حزب العمال التقدمي هو باحث مشارك في مركز أبحاث الصحة سانفورد للطفولة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المنح التالية لحزب العمال التقدمي: R01AR056712، R01AR052779 وP30 AR061303 من المعهد الوطني للصحة / المعهد الوطني لالتهاب المفاصل والعضلات والعظام والأمراض الجلدية (NIAMS)، نجمة داود الحمراء وسانفورد الأطفال جائزة بحوث الصحية. وقد استفاد هذا العمل جزئيا من تمويل البحوث من البرنامج الإطاري السابع للجماعة الأوروبية في المشروع FP7 الصحة 2009 - ENDOSTEM 241440 (تفعيل الأوعية الدموية الخلايا الجذعية المرتبطة والخلايا الجذعية العضلية لإصلاح وصيانة الأنسجة العضلية) وأيد SA كتبها. CIRM الزمالة.

1. العدوى من hESCs هذا البروتوكول يتطلب عالية lentiviruses عيار ترميز BAF60C وMyoD 13. تتوفر هذه التركيبات عند الطلب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيات قبل البدء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل ضمان الكفاءة العالية للعدوى، hESCs لوحة للعدوى في ظروف خالية من وحدة التغذية (الشكل 2A) للقضاء على المنافسين الخلوية خلال امتصاص الفيروسية. في الواقع، MEFs هي أسهل المعروف أن تصيب بالمقارنة مع hESCs والمختصة لتحويل بوساطة MyoD. وبالتالي، والقضاء على MEFs من ثقافات HESC يزيد من معدل الإصابة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فمن المستحسن أن يكون lentiviruses عيار عالية لضمان الكفاءة العالية للعدوى. وتناقش الخيارات لتحسين كفاءة العدوى في قسم &quot;التحقق من العدوى&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحات المغلفة matrigel بإضافة 1 مل من 1 ملغ / مل Matrigel في كل بئر وترك ما لا يقل عن 1 ساعة على RT (أو O / N مختومة في 4 درجات مئويةإذا أعدت قبل يوم واحد). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإجراء العدوى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يوم من العدوى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حس الخليوي الاستنساخ والملحق الانتعاش في المتوسط ​​في 1000 X التخفيف (2 ملي تركيز النهائي). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم 0 - العدوى مع BAF60C ملاحظة: تنفيذ إصابة hESCs مع BAF60C أولا تليها العدوى مع MyoD. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل بئر من لوحة 6 جيدا من hESCs كما نمت المستعمرات 14 في تعليق خلية واحدة من قبل الحضانة مع 1 مل من TrypLE لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل التعليق إلى أنبوب 15 مل، إضافة 9 مل من HESC المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1،200 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء الطرد المركزي، وإعداد مزيج العدوى في أنبوب نظيفة بإضافة إلى 1 مل من mTeSR1، polybrene (6 ملغ / مل) و [هس] خلية الاستنساخ والاسترداد الملحق (2 ملم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه الخلية (حوالي 5 × 10 5 -1 × 10 6 خلايا من واحد جكذلك onfluent من hESCs) مع 1 مل من مزيج من العدوى وعلى طبق من ذهب لوحة مرفق 6 جيدا منخفضة، مما يمنع الخلايا من التمسك البلاستيك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة BAF60C-IRES-GFP الفيروس في 10 8 وزارة الداخلية واحتضان 3 ساعة في الحاضنة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع التعليق الخلية التي تحتوي على فيروسات وتقسيم بالتساوي في بئرين المغلفة matrigel. ثم يضاف 2 مل من mTeSR1 + حس الخليوي الاستنساخ والاسترداد الملحق إلى كل بئر وترك O / N في الحاضنة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية المتوسطة التي تحتوي على الفيروس واستبدالها مع 2 مل من mTeSR1and حس الخليوي الاستنساخ والملحق الاسترداد. الخلايا ستبدأ التثاقل كما هو مبين في الشكل 2B. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Day2 - العدوى مع MyoD <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل المتابعة التحقق من حالة مضان من الخلايا تحت المجهر مضان للتأكد من الحصول على كفاءة عالية من العدوى. إذا لم يكن كذلك، راجع قسم &quot;التحقق تصيبأيون &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا وصلت إلى خلايا لا يقل عن 80٪ من التقاء، والمضي قدما على النحو التالي؛ إلا الانتظار ليوم إضافي قبل المتابعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة وإضافة 1 مل من كاشف TrypLE لفصل الخلايا. احتضان 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما كرر from1.2.2.2 صفه - مضيفا 1.2.2.6 فيروس MyoD في 10 8 وزارة الداخلية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية المتوسطة التي تحتوي على الفيروس واستبدالها مع 2 مل من mTeSR1and حس الخليوي الاستنساخ والملحق الاسترداد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MEFs على لوحة matrigel المغلفة لوحات في 2.5 × 10 5 / سم 2 لليوم التالي للسماح للإكثار من الخلايا المصابة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم 4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة وإضافة 1 مل من كاشف TrypLE لفصل الخلايا. احتضان 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا في أنبوب 15 مل الصقر، إضافة 9 مل من HESC المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1،200 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Remove طاف واعادة تعليق في 6 مل من HESC المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة من MEFs التي تحتوي على لوحة 6 جيدا وhESCs وحة في 01:02 نسبة الانقسام، والاستغناء 3 مل لكل MEFs المحتوية جيدا. تلميح! عندما تصل المستعمرات التقاء، وبعض من الآبار الخلايا MyoD/BAF60C-infected يمكن تجميد في النيتروجين السائل بمثابة مخزون احتياطي. ويشمل تجميد المتوسطة 90٪ من KOSR و 10٪ DMSO زائد 2 ملي حس الخليوي الاستنساخ والملحق الاسترداد. الآبار المتبقية يمكن ثم تتعرض لبروتوكول التمايز - انظر أدناه لوصف. إذا كانت هناك حاجة أكثر من الخلايا لانتاج المزيد من myospheres، hESCs المصابة يمكن نشر كما يلي: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة واحتضان مع 1 مل من 1 ملغ / مل كولاجيناز الرابع لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة كولاجيناز الرابع وإضافة 1 مل من HESC المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر تشريح كشط المستعمرات مع طرف 10 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع قطع من كولونيوفاق في أنبوب 15 مل، والسماح لالرواسب لمدة 3 دقائق. ثم إزالة طاف، resuspend في HESC المتوسطة وعلى لوحة MEFs لوحات باستخدام نسبة 01:04. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص العدوى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين نشر الخلايا، فمن المستحسن لوحة الخلايا المصابة في نطاق أصغر لموسم الحصاد لتحليل الحمض النووي الريبي وإجراء تحليل التعبير البروتين المناعي من أجل التحقق من المؤشرات الحيوية التي تعكس الوضع البيولوجي الصحيح في كل مرحلة (انظر نتائج الممثل). لlentiviruses عيار عالية ينبغي أن تكون النسبة المئوية للخلايا المصابة المتوقع لا يقل عن 80٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لضمان الكفاءة العالية، وناقلات lentiviral يمكن تعديلها، وإدخال علامة اختيار الفلورسنت و / أو المقاومة للمضادات الحيوية. لدينا البلازميد lentiviral معربا عن BAF60C أيضا يحمل GFP مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفرز hESCs لعلامة فلوري. في حالة انخفاض كفاءة عدوى فمن المستحسن استخدام مضان لخلايا ctivated الفرز (FACS-الفرز) لتخصيب الخلايا معربا عن فيروس BAF60C ثم تصيب الخلايا مع عيار عالية فيروس MyoD. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حس الخليوي الاستنساخ والملحق الانتعاش في المتوسط ​​في اليوم قبل الفرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم الفرز، فصل الخلايا عن طريق TrypLE (كما هو موضح في اليوم 0) وresuspend الخلايا في KO استبدال المصل بالإضافة إلى حس الخليوي الاستنساخ والاسترداد الملحق في نظام مراقبة الأصول الميدانية أنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية الفرز، وجمع الخلايا في KO استبدال المصل وعلى لوحة MEFs لوحات مضيفا حس الخليوي الاستنساخ والملحق الاسترداد. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. EB-مثل الحث والتمايز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستقراء والتمايز الداخلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم 0 - EB الحث <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد، قبل بدء التمايز من BAF60C/Myod-infected hESCs، لديك عدد كبير من المستعمرات في البئر (الشكل 2C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل ص جيداemove المتوسط، ويغسل مع برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من 1 ملغ / مل كولاجيناز الرابع. احتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة كولاجيناز وإضافة 1 مل من EB المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر تشريح بسرعة فصل ميكانيكيا المستعمرات إلى 400-800 المجاميع الخلية عن طريق كشط مع طرف 10 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع قطع من المستعمرات في أنبوب 15 مل، والسماح لالرواسب لمدة 3 دقائق. إزالة طاف، وإعادة تعليق في 3 مل من EB المتوسطة ونقل تعليق خلية لبئر واحدة من أدنى مستوى 6 جيدا لوحة المرفق. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من حجم المستعمرات وموت الخلايا قبل المتابعة. إذا قطع كبيرة موجودة، وكسر لهم من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا مع ماصة 5 مل، 3-4 مرات. إذا كان موت الخلايا عالية جدا (العديد من الخلايا العائمة والحطام) استبدال المتوسطة من خلال جمع المجاميع في أنبوب 15 مل عن طريق الجاذبية وطبق عليهم مع 3 مل من الطازجة المتوسطة EB، والمضي قدما على خلاف ذلك على النحو التالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1.5مل من الطازجة المتوسطة EB في الآبار </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير المتوسطة من خلال جمع المجاميع من الآبار في أنبوب 15 مل. السماح لهم يستقر لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف، مع استبدال 3 مل من الطازجة المتوسطة EB وتوزيع على نفس الآبار. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1.5 مل من الطازجة المتوسطة EB في الآبار. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم 4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المضي قدما كما هو موضح في &quot;يوم 2&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم 5 - التفريق عضلي من EB-مثل مجموعات (الشكل 2D). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الركام كما هو موضح في 2.1.3.1 ويغسل مرة واحدة مع 2 مل من برنامج تلفزيوني؛ السماح للمجمعة لالرواسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 3 مل من DM المتوسطة؛ لوحة على نفس الآبار. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم 6 - 20 يوم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من D6 لD20 استبدال المتوسطة مع المتوسطة الطازجة كل 3 أيام. وتظهر myospheres ممثل في Figure 2E. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق myosphere التمايز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل المضي قدما، فمن المستحسن للتحقق من كفاءة التمايز عضلي داخل myospheres بجعل أقسام myospheres جزءا لا يتجزأ من أكتوبر المركب، كما هو موضح في البروتوكول إن الرب السابق 12. إجراء تلطيخ المناعي للعلامات عضلي مثل myognenin (F5D استنساخ، DSHB) والميوسين السلسلة الثقيلة (MF20 استنساخ، DSHB) (انظر نتائج الممثل). تلميح! لتكون ناجحة مع تلطيخ لmyogenin على أقسام EB فمن الأهمية بمكان لأداء استرجاع مستضد عن طريق العلاج مع كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) 0.5٪ لمدة 5 دقائق. بالإضافة إلى ذلك، فمن الممكن استخدام هذا البروتوكول لتلطيخ مزدوجة باستخدام F5D وMF20 الأجسام المضادة. </li></ol></li></ol> 3. وصفات وسائل الإعلام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ESC المتوسطة DMEM-F12 1 ملي L-الجلوتامين 20٪ خروج المغلوب سرأم استبدال المتوسطة (KOSR) 0.1 ملم الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) 50 U / مل البنسلين / الستربتوميسين (القلم / بكتيريا) 0.1 ملي بيتا المركابتويثانول 8 نانوغرام / مل الأساسية عامل نمو الخلايا الليفية (bFGF) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EB المتوسطة DMEM F12 1 ملي L-الجلوتامين 15٪ FBS 5٪ مصل الحصان </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DM المتوسطة DMEF F12 الملحق 1X ITS السائل وسائل الإعلام 1X N-2 الملحق </li></ol>

<ol>
	<li>Darabi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+skeletal+muscle+regeneration+from+differentiating+embryonic+stem+cells.">Functional skeletal muscle regeneration from differentiating embryonic stem cells.</a> Nat Med. 14, 134-143 (2008).</li><li>Darabi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ES-+and+iPS-derived+myogenic+progenitors+restore+DYSTROPHIN+and+improve+contractility+upon+transplantation+in+dystrophic+mice.">Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice.</a> Cell Stem Cell. 10, 610-619 (2012).</li><li>Iacovino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+cassette+exchange:+a+rapid+and+efficient+system+enabling+conditional+gene+expression+in+embryonic+stem+and+primary+cells.">Inducible cassette exchange: a rapid and efficient system enabling conditional gene expression in embryonic stem and primary cells.</a> Stem Cells. 29, 1580-1588 (2011).</li><li>Barberi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+engraftable+skeletal+myoblasts+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of engraftable skeletal myoblasts from human embryonic stem cells.</a> Nat Med. 13, 642-648 (2007).</li><li>Goudenege, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoblasts+derived+from+normal+hESCs+and+dystrophic+hiPSCs+efficiently+fuse+with+existing+muscle+fibers+following+transplantation.">Myoblasts derived from normal hESCs and dystrophic hiPSCs efficiently fuse with existing muscle fibers following transplantation.</a> Mol Ther. 11, 2153-2167 (2012).</li><li>Forcales, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal-dependent+incorporation+of+MyoD-BAF60c+into+Brg1-based+SWI/SNF+chromatin-remodelling+complex.">Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex.</a> Embo J. 31, 301-316 (2012).</li><li>Albini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+of+human+embryonic+stem+cells+into+skeletal+muscle+cells+and+generation+of+contractile+myospheres.">Epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells into skeletal muscle cells and generation of contractile myospheres.</a> Cell Rep. 3, 661-670 (2013).</li><li>Weintraub, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+muscle-specific+genes+in+pigment,+nerve,+fat,+liver,+and+fibroblast+cell+lines+by+forced+expression+of+MyoD.">Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 5434-5438 (1989).</li><li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD1:+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+Myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts.">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242, 405-411 (1988).</li><li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts.">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51, 987-1000 (1987).</li><li>Ho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+embryonic+stem+cell+chromatin+remodeling+complex,+esBAF,+is+essential+for+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+pluripotency.">An embryonic stem cell chromatin remodeling complex, esBAF, is essential for embryonic stem cell self-renewal and pluripotency.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 5181-5186 (2009).</li><li>Gomes, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pluripotent+stem+cells+by+using+cryosections+of+embryoid+bodies.">Analysis of pluripotent stem cells by using cryosections of embryoid bodies.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li><li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+lentiviral+vectors.">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).</li><li>Barcova, M., Campa, V. M., Mercola, M., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. L., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell+cardiogenesis.">Human embryonic stem cell cardiogenesis.</a> Human Stem Cell Manual: a Laboratory Guide. , 227-237 (2007).</li><li>Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+enhancers+in+skeletal+muscle:+the+role+of+MyoD1.">Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1.</a> Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

يصف البروتوكول المقترح هنا كيفية توليد مجموعات ثلاثية الأبعاد من myofibers مقلص (myospheres) مباشرة من hESCs. الاستراتيجية المقترحة لديه القدرة غير مسبوقة وغير عادية لإنتاج عضلات صغيرة في التعليق الذي يمكن أن تكون مناسبة بأنه &quot;مرض في طبق&quot; نموذج لكلا المقايسات فحص والدراسات التنموية. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة لتوليد myospheres من hESCs واضحة ولا تحتاج إلى أي خطوة الفرز FACS خلال التمايز، والتي عادة ما لديها تأثير سلبي على العائد من الخلايا استردادها. الى جانب ذلك، فإن إجراء الفرز خلال التمايز تتداخل مع تجميع لأنه ينطوي على التفكك من EB إلى الخلايا واحد. ويستند الطريقة المقترحة على reprograming جينية من hESCs مع عوامل محددة، MyoD وBaAF60C، والتي لا يتم التعبير عنها في الخلايا الجذعية الجنينية المحفزة. MyoD وBAF60C توفير &quot;الأساسية&quot; بروتين ال معقدةفي مواضع علامات الجيني الذي النسخ العائدات لتنشيط البرنامج عضلي الهيكل العظمي. يتم تسليم اثنين من العوامل إلى الخلايا عن طريق العدوى lentiviral وبالتالي فمن الأهمية بمكان الحصول على كفاءة عالية من إصابة كل من العوامل في جميع الخلايا. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق استخدام فيروسات عيار عالية أو الفيروسات هبوا علامات التحديد. شروط الثقافة أيضا تلعب دورا هاما في تحسين مدى تمايز عضلي. نقترح بروتوكول التمايز القائم على مصل للتمايز MyoD/BAF60C معربا عن hESCs في مجموعات السلائف عضلي، تليها حضانة في المصل خالية المتوسطة تحديدا (التي تحتوي على الانسولين ترانسفيرين - ITS) لتحقيق تحويل السلائف عضلي في myotubes الهيكل العظمي. ومع ذلك، فمن الممكن أن وسائل الإعلام تحديدا أخرى يمكن تحقيق التمايز عضلي مساوية أو أفضل. واحد الحد الحالي للبروتوكول هو أنه يعتمد على استخدام مصل بقري جنيني، والتي، إلى جانب احتواءالعديد من البروتينات الحيوانية والمواد جي، ويظهر الكثير إلى الكثير من الاختلافات. وهذا قد يؤدي إلى انخفاض كفاءة أو عدم تجانس تحويل عضلي داخل myospheres. من المذكرة، وليس كل الهياكل EB-مثل المستمدة من BAF60/MyoD-expressing hESCs هي myospheres؛ وهي، وبعضها EB-مثل الركام يتكون بالكامل من myofibers. عدد myospheres المستمدة عادة من hESCs معربا عن BAF60C وMyoD يمكن أن تختلف 30-60٪ حسب تقديرات المناعية على المقاطع EB أجريت في نهاية البروتوكول (انظر نتائج). ومن شأن النهج المحتملة لإثراء الثقافة طبق لmyospheres فقط يكون لاستخدام مراسل عضلي. وهذا من شأنه تسهيل التخلص من الكتل EB-متباينة مثل جزئيا أو لا، واختيار فقط myospheres. أخيرا، فإن فهم أفضل للآليات التي تقوم عليها الاشتراطات الزمنية من العوامل أدخلت تكون مفيدة لتحسين طريقة التسليم. على سبيل المثال، إذا كان هناك حاجة BAF60C وMyoD فقط لركلات الترجيحالوقت أورط الى &quot;ركلة&quot; الخلايا في الاتجاه الصحيح، يمكن أن تطبق على أساس أساليب تعديل تسليم مرنا. على النقيض من ذلك، إذا كانت هناك حاجة العوامل لفترة أطول قبل الخلايا استغلال البروتينات الخاصة بهم الذاتية، وهو نهج episomal سوف أوصى للقضاء على التباين والآثار غير المنضبط بسبب الاندماج في الجينوم. أخيرا، نلاحظ أنه إلزامي للتعبير عن BAF60C قبل أو في نفس الوقت الذي MyoD (أبدا بعد) من أجل تحقيق تحويل HESC في العضلات والهيكل العظمي. شرط للتعبير مسبقة من المفترض BAF60C يعتمد على دورها في وضع ما قبل المشهد جينية للتوزيع MyoD ونين السليم من خلال الجينوم 6،15. على هذا النحو، يمكن تحسين بروتوكولات المستقبل من خلال المركبات أو التلاعب الأخرى التي تشجع التعبير BAF60C في hESCs.

بسبب قدرتها الفريدة على تجديد الذات مع الحفاظ على تعدد القدرات، وتعتبر الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) مصدرا لا يقدر بثمن في مجال الطب التجديدي. جيل الخلايا الجذعية إعادة تعمير بوساطة العضلات المريضة والخلايا الجذعية المحفزة أو HESC يسببها (التوجيهية) مشتقة من عضلات الهيكل العظمي لفي المختبر النمذجة المرض هي الأهداف الرئيسية من الدراسات التي تهدف إلى تحديد وتوضيح العلاجات التسبب في الكثير من الأمراض العصبية والعضلية. ومع ذلك، فقد تم الطعن هذه الدراسات من قبل المقاومة من hESCs تحويلها إلى خلايا عضلات الهيكل العظمي وقلة المعلومات بشأن تنظيم الجزيئي للHESC-الالتزام تجاه تكون العضل الهيكل العظمي. في الواقع، وكشف المحاولات السابقة لتوليد الأسلاف العضلات والهيكل العظمي من hESCs ذلك فحسب الجسم مضغي الشكل السلالات (EB) مشتقة أو خلايا اللحمة المتوسطة هي المختصة لتفعيل الهيكل العظمي تكون العضل التالية التعبير خارج الرحم لتفعيل النسخي (على سبيل المثالPax3 أو Myf5) 1-3 أو عن طريق التعرض لظروف ثقافة معينة 4-5. لقد أظهرنا سابقا أن المكون السويسري / الجبهة الوطنية الصومالية، BAF60C (المشفرة بواسطة SMARCD3)، هو عنصر أساسي من آلات النسخ التي يسمح التنشيط بوساطة MyoD من مواضع محددة العضلات 6. لقد اكتشفت مؤخرا أن غياب الانتقائي للBAF60C يضفي على hESCs المقاومة إلى تفعيل بوساطة MyoD من الهيكل العظمي تكون العضل 7 أن لوحظ ذلك في BAF60C معربا عن الخلايا الجسدية 8-10، وهي عملية يشار إلى تحويل عضلي كما. التعبير القسري للBAF60C تمكن MyoD لتفعيل الهيكل العظمي تكون العضل مباشرة في hESCs، بناء على الظروف ثقافة معينة، مع BAF60C وMyoD فرض توقيع جينية التي تلزم hESCs نحو النسب عضلي 7. من المذكرة، كشف تحليل البروتين السابقة عدم وجود انتقائية من BAF60C، بين مكونات SWI / الجبهة الوطنية الصومالية، في المجالس الاقتصادية والاجتماعية 11. استخدمنا هذه المعرفة لفرض الالتزام جينية من hESCs على النسب عضلي، مما يؤدي إلى توليد عدد سكانها متجانسة من myoblasts الهيكل العظمي التي يمكن تجميعها لتشكيل مقلص ثلاثية الأبعاد هياكل (myospheres) التي تحاكي وظيفيا عضلات الهيكل العظمي المنمنمة 7. في الواقع، لدينا وسيلة لتوليد الأسلاف العضلات والهيكل العظمي من hESCs يعتمد على التزام جينية من hESCs إلى النسب عضلي، والتي هي كامنة ظاهريا حتى تتعرض الخلايا إلى إشارات التمايز، مثل خلية التجميع والثقافة في التمايز المتوسطة (انظر بروتوكول معين). يسمح هذا استراتيجية التوسع في عدد السكان متجانسة من hESCs التي ترتكب epigenetically إلى نسب العضلات والهيكل العظمي ومناسبة لتشكيل myospheres مقلص ثلاثية الأبعاد التي ألخص النسيجية والخصائص الوظيفية للالهيكل العظميالعضلات. توفير myospheres أول دليل للعضلات المنمنمة استغلال ل&quot;مرض في طبق&quot; نموذجا للأمراض العضلات. عندما ولدت من مريض المستمدة iPSCs، هذه myospheres لديها القدرة على توضيح المسائل التنموية طويلة الأمد والتسبب في الأمراض النادرة، بالإضافة إلى تقديم إمكانيات هائلة كأداة لفحص إنتاجية عالية من المركبات العلاجية. نلاحظ أيضا أن واحدة قراءات الفوري لتحليل myosphere يمكن أن تقدمها المناعية على أقسام، كما هو موضح في البروتوكول إن الرب عن طريق جوميز وآخرون 12

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="841">
	<colgroup>
		<col span="3" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6 well plate</td>
			<td style="width:259px;">Corning</td>
			<td style="width:259px;">3506</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6 well low attachment plate</td>
			<td style="width:259px;">Corning</td>
			<td style="width:259px;">3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">GFR Matrigel</td>
			<td style="width:259px;">BD Biosciencies</td>
			<td style="width:259px;">356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">MEFs (growth arrested)14</td>
			<td style="width:259px;"></td>
			<td style="width:259px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">17104-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">15-090-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">KOSR</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">1mM L-glutamine (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">35050-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Pen/Strep (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">NEAA (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Polybrene</td>
			<td style="width:259px;">Millipore</td>
			<td style="width:259px;">TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">N2-supplement&#160;</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">TrypLE express</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">FBS</td>
			<td style="width:259px;">HyClone</td>
			<td style="width:259px;">SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">HS</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">16050114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;"><a href="https://www.stemgent.com/products/193">hES Cell Cloning &#38; Recovery Supplement</a></td>
			<td style="width:259px;">Stemgent</td>
			<td style="width:259px;">01-0014-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">bfgf</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">4114-TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">mTeSR1</td>
			<td style="width:259px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:259px;">5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-MyoD</td>
			<td style="width:259px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:259px;">554130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-MyHC</td>
			<td style="width:259px;">DSHB</td>
			<td style="width:259px;">MF20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-myogenin</td>
			<td style="width:259px;">DSHB</td>
			<td style="width:259px;">F5D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of myospheres from hescs by epigenetic reprogramming

جيل من السكان متجانسة وفيرة من خلايا عضلات الهيكل العظمي من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) هو شرط لالعلاجات المستندة إلى الخلايا وعن &quot;مرض في طبق&quot; نموذج من الأمراض العصبية والعضلية الإنسان. عقبات رئيسية، مثل انخفاض وفرة وتجانس السكان من الاهتمام، فضلا عن عدم وجود بروتوكولات لتشكيل هياكل مقلص ثلاثي الأبعاد، وحدت من تطبيقات الخلايا الجذعية لعلاج الاضطرابات العصبية والعضلية. لقد قمنا بتصميم البروتوكول الذي يتغلب على هذه الحدود من قبل مقدمة خارج الرحم من العوامل المحددة في hESCs - تحديد العضلات عامل MyoD وSWI / الجبهة الوطنية الصومالية لونين إعادة عرض المعقدة BAF60C عنصر - التي هي قادرة على إعادة برمجة hESCs إلى خلايا العضلات والهيكل العظمي. نحن هنا وصف أنشأ بروتوكول لتوليد myoblasts المستمدة HESC وتعزيز المجموعات في الهياكل ثلاثي الأبعاد المنمنمة (myospheres) التي تحاكي وظيفيا عضلات الهيكل العظمي المنمنمة 7 </sup&gt;.

ويبين الشكل 1A التخطيطي من البروتوكول المقترح لتوليد myospheres من hESCs. الخطوات الحاسمة للسيطرة على (المشار إليها بواسطة الأسهم) هي كفاءة العدوى في hESCs وتحويل عضلي داخل myospheres. في تجاربنا نحن الاستفادة من ناقلات lentiviral ترميز BAF60C الذي يحمل GFP مضان. نحن عادة ما تصيب الخلايا مع BAF60C ونظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز 72 ساعة بعد العدوى إلى إثراء للسكان معربا عن BAF60C. عندما تصل خلايا حوالي 70-80٪ من التقاء، ونحن تصيب MyoD مع الفيروسة البطيئة. بعد الإصابة الأولى فإنه عادة ما تستغرق يومين أو ثلاثة أيام للخلايا للوصول إلى ذلك التقاء. الرقم 1B يظهر مستويات التعبير عن الجينات الخارجية عن التعريف أضعاف بالمقارنة مع غير المصابين hESCs. ويبين الشكل 1C التعبير والتوزيع على مستوى البروتين من العوامل قدم. BAF60C<html> ويرد التعبير GFP مضان، في حين تم الكشف عن MyoD التعبير المناعي مع الأجسام المضادة MyoD. نعتبر يوم 0 اليوم نبدأ تمايز hESCs المصابة في المجاميع EB-مثل. بعد 15 يوما في المتوسط ​​DM، يتم تضمين جزء من myospheres (عادة بشكل جيد بأكمله واحد) في مجمع أكتوبر 12 ومقطوع لأداء المناعي للعلامات عضلي للتحقق عضلي كفاءة التحويل. يبين الشكل 1D تلطيخ ممثل لmyogenin والميوسين السلسلة الثقيلة في والتمايز عضلي الأمثل. يمكن Myospheres لها أشكال مختلفة أو غير عادية، وربما نتيجة لالتحام مع myospheres أصغر. بدءا من يوم 10، فمن الممكن أن نلاحظ انكماش متفرقة في myospheres (انظر الفيلم 1 و 2). 43/51243fig1.jpg &quot;/&gt; الشكل 1. A) تخطيطي للبروتوكول يستخدم لتوليد myospheres من hESCs. ب) مستويات مرنا من الجينات الخارجية في hESCs المصابين BAF60C وMyoD (H9-BM) التي رصدتها QRT-PCR وأعرب عن التعريف أضعاف، كما مقارنة بالسخرية hESCs المصابة الصور (H9-الظهور). C) المناعي يظهر تلطيخ MyoD (الحمراء) ومضان BAF60C (الأخضر) بسبب العنصر IRES-GFP في ناقلات. D) المناعي التي أجريت على أقسام myosphere الملون لMyogenin (MYOG )، سلسلة الميوسين الثقيلة (MyHC) و counterstained للدابي (انظر التفاصيل المناعي). شريط المقياس هو 100 ميكرون. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2.jpg" /> الشكل 2. صور الممثل مظهر الخلية في مراحل مختلفة منبروتوكول من العدوى (الجزء الأول) لتمايز (الجزء الثاني). شريط مقياس 100 ميكرون. في حين أن الهياكل EB-مثل من D1 إلى D5 هي في معظمها دائرية الشكل (D)، myospheres نمت على مدى 15 يوما وفقا للمخطط في الشكل 1A تقديم شكل لا يمكن التنبؤ بها وغير متجانسة في الثقافة؛ نرى اثنين من الأمثلة في E و F.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming at JoVE.com

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

هنا، نحن تصف البروتوكول استنادا إلى إعادة برمجة جينية للخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) نحو توليد السكان متجانسة من الأسلاف العضلات والهيكل العظمي أنه في ظل ظروف ثقافة متساهلة تشكيل مجموعات ثلاثية الأبعاد من myofibers مقلص (myospheres)، والتي تلخص السمات البيولوجية البشرية عضلات الهيكل العظمي.

جيل من Myospheres من hESCs بواسطة إعادة برمجة جينية

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

generation-of-myospheres-from-hescs-by-epigenetic-reprogramming

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

7.8K Views.  Sanford-Burnham Institute for Medical Research.  هنا، نحن تصف البروتوكول استنادا إلى إعادة برمجة جينية للخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) نحو توليد السكان متجانسة من الأسلاف العضلات والهيكل العظمي أنه في ظل ظروف ثقافة متساهلة تشكيل مجموعات ثلاثية الأبعاد من myofibers مقلص (myospheres)، والتي ?...

Video: Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.


This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells. Part 1 of 3.

من MEFs لMatrigel الأول : hESCs الركض في وجود MEFs

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.
...

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF plates to feeder cell-free Matrigel plates.


This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated. Part 2 of 3.

من MEFs إلى 2 Matrigel : hESCs من تقسيم MEFs على Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated.

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated. Part 3 of 3.

من MEFs لMatrigel 3 : hESCs من الركض على Matrigel Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc, and Klf4 is capable of inducing pluripotency in mouse fibroblasts.1 Subsequent reports have demonstrated the utility of the doxycycline (DOX) inducible lentiviral delivery system for the generation of both primary and secondary iPS cells from a variety of other adult mouse somatic cell types.2,3
Induced pluripotent stem (iPS) cells are similar to embryonic stem (ES) cells in morphology, proliferation and ability to induce teratoma formation. Both types of cell can be used as the pluripotent starting material for the generation of differentiated cells or tissues in regenerative medicine.4-6 iPS cells also have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming mouse embryonic fibroblast (MEF) cells with the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set. We also demonstrate that the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set is capable of expressing each of the four transcription factors upon transduction into MEFs thereby inducing a pluripotent stem cell state that displays the pluripotency markers characteristic of ES cells.

The Stemgent Dox Inducible Mouse TF Lentivirus Set can reprogram mouse embryonic fibroblasts (MEFs) to induced pluripotent stem (iPS) cells. Here we demonstrate the protocol for DOX-inducible expression of mouse reprogramming transcription factors Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc to generate iPS colonies that express common mES pluripotency markers.

جيل من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة عن طريق إعادة برمجة الخلايا الليفية الفأر الجنينية مع عامل النسخ أربعة ، والدوكسيسيكلين محرض Lentiviral نظام تنبيغ

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing the pluripotent state in mouse fibroblasts.1 The same group also reported the successful reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells using human versions of the same transcription factors delivered by retroviral vectors.2 Additionally, James Thomson et al. reported that the lentivirus-mediated co-expression of another set of factors (Oct4, Sox2, Nanog and Lin28) was capable of reprogramming human somatic cells into iPS cells.3
iPS cells are similar to ES cells in morphology, proliferation and the ability to differentiate into all tissue types of the body. Human iPS cells have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction. The generation of patient-specific iPS cells circumvents an important roadblock to personalized regenerative medicine therapies by eliminating the potential for immune rejection of non-autologous transplanted cells.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming human fibroblast cells using the Stemgent Human TF Lentivirus Set. We also show that cells reprogrammed with this set begin to show iPS morphology four days post-transduction. Using the Stemolecule Y27632, we selected for iPS cells and observed correct morphology after three sequential rounds of colony picking and passaging. We also demonstrate that after reprogramming cells displayed the pluripotency marker AP, surface markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, and SSEA-3, and nuclear markers Oct4, Sox2 and Nanog.

We demonstrate the protocol for the generation of induced pluripotent stem cells from human somatic cells using lentivirus-mediated delivery of the human factors Oct4, Sox2, Nanog, and Lin28. Pluripotency was confirmed by morphology and the presence of embryonic stem (ES) cell-specific markers.

تعيين جيل من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة عن طريق إعادة برمجة الخلايا الليفية الإنسان مع الإنسان الفيروسة البطيئة TF Stemgent

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

جيل المعدلة وراثيا C. ايليجانس عن طريق تحويل Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

استخراج الحمض النووي من مادة البارافين جزءا لا يتجزأ من التحليلات الجينية واللا جيني

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

جيل من الفئران المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.