit Leukozyten zu arbeiten, da wir hatten Erfahrung mit diesemZelltyp und es war zutreffend für den jeweiligen geplanten Studie. Ein weiterer Vorteil der Comet-Assay ist, dass es verwendet werden kann, um verschiedene Arten und Mengen an DNA-Schäden zu erkennen und kann somit in verschiedenen anderen Bereichen des Studiums neben oxidativen Stress, wie DNA-Reparatur Studien Supplementierung Versuche oder Genotoxizität Studien angewendet werden. Oxidativer Stress gilt heute als spielen eine kritische Rolle bei der Pathogenese mehrerer Krankheiten erkannt. Comet-Assay-Methode, wobei eine von vielen Möglichkeiten der Messung von oxidativem Stress 18,19, ist relativ einfach, vielseitig und kostengünstig. Wenn beherrscht, kann dieses Verfahren in allen Bereichen der Medizin, bei denen oxidativer Stress eine Rolle spielt 8-10,20,21 verwendet werden.

Comet Assay wurde zuerst von schwedischen Wissenschaftlern Ostling und Johanson 1 entwickelt. DNA ist ein negativ geladenes Molekül. Während der Elektrophorese, kleiner, beschädigte DNA-Fragmente zu reisen schneller zu einer positiv geladenen Anode 2. Je kleiner die DNA-Fragmente, desto schneller wird die Migration in Richtung der Anode eine typische &quot;Komet&quot; mit einem &quot;Kopf&quot; von intakten, unbeschädigte DNA und einem &quot;Schwanz&quot; der beschädigten DNA-Fragmente 3 zusammengesetzt, um zu bilden. Beschädigte DNA kann durch verschiedene Mechanismen im Körper 4, der die Erzeugung von DNA-Brüchen relativ ausgewogen 5 halten repariert werden. Wenn jedoch das Gleichgewicht zugunsten der DNA Pausen können die Brüche ansammeln und wird schließlich zu der Entwicklung einer Krankheit beitragen. Unsere DNA leidet etwa 0.000165% Schädigung zu einer gegebenen Zeit 6. Einzelsträngige DNA-Brüche beziehen sich auf einen Defekt an einem der beiden Stränge der DNA-Doppelhelixwohingegen doppelsträngige DNA-Brüche verursacht werden, wenn beide Stränge der DNA-Doppelhelix beschädigt sind. Es gibt verschiedene Faktoren, die die Menge an DNA-Brüche zu einem gegebenen Zeitpunkt wie das Alter der Zelle, Zigarettenrauch, verschiedene Medikamente oder oxidativen Stress 7-9 erhöhen kann. Wenn alle Faktoren, die zu einer verbesserten DNA-Brüche konstant gehalten werden, dann wird die Quantifizierung von DNA-Brüchen mittels Comet-Assay ist eine gute indirekte Parameter des oxidativen Stresses. Das Verfahren zur Comet-Assay wird heute zunehmend in der Medizin einschließlich der Augenheilkunde eingesetzt. Ein Grund dafür ist, dass oxidativer Stress mehr als Pathomechanismus für verschiedene Krankheiten, 8-11 und Comet-Assay erfasst ist eine Methode, mit der oxidativen Stress indirekt quantifiziert werden kann.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>(CPW59)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium EDTA</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(RM1370)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>(E-8751)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>(1077-1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(TS1006)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Ranbaxy Rankem</td>
			<td>(S0160)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>BDH-Merck</td>
			<td>(89021)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(RM 845)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Spectrochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials required for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Melting Agarose (NMA)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(RM273)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melting Point Agarose (LMPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>(A9414)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol - Qualigens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm)</td>
			<td>Blue Star</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>(500010)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettor and Tips</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comet assay as an indirect measure of systemic oxidative stress

Höheren eukaryotischen Organismen nicht ohne Sauerstoff leben; Paradoxerweise kann Sauerstoff für sie schädlich sein. Das Sauerstoffmolekül chemisch relativ inert, weil es zwei ungepaarten Elektronen in verschiedenen pi * Anti-Bindungsorbitalen entfernt. Diese beiden Elektronen parallel Spins, das heißt sie in der gleichen Richtung um ihre eigenen Achsen drehen. Deshalb ist die Sauerstoffmoleküls ist nicht sehr reaktiv. Aktivierung von Sauerstoff kann durch zwei verschiedene Mechanismen auftreten; entweder durch Reduktion über ein Elektron zu einem Zeitpunkt (monovalent Reduktion) oder durch die Absorption von genügend Energie, um den Spin eines der ungepaarten Elektronen umzukehren. Dies resultiert in der Produktion von reaktiven oxidativen Spezies (ROS). Es gibt eine Reihe von Möglichkeiten, wie der menschliche Körper eliminiert ROS in seinen physiologischen Zustand. Wenn ROS-Produktion übersteigt die Reparaturkapazität, oxidativer Stress Ergebnisse und Schäden unterschiedlichen Molekülen. Es gibt viele verschiedene Methoden, mit denen oxidativer Stress kann mich seingesicherter. Diese Handschrift konzentriert sich auf eine der Methoden namens Zell Gelelektrophorese, die auch als &quot;Comet Assay&quot;, die Messung der DNA-Brüche ermöglicht bekannt. Wenn alle Faktoren bekannt, DNA-Schädigung, ausgenommen oxidativen Stress verursachen konstant gehalten werden, die Menge an DNA-Schädigung durch Comet-Assay gemessen wird, ein guter Parameter für oxidativen Stress. Das Prinzip ist einfach und beruht auf der Tatsache, dass DNA-Moleküle, sind negativ geladen. Ein intakter DNA-Molekül hat eine so große Größe, die nicht während der Elektrophorese nicht migrieren. DNA-Brüche, jedoch falls vorhanden führen zu kleineren Fragmenten, die im elektrischen Feld zur Anode hin bewegen. Kleinere Fragmente wandern schneller. Die Fragmente unterschiedliche Größen für das Ergebnis der Elektrophorese ist keine klare Linie, sondern ein Kontinuum mit der Form eines Kometen. Das System ermöglicht eine Quantifizierung der resultierenden &quot;Komet&quot; und damit der DNA-Brüche in der Zelle.

Obwohl das Verfahren der Comet-Assay macht reproduzierbare Ergebnisse, kann es durch eine Vielzahl von Faktoren beeinflusst werden. Ein solcher Faktor ist, ob die Leukozyten vor der Lyse und Gelelektrophorese oder ob dieser Schritt auf frisch hergestellten Leukozyten geführt kryokonserviert. 2 zeigt, dass in der Gruppe 2, wobei Leukozyten wurden vor der Lyse und Gelelektrophorese ss- DNA kryokonserviert Pausen waren signifikant höher als in Gruppe 1, wo die Lyse und Gel -electrophoresis wurde auf frisch zubereitete Zellen durchgeführt. Der Assay kann auch verwendet werden, um indirekt zu beurteilen systemischen oxidativen Stress. Tabelle 1 zeigt die deskriptiven Statistiken für Schwanz Moment und Oliven Moment bei Rauchern und gesunden Probanden. Die Daten zeigen, dass das Rauchen eine halbe Packung Zigaretten täglich mehr als verdoppelt ssDNA Brüche in den zirkulierenden Leukozyten 9. <img alt="1A" src= &quot;/ Files / ftp_upload / 52763 / 52763fig1A.jpg&quot; /&gt; <img alt="1B" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig1B.jpg" /> Abbildung 1 (a) zeigt das Mikroskop während der Comet-Assay-Analyse verwendet. (B) Δ zeigt eine typische &quot;Komet&quot; mit einem hellen Kopf und Schwanz (beschädigt kleiner DNA-Fragmente). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52763/52763fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig2.jpg" /> Abbildung 2. ssDNA Pausen waren signifikant höher als Leukozyten wurden (Gruppe 2) kryokonserviert als frisch hergestellt Leukozyten wurden vor der Lyse und Gelelektrophorese verwendet. <imgalt = &quot;Tabelle 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52763 / 52763table1.jpg&quot; /&gt; Tabelle 1. Raucher hatten mehr als die doppelte Anzahl von ssDNA bricht im Vergleich zu Alter und Geschlecht gesunden Nichtrauchern.

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Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Comet Assay misst DNA-Brüche, durch verschiedene Faktoren hervorgerufen. Wenn alle Faktoren (außer oxidativer Stress) DNA-schädigenden konstant gehalten werden, die Menge an DNA-Schädigung ist eine gute indirekte Parameter von oxidativem Stress. Das Ziel des Protokolls ist es, Comet-Assay zur indirekten Messung von oxidativem Stress zu verwenden.

Comet Assay als ein indirektes Maß für Systemische Oxidativer Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

comet-assay-as-an-indirect-measure-of-systemic-oxidative-stress

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

29.2K Aufrufe.  University of Basel.  Comet Assay misst DNA-Brüche, durch verschiedene Faktoren hervorgerufen. Wenn alle Faktoren (außer oxidativer Stress) DNA-schädigenden konstant gehalten werden, die Menge an DNA-Schädigung ist eine gute indirekte Parameter von oxidativem Stress. Das Ziel des Protokolls ist es, Comet-Assay zur indirekten Messung von oxidativem Stress zu verwenden. 

Serie: Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

A Behavioral Assay, um die Reaktionsfähigkeit der Zebrafisch zu Änderungen in Lichtintensitäten messen

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Forschung

Biologie

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Hausgemachte Mutagenese von Whole Plasmide

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of aerobic life. Molecular oxygen is essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many damaging reactions within living organisms. The combination of aerobic metabolism and iron, which is another vital compound for life, is enough to produce radicals through Fenton chemistry and degrade cellular components. DNA degradation is arguably the most damaging process involving intracellular radicals, as DNA repair is far from trivial. The assay presented in this article offers a quantitative technique to measure and visualize the effect of molecules and enzymes on radical-mediated DNA damage.
The DNA protection assay is a simple, quick, and robust tool for the in vitro characterization of the protective properties of proteins or chemicals. It involves exposing DNA to a damaging oxidative reaction and adding varying concentrations of the compound of interest. The reduction or increase of DNA damage as a function of compound concentration is then visualized using gel electrophoresis. In this article we demonstrate the technique of the DNA protection assay by measuring the protective properties of the DNA-binding protein from starved cells (Dps). Dps is a mini-ferritin that is utilized by more than 300 bacterial species to powerfully combat environmental stressors. Here we present the Dps purification protocol and the optimized assay conditions for evaluating DNA protection by Dps.

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

The DNA-binding protein from starved cells (Dps) plays a crucial role in combating bacterial stress. This article discusses the purification of E. coli Dps and the protocol for an in vitro assay demonstrating Dps-mediated protection of DNA from degradation by reactive oxygen species.

Anwendung eines<em&gt; In-vitro-</em&gt; DNA-Schutz-Assay, um Stress Mediation Eigenschaften des DPS-Protein Visualisieren

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Analyse von oxidativem Stress in Zebrafischembryonen

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Verfahren zur Beurteilung der Auswirkungen einer Reihe von Wellenlängen und Intensitäten von Rot / Nah-Infrarot-Licht-Therapie auf oxidativen Stress<em&gt; In-vitro-</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Mess Oxidativer Stress Widerstandsrat<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In 96-Well-Mikrotiterplatten

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

Die indirekte Immunfluoreszenz auf Gefrierschnitte von Mäusemilchdrüse

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

In vitro-Test an Phosphatidylethanolamin Methyltransferase-Aktivität zu messen

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

In - vivo - Alkaline Comet Assay und enzymmodifizierten Alkaline Comet Assay zur Messung von DNA - Strangbrüchen und oxidative DNA - Schäden in der Rattenleber

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to stress conditions, are implicated in various aspects of cell metabolism and survival. SGs modulate cellular signaling pathways, post-transcriptional gene expression, and stress response programs. The formation of these mRNA-containing granules is directly connected to cellular translation. SG assembly is triggered by inhibited translation initiation, and SG disassembly is promoted by translation activation or by inhibited translation elongation. This relationship is further highlighted by SG composition. Core SG components are stalled translation pre-initiation complexes, mRNA, and selected RNA-binding Proteins (RBPs). The purpose of SG assembly is to conserve cellular energy by sequestering translationally stalled housekeeping mRNAs, allowing for the enhanced translation of stress-responsive proteins. In addition to the core constituents, such as stalled translation preinitiation complexes, SGs contain a plethora of other proteins and signaling molecules. Defects in SG formation can impair cellular adaptation to stress and can thus promote cell death. SGs and similar RNA-containing granules have been linked to a number of human diseases, including neurodegenerative disorders and cancer, leading to the recent interest in classifying and defining RNA granule subtypes. This protocol describes assays to characterize and quantify mammalian SGs.

Stress Granules (SGs) are nonmembranous cytoplasmic structures that form in cells exposed to a variety of stresses. SGs contain mRNAs, RNA-binding proteins, small ribosomal subunits, translation-related factors, and various cell signaling proteins. This protocol describes a workflow that uses several experimental approaches to detect, characterize, and quantify bona fide SGs.

Methoden zur Klassifizierung von zytoplasmatischen Foci als Säugetier-Stressgranulat

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...