وأيد AV من قبل EMBO على المدى الطويل زمالة ما بعد الدكتوراه. ويتم تمويل البحوث في مختبر مارتن من منحة ERC البداية (GeometryCellCycle) ومنحة مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (31003A_155944) إلى SGM.

<ol>
	<li>Mata, J., Bahler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+roles+of+Ste11p,+cell+type,+and+pheromone+in+the+control+of+gene+expression+during+early+sexual+differentiation+in+fission+yeast.">Global roles of Ste11p, cell type, and pheromone in the control of gene expression during early sexual differentiation in fission yeast.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (42), 15517-15522 (2006).</li><li>Xue-Franzen, Y., Kjaerulff, S., Holmberg, C., Wright, A., Nielsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomewide+identification+of+pheromone-targeted+transcription+in+fission+yeast.">Genomewide identification of pheromone-targeted transcription in fission yeast.</a> BMC Genomics. 7, 303 (2006).</li><li>Klar, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+learned+from+studies+of+fission+yeast+mating-type+switching+and+silencing.">Lessons learned from studies of fission yeast mating-type switching and silencing.</a> Annu Rev Genet. 41, 213-236 (2007).</li><li>Beach, D. H., Klar, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearrangements+of+the+transposable+mating-type+cassettes+of+fission+yeast.">Rearrangements of the transposable mating-type cassettes of fission yeast.</a> EMBO J. 3 (3), 603-610 (1984).</li><li>Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mate+and+fuse:+how+yeast+cells+do+it.">Mate and fuse: how yeast cells do it.</a> Open Biol. 3 (3), 130008 (2013).</li><li>Mochizuki, N., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+in+the+intracellular+cAMP+level+triggers+initiation+of+sexual+development+in+fission+yeast.">Reduction in the intracellular cAMP level triggers initiation of sexual development in fission yeast.</a> Mol Gen Genet. 233 (1-2), 17-24 (1992).</li><li>Sugimoto, A., Iino, Y., Maeda, T., Watanabe, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizosaccharomyces+pombe+ste11++encodes+a+transcription+factor+with+an+HMG+motif+that+is+a+critical+regulator+of+sexual+development.">Schizosaccharomyces pombe ste11+ encodes a transcription factor with an HMG motif that is a critical regulator of sexual development.</a> Genes Dev. 5 (11), 1990-1999 (1991).</li><li>Kjaerulff, S., Lautrup-Larsen, I., Truelsen, S., Pedersen, M., Nielsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+activation+of+the+fission+yeast+pheromone-responsive+pathway+induces+ectopic+meiosis+and+reveals+ste11+as+a+mitogen-activated+protein+kinase+target.">Constitutive activation of the fission yeast pheromone-responsive pathway induces ectopic meiosis and reveals ste11 as a mitogen-activated protein kinase target.</a> Mol Cell Biol. 25 (5), 2045-2059 (2005).</li><li>Obara, T., Nakafuku, M., Yamamoto, M., Kaziro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+a+gene+encoding+a+G-protein+alpha+subunit+from+Schizosaccharomyces+pombe:+involvement+in+mating+and+sporulation+pathways.">Isolation and characterization of a gene encoding a G-protein alpha subunit from Schizosaccharomyces pombe: involvement in mating and sporulation pathways.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (13), 5877-5881 (1991).</li><li>Toda, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fission+yeast+genes+that+confer+resistance+to+staurosporine+encode+an+AP-1-like+transcription+factor+and+a+protein+kinase+related+to+the+mammalian+ERK1/MAP2+and+budding+yeast+FUS3+and+KSS1+kinases.">Fission yeast genes that confer resistance to staurosporine encode an AP-1-like transcription factor and a protein kinase related to the mammalian ERK1/MAP2 and budding yeast FUS3 and KSS1 kinases.</a> Genes Dev. 5 (1), 60-73 (1991).</li><li>Bendezu, F. O., Martin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+explores+the+cell+periphery+for+mate+selection+in+fission+yeast.">Cdc42 explores the cell periphery for mate selection in fission yeast.</a> Curr Biol. 23 (1), 42-47 (2013).</li><li>Dudin, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formin-nucleated+actin+aster+concentrates+cell+wall+hydrolases+for+cell+fusion+in+fission+yeast.">A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast.</a> J Cell Biol. 208 (7), 897-911 (2015).</li><li>Chikashige, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere-led+premeiotic+chromosome+movement+in+fission+yeast.">Telomere-led premeiotic chromosome movement in fission yeast.</a> Science. 264 (5156), 270-273 (1994).</li><li>Bahler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+modules+for+efficient+and+versatile+PCR-based+gene+targeting+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe.</a> Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).</li><li>Egel, R., Willer, M., Kjaerulff, S., Davey, J., Nielsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+pheromone+production+and+response+in+fission+yeast+by+a+halo+test+of+induced+sporulation.">Assessment of pheromone production and response in fission yeast by a halo test of induced sporulation.</a> Yeast. 10 (10), 1347-1354 (1994).</li><li>Tran, P. T., Marsh, L., Doye, V., Inoue, S., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+nuclear+positioning+in+fission+yeast+based+on+microtubule+pushing.">A mechanism for nuclear positioning in fission yeast based on microtubule pushing.</a> J Cell Biol. 153 (2), 397-411 (2001).</li><li>Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein.">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).</li><li>Kitamura, K., Shimoda, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Schizosaccharomyces+pombe+mam2+gene+encodes+a+putative+pheromone+receptor+which+has+a+significant+homology+with+the+Saccharomyces+cerevisiae+Ste2+protein.">The Schizosaccharomyces pombe mam2 gene encodes a putative pheromone receptor which has a significant homology with the Saccharomyces cerevisiae Ste2 protein.</a> EMBO J. 10 (12), 3743-3751 (1991).</li><li>Tanaka, K., Davey, J., Imai, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizosaccharomyces+pombe+map3++encodes+the+putative+M-factor+receptor.">Schizosaccharomyces pombe map3+ encodes the putative M-factor receptor.</a> Mol Cell Biol. 13 (1), 80-88 (1993).</li><li>Motegi, F., Arai, R., Mabuchi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+type+V+myosins+in+fission+yeast,+one+of+which+functions+in+polarized+cell+growth+and+moves+rapidly+in+the+cell.">Identification of two type V myosins in fission yeast, one of which functions in polarized cell growth and moves rapidly in the cell.</a> Mol Biol Cell. 12 (5), 1367-1380 (2001).</li><li>Sajiki, K., Pluskal, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+analysis+of+fission+yeast+at+the+onset+of+nitrogen+starvation.">Metabolomic analysis of fission yeast at the onset of nitrogen starvation.</a> Metabolites. 3 (4), 1118-1129 (2013).</li><li>Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+fluorophore+formation+and+engineering.">Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering.</a> Curr Opin Chem Biol. 7 (5), 557-562 (2003).</li><li>Dyer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+shallow+chemical+gradients+by+actin-driven+wandering+of+the+polarization+site.">Tracking shallow chemical gradients by actin-driven wandering of the polarization site.</a> Curr Biol. 23 (1), 32-41 (2013).</li><li>Beta, C., Bodenschatz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+tools+for+quantitative+studies+of+eukaryotic+chemotaxis.">Microfluidic tools for quantitative studies of eukaryotic chemotaxis.</a> Eur J Cell Biol. 90 (10), 811-816 (2011).</li><li>Lee, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+dynamic+assay+of+single+cell+chemotaxis.">Quantitative and dynamic assay of single cell chemotaxis.</a> Integr Biol (Camb). 4 (4), 381-390 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

الظروف البيئية، وتوافر المواد الغذائية على وجه الخصوص، تؤثر بقوة على علم وظائف الأعضاء الانشطار الخميرة. النيتروجين المجاعة ضروري للالتزام التكاثر الجنسي ويؤدي إلى ضرب التغيرات في الإنقسامية تقدم دورة الخلية (المرجع 21) والشكل (2) في البداية. على إزالة النيتروجين من النمو أضعافا مضاعفة عدد السكان وحجم الخلية في الانقسام يتناقص بسرعة (الشكل 2C) وغالبية خلايا اعتقال التقدم الإنقسامية أقصر من طول المولود حديثا الخلايا المزروعة أضعافا مضاعفة (المرجع 21) والشكل (2D). كما خلايا من أنواع التزاوج المعاكس تعتقل التقدم الإنقسامية ينخرطون شركاء التزاوج، والشروع في تشكيل بيضات ملقحة وsporulate (الشكل 2B، 2E، 2F). في حالة وجود أحادي الطبقة ثنائية الأبعاد من الخلايا wildtype، أكثر من ستين في المئة من خلايا H90 سوف تشارك شريك، وتقريبا كل سيخضع انصهار الخلية (الشكل 2G </stronز&gt;). كفاءة التزاوج هو أقل قليلا في خليط من سلالات heterothallic وتعتمد على كثافة الخلايا ومركزها النسبي (الشكل 2G). واحدة من أهم جوانب بروتوكول للحصول على كفاءة عالية التزاوج هو التأكد من أن الخلايا يتم الاحتفاظ داخل الكثافة المشار إليها طوال الوقت. رصد حجم الخلية والكفاءة التزاوج المعلمات كما هو مبين في الشكل 2 ثم يوفر تحكم بسيطة أن الخلايا تدخل التكاثر الجنسي بكفاءة. ونلاحظ أنه منذ التزاوج عدم المتوسط ​​أي مصدر النيتروجين (حتى كميات قليلة من الأحماض الأمينية والقواعد النيتروجينية مستبعدة)، ويتم الحصول على الكفاءات التزاوج العالية مثل تلك التي عرضت في الشكل 2E و 2G فقط مع سلالات أنموذجية التغذي بشكل كامل. سلالات العوز الغذائي يمكن استخدامها، ولكن تحتاج إلى عناية إضافية للتأكد من أن الخلايا في جميع الأوقات تظل ضمن كثافة الخلية جاء في البروتوكول. حتى مع الرعاية، فقطوسيراعى أقل كفاءة التزاوج. ويتأثر كفاءة التزاوج أيضا في درجة الحرارة، مع كفاءات أقل لوحظ في درجة حرارة مرتفعة، مما قد يحد من استخدام أليل متحولة حساسة للحرارة أثناء عملية التزاوج. يتم استخدام الطريقة المعروضة هنا في المقام الأول للتصوير على المدى الطويل من الصحفيين الفلورسنت. لأنه يتم تنفيذ التصوير على مدى فترة طويلة من الزمن، والتصوير الناجح من الانشطار الخميرة التزاوج يعتمد بشكل كبير على الإعداد المجهر المتاحة. لهذا، واستقرار المجهر انشاء، والحساسية، والوصول إلى نظام ضبط تلقائي للصورة حاسمة. إما البرامج أو المستندة إلى أنظمة ضبط تلقائي للصورة الأجهزة المدمج في ممكنة. وبالإضافة إلى ذلك، لزيادة الإنتاجية، مرحلة الآلية تمكين اكتساب عدة نقاط هي نوعية هامة أخرى. جودة التصوير محدودة بسبب خصائص fluorophore من الفائدة. الأوقات حضانة متميزة في السائل MSL-N المتوسطة المفصل في Protocoوتهدف ل القسم 2.3 في تحسين مضان على البروتينات الموسومة التي يسببها فرمون وتقليل تبيض لزوم لها عن طريق التصوير مراحل فقط التزاوج من الفائدة. بينما البروتينات وفيرة أو مبؤرة غاية الموسومة fluorescently تسمح الاستحواذ على مئات من الزمن نقاط على مدار دورة حياة جنسية كاملة (فيلم S3)، والبروتينات الأخرى تشكل تحديا لصورة على مثل هذه الأوقات طويلة بسبب الصور التبييض. يعتمد جودة الصورة أيضا على fluorophore المختار، عادة ما يكون مشتق GFP. لاحظنا مرارا وتكرارا أن sfGFP 17 (superfolder GFP)، التي تطوي مع حركية السريعة، شريطة الإشارة فائقة أثناء عملية التزاوج، ربما لأن الالتهام الذاتي قوي يدفع دوران البروتين السريع. الأهم من ذلك، ونحن لم مراقبة توافر الأكسجين اللازم للبروتين فلوري نضوج 17،22. وبالتالي، فمن المستحسن أن يكون حذرا في استخدام القياسات مضان لقياس مستويات البروتينات وأعرب بعد الخلايا هي mounteد على الشرائح، أو لاستخدام الأكسجين الأجهزة على microfluidics نفاذية بديلة لإجراء مثل هذه التجارب. وبالإضافة إلى ذلك، ومنصات الاغاروز رصدت مع الخلايا في المساء، وأبقت على 18 درجة مئوية O / N أن يكون مفيدا جدا لصورة صحفيين ضعيفة كما تحتوي هذه منصات خليط من الخلايا في جميع مراحل التكاثر الجنسي. التزاوج في الخميرة الانشطار لا يحمل التزامن والخلايا يمكن أن ينظر بسهولة بدء shmooing جنبا إلى جنب مع غيرها من الخلايا sporulating بالفعل (أفلام S1، S2). هذه الديناميات السكانية يجعل الكلاسيكية والتقنيات الحيوية بكميات كبيرة من الصعب استخدام، مما يجعل المجهر خلية واحدة وصفت هنا طريقة الاختيار. كل النهج القائم على الفحص المجهري يمكن من حيث المبدأ أن تطبق على خلايا أعدت مع بروتوكول صفها هنا. الأهم من ذلك، أن هذه النهج مراقبة العمليات التي تظهر التزاوج نوع معين ديناميات مثل الانصهار خلية خلية وصفها دودين وزملاؤه 12. لمراقبة عدم التماثل، نوع التزاوج للصحفيينوكانت مفيدة بشكل خاص (الشكل 3A). التفريق بين أنواع التزاوج اثنين يتحقق بسهولة عند العمل مع سلالات heterothallic من خلال توظيف fluorophores متميزة لوضع علامة البروتينات في ح- وح + الخلايا. ومع ذلك، لم يكن ذلك ممكنا لسلالات homothallic. نهج وضعت للتمييز بين نوع التزاوج الخلايا H90 هو للتعبير عن البروتينات الفلورية عصاري خلوي تحت سيطرة من نوع التزاوج المروجين محددة. على وجه الخصوص، تم استخدام المروجين للفرمون مستقبلات الجينات map3 وmam2 لدفع التعبير عن GFP أو mCherry البروتينات في خلايا P و M على التوالي. وعلاوة على ذلك، سمحت هذه العلامات توقيت دقيق للاندماج خلية خلية، تصور كما نقل إشارة الفلورسنت من الخلايا شريك واحد على الآخر. الفيرومونات التزاوج هي عوامل حاسمة للتقدم عبر مراحل متميزة من التكاثر الجنسي في الخميرة 11،23 مستويات مختلفة من فرمون الرصاص الاصطناعية للدول خلية الاستقطاب متميزة في الخميرة الانشطار (الشكل 3B، 3C والرقم 11). البروتوكول تضمن أعلى يسمح تقييم كيفية تأثير متميزة مستويات فرمون الخارجية فسيولوجيا الخلية. لأن الأنزيم البروتيني فرمون Sxa2 يتحلل بسرعة P-عامل، سلالة متحولة heterothallic حيث تم حذف البروتيني كانت تستخدم للحصول على نتائج قابلة للتكرار. ومع ذلك، في خليط من خلايا أنواع التزاوج المعاكس، وليس فقط ولكن أيضا مستويات التوزيع المكاني للالفيرومونات المنبعث من شريك التزاوج من المحتمل أن تكون مهمة. وتحليل آثار التوزيع المكاني فرمون على استجابة الخلايا تتطلب تطوير الاجهزة أكثر تطورا مثل الأجهزة على microfluidics العاملين في مهدها الخميرة 24،25. وباختصار، فإننا نقدم وسيلة أساسية للفحص المجهري على المدى الطويل من دورة حياة الجنسية من الخميرة الانشطار. تعديلات طفيفة على هذا البروتوكول تسمح الباحثينالفصل التركيز على الاستجابات الخلوية في مراحل متميزة من مراحل دورة حياة الجنسية. ويجمع هذا النهج مع أدوات الخلية والكيمياء الحيوية واحدة والأجهزة على microfluidics مواصلة تعزيز الانشطار الخميرة التكاثر الجنسي كنظام نموذج قوية.

على الرغم من صرف الجيني بين خليتين هو الحدث المركزي في التكاثر الجنسي، فإنه يعتمد على سلسلة من الفعاليات التي تعزز تمايز الخلايا، والسماح للاختيار الشريك، والقيام الانصهار خلية خلية والحفاظ على الاستقرار الجيني. وهكذا تقدم دورة الحياة الجنسية نفسها كنظام نموذج لدراسة عدد من المسائل الحيوية المتعلقة مفاتيح التنموية، والاستجابة للمؤثرات خارجي، والانصهار غشاء البلازما والعزل الصبغي، الخ استكشاف الانشطار الخميرة دورة الجنسية لدراسة هذه الظواهر يجلب فوائد لل علم الوراثة قوية نظام النموذج، راسخة النهج الإنتاجية العالية والفحص المجهري متطورة. الجنس في الخميرة الانشطار هو حدث مغاير بين P-خلية وM-خلية من أنواع التزاوج متميزة. أنواع الخلايا اثنين من التعبير عن تفاضلي عدد من الجينات 1،2 بما في ذلك لإنتاج P- يفرز وM-الفيرومونات، فرمون مستقبلات Map3 وMam2 وكذلك فرمون-بروتيإس إي إس Sxa1 وSxa2. سلالات Homothallic، مثل سلالة H90 شيوعا، وتحمل المعلومات الوراثية لكلا النوعين التزاوج في الجينوم واحد والخلايا الخضوع لنمط معقد من نوع التزاوج التبديل طوال دورة حياة الإنقسامية (إعادة النظر في المرجع 3). كما تستخدم عزلة متعددة من الخميرة الانشطار heterothallic التي نادرا أو أبدا تبديل نوع التزاوج عادة 4، أبرزها ح + N (P-نوع) وح -S (M-نوع) السلالات. في الخميرة الانشطار، دخول دورة حياة جنسية قيد التنظيم الغذائي الصارم. فقط خلايا الخميرة الانشطار المتعطشة النيتروجين تعتقل الاستنساخ الإنقسامية وتنتج الفيرومونات إنتشاري للإشارة إلى وجود شريك التزاوج وتشجيع المزيد من الخطوات للدورة الجنسية (إعادة النظر في المرجع 5). الحرمان من النيتروجين دي يقمع المنظم النسخي رئيسيا من Ste11 التزاوج الذي يعمل بمثابة مفتاح التنمية ويعزز هxpression من التزاوج جينات معينة بما في ذلك مستقبلات فرمون وفرمون جينات إنتاج 6،7. مشاركة فرمون مستقبلات ينشط يقترن مستقبلات البروتين G-ألفا والمصب إشارات MAPK الذي يعزز ذلك من Ste11 النشاط النسخي 8-10، وبالتالي زيادة إنتاج فرمون في ردود الفعل الإيجابية بين شركاء التزاوج. مستويات فرمون حاسمة للحث على مختلف الدول خلية الاستقطاب من خلال تنظيم منظم سيد قطبية الخلية، رو-عائلة GTPase Cdc42 11. عند التعرض لتركيزات منخفضة فرمون، هو تصور نشط Cdc42 في بقع حيوية استكشاف محيط الخلية، ويلاحظ أي نمو الخلايا في هذه المرحلة. زيادة مستويات فرمون تعزيز استقرار النشاط Cdc42 إلى منطقة واحدة ونمو إسقاط الاستقطاب، ووصف shmoo، الذي يجمع خلايا شريك في الاتصال. وفي وقت لاحق، وهما شركاء التزاوج فرداني تلتحم لتشكل البيضة الملقحة مضاعفا. العمل الأخير يكشف عشرالبريد جود هيكل الأكتين رواية ضروري لالانصهار التي يتم تجميعها من قبل formin الناجم عن التزاوج Fus1 12. هذا التركيز الانصهار يركز العمليات تعتمد نوع-V الميوسين ومواقف آلية تدهور جدار الخلية، مما يتيح إعادة تشكيل جدار الخلية للسماح البلازما غشاء الاتصال دون خلية تحلل 12. على الانصهار خلية خلية، ونوى تأتي في اتصال وتخضع تزاوج نووي. والتي تعتمد على داينين ​​بارزة حركة ذهابا وإيابا للنواة داخل البيضة الملقحة (حركة ذيل حصان) ثم يشجع على المزاوجة بين homologs كروموسوم 13،14، والتي تبعتها الانقسام الاختزالي. وأخيرا، يتم تعبئتها المنتجات أربعة من الانقسام الاختزالي إلى جراثيم الفردية خلال تبوغ. بسبب تعقيدها والخطوات العديدة المشاركة، ورصد تفصيلي من التزاوج تم تحديا. اثنين من الصعوبات البارزة هي أن العملية برمتها تستغرق ما يزيد على خمس عشرة ساعة وأن الخلايا هي صعبة لمزامنة. هذه دالالتفاف ifficulties بنهج المجهر وحيدة الخلية. هنا بروتوكول العام للتحقيق وتقديم دورة حياة الجنسية في الخميرة الانشطار. مع تعديلات طفيفة، يسمح هذا البروتوكول دراسة جميع الخطوات المختلفة لهذه العملية، وهي تحريض منتج الجين التزاوج، الاستقطاب الخلية والاقتران بين خلايا شقيقته بعد نوع التزاوج التحويل وبين شركاء غير شقيقة، والانصهار خلية خلية، وبعد الانصهار الحصان ذيل الحركة، الانقسام الاختزالي والتجرثم. يسمح هذا الأسلوب ل1) بسهولة الموسومة تصور fluorescently البروتينات مع مرور الوقت ما قبل وأثناء وبعد الانصهار. 2) تميز سلوك خلايا المعاكس نوع التزاوج. و3) قياس وتحديد المعايير مثل shmooing، التزاوج، والانصهار أو كفاءة تبوغ.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="667">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:219px;">Glucose</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:108px;">G8270-10KG</td>
			<td style="width:224px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.05108.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pantothenate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2088,0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Nicotinic Acid</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0963,0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Inositol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1716,0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Biotin</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0967,0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MnSO4</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1038,0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ZnSO4.7H2O&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FeCl2.6H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3514,0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molybdenum oxide (VI) (MoO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>69850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">KI</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3872,0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CuSO4.5H2O</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1034,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Citric Acid&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2344,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(NH4)2SO4&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01217.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">L-Leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Adenine Hemisulfat Salt, mini 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Uracil&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Lanolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Vaseline</td>
			<td>Reactolab</td>
			<td>92045-74-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Paraffin</td>
			<td>Reactolab</td>
			<td>7005600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscopy of fission yeast sexual lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

الانشطار نمو الخميرة والتزاوج حيوية عند إزالة مصدر النيتروجين كما النيتروجين التجويع هو شرط أساسي لبدء التكاثر الجنسي في الخميرة الانشطار، تم رصد نوع السلالة البرية H90 homothallic على التحول من النيتروجين الغنية والمتوسطة الذين حرموا من النيتروجين (الشكل 2)، بعد بروتوكول المبينة في الشكل رقم 1 لفترة وجيزة، والخلايا كانت تزرع O / N إلى مرحلة الأسي (OD 600 = 0.5) في MSL + N المتوسطة، التي تم جمعها، وغسلها وإعادة علقت في MSL-N المتوسطة السائل إلى OD النهائي 600 = 1.5. وكانت كل 2 قسامات ساعة من خلايا calcofluor الملطخة وتصوير (الشكل 2A - D). كشفت Calcofluor تلطيخ (الشكل 2A) أنه في المتوسط ​​الغنية بالنتروجين ~ 21٪ من خلايا تم septating (ن&gt; 300، الشكل 2B) وأن متوسط ​​طول الخلية في ديفيوكان سيون 15.2 ± 1.4 ميكرومتر (ن = 50، الشكل 2C). أظهرت عدم تقسيم خلايا التوزيع الواسع لأطوال خلية (8-14 ميكرون، ن&gt; 200، الشكل 2D). ومع ذلك، بعد ساعتين من التحول إلى MSL-N المتوسطة كان هناك تغيير جذري في توزيع طول الخلايا غير تقسيم، مع أكثر من 60٪ من خلايا كونه أقصر من 9 ميكرون (ن&gt; 200، الشكل 2D). تم الكشف عن خلية تحوجز أيضا في تقليص طول 9.8 ± 0.8 ميكرومتر (ن = 50، الشكل 2A، 2C). ولوحظ أيضا انخفاض آخر في طول كل من غير فاصل وتقسيم الخلايا، مع مرور الوقت في زيادة MSL-N. في الواقع، بعد 8 ساعات و انخفض الرقم القياسي تحوجز للثقافة أقل من 2٪ (ن&gt; 300)، وأكثر من 85٪ من خلايا القبض على دورة الخلية الخاصة بهم في أطوال أقصر من 7 ميكرون (ن&gt; 200، الشكل 2D). بدأت الخلايا لتشكيل التزاوج أزواج بعد التحول إلى السائل MSL-N أربع ساعاتمتوسطة (&lt;1٪، 2A الشكل). وفي وقت لاحق عدد من أزواج التزاوج زيادة سريعة و 8 ساعة بعد تحول 10٪ من خلايا تعمل شريك التزاوج (ن&gt; 200، الشكل 2B). لمراقبة ديناميات التزاوج، 6 ساعات بعد تحريض المجاعة، وقد شنت قسامة من الخلايا أيضا على MSL-N وحة agarose للتصوير. خضعت خلايا shmooing، والانصهار وتبوغ (الشكل 2E، 2F) في 21 ساعة اللاحقة دون أي التزامن واضح (فيلم S1). كفاءة التزاوج يتوقف على الوضع النسبي وكثافة الخلايا في مجال معين للعرض، مع أكثر من 60٪ من الخلايا تعمل شريك عند وضعه المكتظة في أحادي الطبقة (الشكل 2G والسينما S1). تعرض السلالات البرية من نوع heterothallic ح + وح- الخميرة الانشطار أيضا إلى نفس البروتوكول معخطوة إضافية ن خلط ح + والخلايا ح- في نسبة واحد الى واحد في وقت إزالة النيتروجين. وقد لوحظت مماثلة الجوع والتزاوج ديناميكية، ولكن كفاءة التزاوج أقل قليلا (الشكل 2G، فيلم S2). ديناميات الموسومة fluorescently البروتينات الرصد في خلايا الخميرة التزاوج الانشطار كانت مختلطة خلايا ح- لمراقبة ديناميات نوع-V الميوسين Myo52 (المرجع 20) في التزاوج الخلايا، ونمت بشكل كبير معربا عن Myo52-3GFP من موضع الأصلي مع h + الخلايا معربا بالمثل Myo52-tdTomato، فضلا عن GFP عصاري خلوي من P -cell المروج map3 محددة. وجرفت تعليق الخلية، مخففة في MSL-N المتوسطة والمحتضنة لمدة 6 ساعات في 30 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة قبل خلايا متزايدة على منصات MSL-N الأغاروس لO / N التصوير في 10 دقيقة فترات. كما ذكرت سابقا 11،12 Myo52 مناطق حيوية في البداية شكلت في جميع أنحاء قشرة الخلية (الشكل 3A، رؤوس سهام وفيلم S3). وقد Myo52 إشارة ثم استقر (الشكل 3A، والسهام وفيلم S3) في التركيز واحدة فقط قبل الحدث الانصهار، الذي تصور عن طريق نقل إشارة GFP عصاري خلوي من ح + في الخلية ح- (الشكل 3A وفيلم S3) . ويمكن أيضا أن لاحظ إشارة Myo52-tdTomato في الرقبة الانصهار خلال توسعها ولكن لم يكن هناك إشارة ملحوظ واضحا كما شرع البيضة الملقحة إلى تبوغ (الشكل 3A وفيلم S3). مراقبة سلوك الخلايا الخميرة Heterothallic الانشطار تتعرض لالفيرومونات الخارجية خلايا ح- Heterothallic تفتقر إلى البروتيني Sxa2 التي تحط ف عامل الحساسية تستجيب بسهولة إلى الاصطناعية P-عامل. وح- </م&gt; sxa2Δ سلالة، معربا عن Scd2-GFP كعلامة لالنشط Cdc42 11، كانت تزرع في MSL + N المتوسطة، وفقا لبروتوكول صفها. تم غسلها الخلايا في MSL-N المتوسطة والمحتضنة لمدة 4 ساعات في 30 درجة مئوية. MSL-N منصات الأغاروس تحتوي على الميثانول (لا تظهر البيانات)، 0.1 ميكروغرام / مل (منخفض فرمون، الشكل 3B) أو 1 ميكروغرام / مل (فرمون عالية، الشكل 3C) من P-عامل تم إعداد، وقطع ووضع على شريحة جديدة لتوليد منصات صغيرة تحتوي على كميات فرمون مختلفة. وقد شنت 0.5 ميكرولتر من تعليق خلية في كل صغيرة ومنصات لO / N التصوير في 5 فترات دقيقة. في التوافق مع النتائج المنشورة 11، شجعت انخفاض مستويات P-عامل تشكيل مناطق Scd2 ديناميكية دون النمو (الشكل 3B، الفيلم S4)، في حين استقرت مستويات عالية من P-عامل منطقة Scd2 واحدة، وبالتالي يحفز shmoo استطالة من القطب خلية واحدة (Figure 3C، فيلم S5). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53801/53801fig1.jpg" /> الشكل 1:.. التمثيل التخطيطي من البروتوكول (أ) وصف تخطيطي من البروتوكولات المستخدمة لمراقبة دورة حياة جنسية الانشطار الخميرة و (ب) لإعداد عينات الانشطار الخميرة للتصوير على المدى الطويل <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53801/53801fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم .</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/53801/53801fig2.jpg" /> الشكل 2: نمو والتزاوج ديناميات خلايا الخميرة الانشطار تحولت من MSL + N لMSL-N وسائل الإعلام الميكروسكوب (A) Epifluorescence الخلايا ملطخة calcofluor تحولت إلى MSL-N وسائل الإعلام لفترات أشار من الزمن. (ب) في المئةتحولت من septating (خط أزرق غامق، ن&gt; 300 في timepoint) والتزاوج (خط أزرق فاتح، ن&gt; 300 في timepoint) الخلايا لMSL-N وسائل الإعلام لفترات أشار من الزمن. (C) متوسط ​​طول الخلايا septating تحول إلى MSL-N وسائل الإعلام لفترات أشار في وقت (ن = 50 في timepoint باستثناء 8 ساعة timepoint حيث n = 20). (د) توزيع طول الخلايا غير تقسيم تحول إلى MSL-N المتوسطة لفترات أشار في وقت (ن&gt; 200 في timepoint). (E) متوسط ​​جزء من غير مدمجة (خط أزرق غامق)، تنصهر (أزرق فاتح خط) وsporulating (خط أسود) الخلايا في عدد سكانها H90 البرية من نوع الخميرة تحول إلى MSL-N وسائل الإعلام لفترات أشار الوقت و شنت على وسادة أجار في timepoint 6 ساعات (ن&gt; 900 خلية لكل timepoint من ثلاثة timelapses مختلفة). واعتبرت الخلايا تنصهر عندما لم يكن جدار الخلية الانكسار بين الشركاء مرئية في الميكروسكوب مدينة دبي للإنترنت وتشكيل جدار الخلية بوغ كانت تستخدم لصالح فريق ليرة سوريةorulating الخلايا. الميكروسكوب (F) DIC الخلايا التزاوج تحولت إلى MSL-N وسائل الإعلام لفترات أشار من الزمن. (G) كفاءة التزاوج بوصفها وظيفة من كثافة الخلايا على منصات الأغاروس لH90 (النقاط ذات لون أزرق داكن) وح + / ح- (نقطة ضوء أزرق) الخلايا تحولت إلى MSL-N وسائل الاعلام لمدة 24 ساعة. ويتم تحقيق كثافة أكثر ملائمة للخلايا للتصوير على المدى الطويل في ما يقرب من 25000 خلية / مم 2. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53801/53801fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/53801/53801fig3.jpg" /> الشكل (3): دينامية توطين البروتينات الفلورية خلال التزاوج الانشطار الخميرة (A) Deconvolved الميكروسكوب epifluorescence ض طائرة واحدة من الخلايا التي تحتوي على المورثات أشار تحولت من MSL + N لMSL-N وسائل الاعلام عن 6 ساعات وشنت علىMSL-N وحة agarose للمرة المشار إليه. النصال تشير مناطق Myo52-3GFP ديناميكية ويشير السهم من Myo52 التعريب في التركيز الانصهار. (ب)، (ج) Deconvolved واحدة ض الطائرة الميكروسكوب epifluorescence من الخلايا مع المورثات أشار تحولت من MSL + N لMSL-N وسائل الإعلام لمدة 4 ساعة والتي شنت على الأغاروس منصات مصغرة MSL-N تحتوي على 0.1 ميكروغرام / مل (ب) أو 1 ميكروغرام / مل (C) من P-عامل الوقت المشار إليه. النصال تشير الحيوي (B) أو مستقرة مناطق (C) Scd2-GFP. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53801/53801fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="Movie1" src="/files/ftp_upload/53801/53801movie1.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53801/SupplementalMovie1.mov" target="_blank">الفيلم التكميلي 1:</a> لقطات متتابعة مدينة دبي للإنترنت البرية من نوع H90 الانشطار الخميرة م<html> LLS التي كانت النيتروجين المتعطشة لل6 ساعات قبل التصوير. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53801/SupplementalMovie1.mov" target="_blank">(انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).</a> <img alt="Movie2" src="/files/ftp_upload/53801/53801movie2.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53801/SupplementalMovie2.mov" target="_blank">التكميلي فيلم 2:</a> . قطات متتابعة مدينة دبي للإنترنت البرية من نوع ح + وخلايا الخميرة الانشطار ح- التي كانت مختلطة والنيتروجين في حاجة ماسة إلى 6 ساعات قبل التصوير <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53801/SupplementalMovie2.mov" target="_blank">(انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).</a> <img alt="Movie3" src="/files/ftp_upload/53801/53801movie3.jpg" /> &quot;&gt; فيلم التكميلي 3: Deconvolved epifluorescence واحدة ض الطائرة ومدينة دبي للإنترنت لقطات متتابعة من خلايا ح- معربا عن Myo52-3GFP من موضع الأصلي مختلطة مع h + الخلايا معربا عن Myo52-tdTomato من موضع الأصلي وGFP عصاري خلوي من P-خلية المروج map3 محدد . كانت تزرع الخلايا في MSL-N متوسطة لمدة 6 ساعة على 30 درجة مئوية قبل التصوير. نقل GFP عصاري خلوي في الخلية ح- يحدد وقت الانصهار. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53801/SupplementalMovie3.mov" target="_blank">(انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).</a> <img alt="Movie4" src="/files/ftp_upload/53801/53801movie4.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53801/SupplementalMovie4.mov" target="_blank">الفيلم التكميلي 4:</a> Deconvolved epifluorescence واحدة ض الطائرة ومدينة دبي للإنترنت لقطات متتابعة من ح- إكسب خلايا sxa2<html> ressing Scd2-GFP من المروج لها الأصلي تعامل مع 0.1 ميكروغرام / مل ف عامل. وقد نمت الخلايا في MSL-N متوسطة لمدة 4 ساعة عند 30 درجة مئوية قبل التصوير. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53801/SupplementalMovie4.mov" target="_blank">(انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).</a> <img alt="Movie5" src="/files/ftp_upload/53801/53801movie5.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53801/SupplementalMovie5.mov" target="_blank">: فيلم التكميلي 5</a> كانت تزرع Deconvolved epifluorescence واحدة ض الطائرة ومدينة دبي للإنترنت لقطات متتابعة من خلايا sxa2 ح- معربا عن Scd2-GFP من المروج الأصلي لها تعامل مع 1 ميكروغرام / مل ف عامل الخلايا في MSL-N متوسطة لمدة 4 ساعة عند 30 درجة مئوية. قبل التصوير. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53801/SupplementalMovie5.mov" target="_blank">(انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).</a> <table fo:keep-tog</html style=";text-align:right;direction:rtl">ether.within الصفحات = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> YSM995 </td><td> ح- بالوزن </td></tr><tr><td> YSM1371 </td><td> ح + بالوزن </td></tr><tr><td> YSM 1396 </td><td> H90 بالوزن </td></tr><tr><td> YSM2534 </td><td> ح- myo52-3GFP :: kanMX </td></tr><tr><td> YSM2730 </td><td> ح + myo52-tdTomato :: natMX Pmap3: GFP :: ura4 + @ ura4locus </td></tr><tr><td> YSM2731 </td><td> ح- scd2-GFP :: natMX sxa2Δ :: kanMX </td></tr></tbody></table> الجدول S1: السلالات المستخدمة في هذه الدراسة.

Watch this Scientific Journal Video about Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle at JoVE.com

الفحص المجهري لدورة الحياة الجنسية للخميرة الانشطارية | الأحياء | فيديو

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

المجهر من دورة حياة الجنسية الانشطار الخميرة

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

microscopy-of-fission-yeast-sexual-lifecycle

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Human Biology

Reproduction and Development

SCIENTISTS IN ACTION

14.4K Views.  University of Lausanne. We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process. 

Video: Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

تنقية الميتوكوندريا من خلايا الخميرة

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

أسلوب الخميرة مستعمرة التضمين

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

والفحص المجهري لالإسفار Mitophagy الرصد في الخميرة السكيراء الجعوية

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

شاشة عالية الإنتاجية الخميرة Overexpression البلازميد

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

الجينوم شاشات التنافسية للمكتبات الخميرة Barcoded

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

الكروماتوغرافي تنقية ريبوسوم الخميرة نشطة للغاية

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

الكمية خلية حية الإسفار - المجهري تحليل الخميرة الانشطار

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Fusarium graminearum has become a model system for studies in development and pathogenicity of filamentous fungi. F. graminearum most easily produces fruiting bodies, called perithecia, on carrot agar. Perithecia contain numerous tissue types, produced at specific stages of perithecium development. These include (in order of appearance) formation of the perithecium initials (which give rise to the ascogenous hyphae), the outer wall, paraphyses (sterile mycelia which occupy the center of the perithecium until the asci develop), the asci, and the ascospores within the asci14. The development of each of these tissues is separated by approximately 24 hours and has been the basis of transcriptomic studies during sexual development12,8. Refer to Hallen et al. (2007) for a more thorough description of development, including photographs of each stage. Here, we present the methods for generating and harvesting synchronously developing lawns of perithecia for temporal studies of gene regulation, development, and physiological processes. Although these methods are written specifically to be used with F. graminearum, the techniques can be used for a variety of other fungi, provided that fruiting can be induced in culture and there is some synchrony to development. We have recently adapted this protocol to study the sexual development of F. verticillioides. Although individual perithecia must be hand picked in this species, because a lawn of developing perithecia could not be induced, the process worked well for studying development (Sikhakolli and Trail, unpublished).
The most important function of fungal fruiting bodies is the dispersal of spores. In many of the species of Ascomycota (ascus producing fungi), spores are shot from the ascus, due to the generation of turgor pressure within the ascus, driving ejection of spores (and epiplasmic fluid) through the pore in the ascus tip2,7. Our studies of forcible ascospore discharge have resulted in development of a "spore discharge assay", which we use to screen for mutations in the process. Here we present the details of this assay.
F. graminearum is homothallic, and thus can form fruiting bodies in the absence of a compatible partner. The advantage of homothallism is that crossing is not necessary to generate offspring homozygous for a particular trait, a facet that has facilitated the study of sexual development in this species14,7. However, heterothallic strains have been generated that can be used for crossing5,9. It is also possible to cross homothallic strains to obtain mutants for several genes in one strain1. This is done by coinoculating one Petri dish with 2 strains. Along the meeting point, the majority of perithecia will be recombinant (provided a mutation in one of the parent strains does not inhibit outcrossing). As perithecia age, they exude ascospores en masse instead of forcibly discharging them. The resulting spore exudate (called a cirrhus) sits at the tip of the perithecium and can easily be removed for recovery of individual spores. Here we present a protocol to facilitate the identification of recombinant perithecia and the recovery of recombinant progeny.

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Sexual crosses and isolation of recombinant progeny are important research tools for the filamentous fungus, Fusarium graminearum, The techniques necessary successfully carry out these processes are presented.

الجنسي للتنمية والتفريغ في بوغ زقي فيوزاريوم graminearum</em

Fusarium graminearum has become a model system for studies in development and pathogenicity of filamentous fungi. F. graminearum most easily produces ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

سطح نشر والمناعية من الكروموسومات الخميرة

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and development. Cytokinesis involves a series of events that are well coordinated in time and space. Cytokinesis involves the formation of an actomyosin ring at the division site, followed by ring constriction, membrane furrow formation and extra cellular matrix remodeling. The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe (S.&#160;pombe)&#160;is a well-studied model system that has revealed with substantial clarity the initial events in cytokinesis. However, we do not understand clearly how different cytokinetic events are coordinated spatiotemporally. To determine this, one needs to analyze the different cytokinetic events in great details in both time and in space. Here we describe a microscopy approach to examine different cytokinetic events in live cells. With this approach it is possible to time different cytokinetic events and determine the time of recruitment of different proteins during cytokinesis. In addition, we describe protocols to compare protein localization, and distribution at the site of cell division. This is a basic protocol to study cytokinesis in fission yeast and can also be used for other yeasts and fungal systems.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe&#160;is an excellent model system to study cytokinesis, the final stage in cell division. Here we describe a microscopy approach to analyze different cytokinetic events in live fission yeast cells.

تحليل الزمانية المكانية من Cytokinetic الأحداث في الخميرة الانشطار

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...