وأيد هذا العمل من قبل OTKA (المجرية صندوق البحث العلمي) D45933 ، T049621 ، تيت (المجرية للعلوم والتكنولوجيا) A4/04 ، Arg-17/2006 والخطيئة ، بولياي ، والزمالات Öveges TÁMOP 4.2.2-08 / 1 / KMR - 2008 - 0004 و4.2.1 / B 09/1/KMR-2010-0001. OTKA 83803. نود أن نشكر Gesztes وليام لتوفير الصوت عبر.

1. إعداد الخلايا cardiomyoblast H9c2 وقد تم الحصول على الفئران cardiomyoblasts H9c2 من ATCC (فيسيل ، ألمانيا) ، وتوسعت في ارتفاع نسبة الجلوكوز (4.5 غرام / لتر) DMEM تحتوي على 10 ٪ مصل بقري جنيني ، 4 مم L - الجلوتامين ، 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام الستربتوميسين / مل. مشتق الخلية myoblast H9c2 الخط من قلب الفئران الجنينية ، يتم استخدامه بمثابة نموذج في المختبر لكلا العضلات والهيكل العظمي والقلب 8،9. إعداد 12 لوحة جيدا H9c2 الخلايا : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة مستنبت من طبق بيتري H9c2 من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مرتين مع PBS 5 مل وهضم 2-3 مع التربسين 0.05 ٪ مل / EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان طبق بتري لمدة 5 دقائق في الحاضنة 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمنع التربسين مع 10 مل مستنبت DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار في 1200 دورة في الدقيقة الخلايا لمدة 8 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إزالة طاف ، والخلايا في 1 مل resuspend مستنبت DMEM والخلايا مع عدد عدادة الكريات به التريبان الأزرق تلطيخ.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور 30000 H9c2 الخلايا في DMEM 2 مل لكل بئر في 12 لوحة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة في 37 درجة مئوية حاضنة CO 2 لمدة 24 ساعة. </li></ol> 2. محاكاة نقص التروية / ضخه وكان نقص التروية / ضخه محاكاة في المختبر قبل تنفيذ الحرمان الأوكسجين الجلوكوز (OGD) على الثقافات H9c2 الخلية. تم تنفيذ هذا الإجراء على مسرح المجهر مبائر زايس مع حضانة PeCon نظام الخلية (Erbach ، ألمانيا) السماح للمراقبة من خلال خلايا OGD. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة التي تطلع من 12 لوحة جيدا H9c2 الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضف 3 مل المتوسطة الجلوكوز مجانا لكل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة في الخلية نظام الحضانة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء غاز النيتروجين لتطهير الأوكسجين من نظام الحضانة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتظر حتى يصل إلى مستوى الأكسجين 0.5 ٪ ثم بدء تشغيل الموقت. الأكسجين 0.5 ٪ يعني حوالي 3 ملم زئبقي التوتر الجزئي. تخضع الخلايا إلى 150 دقيقة من نقص التروية المحاكاة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية محاكاة نقص التروية ، وإزالة الجلوكوز المتوسط ​​خالية من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 مل ماصة مستنبت الطبيعي أن الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 12 لوحة مكان جيد لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية حاضنة ثاني أكسيد الكربون 2 ، وهذا هو &quot;فترة ضخه&quot;. </li></ol> 3. إعداد الخلايا الجذعية الوسيطة الانقاذ لقد التقطت نخاع العظام من أصل الإنسان في T75 القوارير والمخففة مع متوسطة Dulbecco في التعديل النسر (DMEM) مستنبت تحتوي على 10 ٪ الجنين العجل المصل (FCS) ، و 100 البنسلين يو / مل و 100 الستربتوميسين ميكروغرام / لتر ، 4 ملم لام الجلوتامين و 1 غرام / لتر غلوكوز. وحضنت والقوارير على 37 درجة مئوية في جو كامل من ثاني مرطب 5 2 ٪ لمدة 3 أيام. بعد فترة حضانة المرض والقضاء على BMSCs انضمت إلى السطح من قوارير والعناصر المتبقية من نخاع العظام من خلال برنامج تلفزيوني مع الغسيل. كانت BMSCs تستخدم ما بين 1 و 5 فقرات في التجارب. في الاتساعوأكد tity من الخلايا وجود نسب محددة علامات سطح الخلية مع التدفق الخلوي. وقد تم التحقيق علامات سطح لدم عدد الأسطر المحددة (CD34 ، CD45) ، وعلامات سطح الوسيطة (CD73 ، CD90 ، وCD105 CD166). خلال محاكاة نقص التروية ، وإعداد الانقاذ الخلايا الجذعية الوسيطة للزرع. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يخفف من صبغة الفلورسنت Vybrant فعلت في نسبة 1:200 في مستنبت DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح متوسطة من خلايا الانقاذ وإضافة 300 DMEM ميكرولتر مع Vybrant فعلت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان طبق بتري لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية حاضنة 2 CO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة مستنبت من طبق بيتري من الخلايا الجذعية الوسيطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مرتين مع PBS 5 مل وهضم 2-3 مع التربسين 0.05 ٪ مل / EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان طبق بتري لمدة 5 دقائق في الحاضنة 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمنع التربسين مع 10 مل مستنبت DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار في 1200 دورة في الدقيقة الخلايا لمدة 8 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إزالة سوبrnatant ، resuspend الخلايا في 1 مل مستنبت DMEM والخلايا مع عدد عدادة الكريات به التريبان الأزرق تلطيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 30 دقيقة على نهاية ضخه إضافة 20000 الخلايا الجذعية الوسيطة لكل بئر لmyoblasts H9c2 تال للإقفار القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شارك في وضع الثقافة من الخلايا إلى 37 درجة مئوية حاضنة CO 2 لمدة 24 ساعة. </li></ol> 4. التحليل المجهري مع مبائر بعد الإصابة نقص التروية / ضخه المحاكاة ، يتم تحضين الخلايا في مستنبت العادي لمدة 24 ساعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار على الخلايا الحية في حل 500 / قتيلا ميكرولتر الصبغة لمدة 30 دقيقة (5 calcein نانومتر و 400 نانومتر إيثيديوم homodimer - 2 - في برنامج تلفزيوني) (5x10 4 خلية / مل). </li></ol> يمكن إجراء تقييم الصور مبائر للخلايا الحية والميتة التي اختارها التشكل ومضان مع برنامج ImageJ (المعاهد الوطنية للصحة ، الولايات المتحدة). في حالة جس الثقافات ، يمكن التمييز بين اللجان الدائمة من خلايا H9c2 بسبب وضع العلامات الخاصة Vybrant هل ​​الخلية. ويمكن تقييم نسبة الخلايا الميتة في 4 مجالات مستقلة عن عرض (الهدف 10X) لكل ثقافة بطريقة عمياء 10. ويمكن أيضا H9c2 cardiomyoblasts مثقف على 42 ملم coverslips الزجاج يتم التحقيق مع مرور الوقت المجهري الفيديو أثناء وبعد نقص التروية / ضخه الاصابة باستخدام نظام حضانة الخلية المجهر متحد البؤر. ويمكن دراسة الخلية الى خلية التفاعلات مثل انصهار الخلية وتشكيل الأنابيب النانوية بين الخلايا مع مرور الوقت. 5. التحليل مع التدفق الخلوي بعد الإصابة نقص التروية / ضخه المحاكاة ، يتم تحضين الخلايا في مستنبت العادي لمدة 24 ساعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة ، والحصاد وسائل الإعلام الثقافة. من المهم جدا لجمع مستنبت أيضا لأن بعض الخلايا الميتة يمكن أن يكون بمعزل عن الثقافة السطحية طبق خلال 24 ساعة incubaنشوئها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني وهضم مع 0.05 ٪ التربسين - EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمنع التربسين مع مستنبت DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار الخلايا والمتوسطة الثقافة في 1200 دورة في الدقيقة المقطوع (حوالي 150 200G) لمدة 8 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق على الخلايا الحية في حل 500 / قتيلا ميكرولتر الصبغة لمدة 30 دقيقة (5 calcein نانومتر و 400 نانومتر إيثيديوم homodimer - 2 - في برنامج تلفزيوني) (5x10 4 خلية / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا إلى أنابيب التدفق الخلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء CellQuest Pro البرمجيات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد لقياس تدفق عداد الكريات ، وإعداد عينات من السيطرة الخلايا الحية والميتة. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة H9c2 الخلايا في كثافة 3x10 4 في 12 لوحات جيدا كما هو موضح في النقطة 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الضوابط خلية حية واحدة مع trypsinisation كما هو موضح في النقطة 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الضوابط الخلية برصاص العلاج مع 10 ميكرومتر H 2 O 2 لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد trypsinisation ، resuspenد يعيش والضوابط خلية ميتة في 500 ميكروليتر محلول الصبغة العيش / قتلى (5 نانومتر calcein - AM و 400 نانومتر إيثيديوم homodimer - 2 - في برنامج تلفزيوني). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينبغي تعديل الصك بغية ضبط الخلايا الحية هي ايجابية وcalcein إيثيديوم homodimer سلبية ، في حين أن الخلايا الميتة هي سلبية وcalcein إيثيديوم homodimer إيجابية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن التعبير عن النسبة المئوية لسكان تلك المناطق كما لا يمكن أن يؤديها الحانات في الرسم البياني والتحليل الإحصائي على هذه القيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس مختلف المجموعات التجريبية. </li></ol> 6. ممثل النتائج : وأظهرت النتائج أن لدينا وأضاف الخلايا الجذعية الوسيطة يمكن أن يحسن البقاء على قيد الحياة من خلايا القلب تال للإقفار. وكشفت الصور المجهري مبائر مباشرة من خلية إلى خلية التفاعل ، مثل اتصال الغشاء الجزئي أو نانوتيوب بين الخلايا ، التي تلعب على الارجح دورا هاما في حماية احظ 10. هذه الألياف تمتد عبر مسافات د الخلية عدةوكانت iameters ، وبأقطار ما بين 200 و 500 نانومتر (السهام البيضاء). <img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. تشكيل أنابيب بين الخلايا. وحظ تشكيل الأنابيب الجزيئية (أبيض السهم) بين cardiomyoblasts ديو Vybrant وصفت وصفت Vybrant هل الخلايا الجذعية الوسيطة. وأظهر تحليل التدفق الخلوي للسكان بالبقاء على قيد الحياة وcardiomyoblasts نخرية والخلايا الجذعية الوسيطة. ومن المثير للاهتمام ، لاحظنا أيضا خلية cardiomyoblast الثالثة ، &#39;جرح&#39; السكان الذي يتضمن calcein لكن الوارد أيضا مؤشر على الخلايا الميتة ، إيثيديوم homodimer (الشكل 2). <img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. ممثل الدوت مؤامرة من السكان مختلفة من الخلايا بعد إقفار المحاكاة. تقييم تجارب عدة شوالأربعاء أنه إضافة إلى الخلايا الجذعية الوسيطة cardiomyoblast H9c2 تال للإقفار زيادة كبيرة في نسبة الخلايا الحية مقارنة myoblasts القلب المثقف وحده ، بعد نقص التروية (الشكل 3). <img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. وخفضت بشكل كبير من تأثير العلاج على الخلايا الجذعية cardiomyoblasts تال للإقفار النسبة المئوية للنقص تروية الخلايا الحية بعد مقارنة محاكاة للتحكم (عنصر تحكم نموذج مقابل IR : 90.36 ± 2.60 مقابل 10.52 ± 0.48 *** P&gt; 0.001). والتي زادت بعد إضافة الخلايا الجذعية الوسيطة (IR الأشعة تحت الحمراء + نموذج مقابل BMSC : 10.52 ± 0.48 مقابل 25.21 ± 2.13 ، *** P&gt; 0.001). تمثل البيانات يعني ± SEM. وأجري التحليل الإحصائي للبيانات باستخدام الخروج في اتجاه واحد تحليل التباين مع آخر توكي في المقارنة متعددة مخصصة اختبار.

<ol>
	<li>Dimmeler, S., Burchfield, J., Zeiher, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Based+Therapy+of+Myocardial+Infarction.">Cell-Based Therapy of Myocardial Infarction.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28, (2008).</li><li>Kim, S. U., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-based+cell+therapy+in+neurological+diseases:+A+review.">Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: A review.</a> Journal of Neuroscience Research. 87, 2183-21 (2009).</li><li>Lee, K., Chan, C. K., Patil, N., Goodman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+for+bone+regeneration-Bench+to+bedside.">Cell therapy for bone regeneration-Bench to bedside.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 89, 252-25 (2009).</li><li>Gaipa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GMP-based+CD133++cells+isolation+maintains+progenitor+angiogenic+properties+and+enhances+standardization+in+cardiovascular+cell+therapy.">GMP-based CD133+ cells isolation maintains progenitor angiogenic properties and enhances standardization in cardiovascular cell therapy.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14, 1619-1619 (2010).</li><li>Trounson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+perspectives+in+human+stem+cell+therapeutic+research.">New perspectives in human stem cell therapeutic research.</a> BMC medicine. 7, 29-29 (2009).</li><li>Mazhari, R., Hare, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+action+of+mesenchymal+stem+cells+in+cardiac+repair:+potential+influences+on+the+cardiac+stem+cell+niche.">Mechanisms of action of mesenchymal stem cells in cardiac repair: potential influences on the cardiac stem cell niche.</a> Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, S21-S21 (2007).</li><li>Kimes, B. W., Brandt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+a+clonal+muscle+cell+line+from+rat+heart.">Properties of a clonal muscle cell line from rat heart.</a> Experimental Cell Research. 98, 367-367 (1976).</li><li>Sardao, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+imaging+of+H9c2+myoblasts+exposed+to+tert-butylhydroperoxide--characterization+of+morphological+features+of+cell+death.">Vital imaging of H9c2 myoblasts exposed to tert-butylhydroperoxide--characterization of morphological features of cell death.</a> BMC Cell Biol. 8, 11-11 (2007).</li><li>Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological,+biochemical,+and+electrophysiological+characterization+of+a+clonal+cell+(H9c2)+line+from+rat+heart.">Morphological, biochemical, and electrophysiological characterization of a clonal cell (H9c2) line from rat heart.</a> Circulation research. 69, 1476-1476 (1991).</li><li>Cselenyak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+rescue+cardiomyoblasts+from+cell+death+in+an+in+vitro+ischemia+model+via+direct+cell-to-cell+connections.">Mesenchymal stem cells rescue cardiomyoblasts from cell death in an in vitro ischemia model via direct cell-to-cell connections.</a> BMC Cell Biol. 11, 29-29 (2010).</li><li>Sauvant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+an+in+vitro+model+system+for+investigation+of+reperfusion+damage+after+renal+ischemia.">Implementation of an in vitro model system for investigation of reperfusion damage after renal ischemia.</a> Cell Physiol Biochem. 24, 567-567 (2009).</li><li>Namas, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-Induced+Overexpression+of+BNIP3+is+Not+Dependent+on+Hypoxia-Inducible+Factor+1alpha+in+Mouse+Hepatocytes.">Hypoxia-Induced Overexpression of BNIP3 is Not Dependent on Hypoxia-Inducible Factor 1alpha in Mouse Hepatocytes.</a> Shock. 36, 196-196 (2011).</li><li>Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia/Reoxygenation+Up-Regulated+the+Expression+of+Death+Receptor+5+and+Enhanced+Apoptosis+in+Human+Hepatocyte+Line.">Hypoxia/Reoxygenation Up-Regulated the Expression of Death Receptor 5 and Enhanced Apoptosis in Human Hepatocyte Line.</a> Transplantation Proceedings. 38, 2207-2207 (2006).</li><li>Meloni, B. P., Meade, A. J., Kitikomolsuk, D., Knuckey, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+neuronal+cell+death+in+acute+and+delayed+in+vitro+ischemia+(oxygen-glucose+deprivation)+models.">Characterisation of neuronal cell death in acute and delayed in vitro ischemia (oxygen-glucose deprivation) models.</a> Journal of Neuroscience Methods. 195, 67-67 (2011).</li><li>Mimeault, M., Hauke, R., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells:+a+revolution+in+therapeutics--recent+advances+in+stem+cell+biology+and+their+therapeutic+applications+in+regenerative+medicine+and+cancer+therapies.">Stem cells: a revolution in therapeutics--recent advances in stem cell biology and their therapeutic applications in regenerative medicine and cancer therapies.</a> Clinical Pharmacology &#38; Therapeutics. 82, 252-252 (2007).</li><li>Angoulvant, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+conditioned+media+attenuates+in+vitro+and+ex+vivo+myocardial+reperfusion+injury.">Mesenchymal stem cell conditioned media attenuates in vitro and ex vivo myocardial reperfusion injury.</a> J Heart Lung Transplant. 30, 95-95 (2010).</li><li>Lim, Y. J., Zheng, S., Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphine+Preconditions+Purkinje+Cells+against+Cell+Death+under+In+Vitro+Simulated+Ischemia/Reperfusion+Conditions.">Morphine Preconditions Purkinje Cells against Cell Death under In Vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Conditions.</a> Anesthesiology. 100, 562-562 (2004).</li><li>Guo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-receptor-mediated+protection+of+cerebral+endothelial+cell+viability+and+mitochondrial+function+after+ischemic+insult+in+vitro.">Estrogen-receptor-mediated protection of cerebral endothelial cell viability and mitochondrial function after ischemic insult in vitro.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 30, 545-545 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

البروتوكول هو أظهر في النهج المختبر لقضية أكثر تعقيدا بكثير من العلاج بالخلايا الجذعية في عضلة القلب احتشاء ، مع مزايا وعيوب كل نموذج من هذا القبيل. من الواضح أنه لا يمكن تعكس المعقدة (المناعية مثلا) الأحداث التي تجري خلال احتشاء عضلة القلب ، وبعد ولكن يمكن التركيز على الآثار المباشرة للخلايا واضاف تال للإقفار على الخلايا. آثار نقص التروية في محاكاة H9c2 cardiomyoblasts تعتمد بشكل كبير على وقت OGD ، على عدد من الخلايا مرور المستخدمة وعلى تركيز 2 O. لا بد من ضبط هذه المعايير بدقة وايجاد الظروف المثلى للحصول على نوع من الخلايا معينة من أجل الحصول على بروتوكول موحد. بعد ذلك ، يمكن استخدام البروتوكول في العديد من الطرق (الكلى ، الكبد أو نقص تروية الدماغ / ضخه 11،12،13،14) للتحقيق في الآثار المترتبة على مختلف أنواع الخلايا المضافة مثل الخلايا الجذعية الجنينية ، الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة أو خلايا جذعية للبالغين 15 ، هffectiveness المتوسطة مكيفة 16 أو المعالجة المسبقة مختلف 17،18 أو أي معلمة في بؤرة الاهتمام.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> calcein - AM </td><td> المسابر الجزيئية </td><td> L3224 ، C3099 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr><tr><td> إيثيديوم homodimer - 2 </td><td> المسابر الجزيئية </td><td> L3224 ، E3599 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr><tr><td> هل Vybrant </td><td> المسابر الجزيئية </td><td> V22887 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr></tbody></table> الجدول 1. الكواشف. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم المعدات </td><td> شركة </td><td> تعليق (اختياري) </td></tr><tr><td> PeCon نظام حضانة للخلية المجاهر زايس </td><td> PeCon محدودة </td><td> <a href="http://www.pecon.biz/">www.pecon.biz/</a> </td></tr></tbody></table> الجدول 2. تجهيزات.

stem cell transplantation in an in vitro simulated ischemia/reperfusion model

بروتوكولات زرع الخلايا الجذعية تجد طريقها إلى الممارسة السريرية 1،2،3. الحصول على أفضل النتائج ، مما يجعل من البروتوكولات أكثر قوة ، وإيجاد مصادر جديدة للخلايا زرع هي محور الأبحاث الحديثة 4،5. التحقيق في فعالية العلاج بالخلايا ليست مهمة سهلة وهناك حاجة إلى أدوات جديدة للتحقيق في الآليات التي تشارك في عملية المعالجة 6. صممنا على بروتوكول التجريبي لنقص التروية / ضخه من أجل السماح للمراقبة الاتصالات الخلوية وآليات التحت خلوية حتى أثناء نقص التروية / ضخه الاصابة وبعد زرع الخلايا الجذعية ، وتقييم مدى فعالية العلاج بالخلايا. ووضعت الخلايا cardiomyoblast H9c2 على لوحات ثقافة الخلية 7،8. وكان نقص التروية محاكاة مع 150 دقيقة في المتوسط ​​الجلوكوز الحرة مع مستوى الاوكسجين أقل من 0.5 ٪. ثم ، أعيد إحياء وسائل الاعلام العادية ومستويات الأكسجين إلى محاكاة ضخه. بعد الحرمان من الأوكسجين الجلوكوز ،تم علاج الخلايا التالفة مع زرع النخاع العظمي المسمى حقوق الإنسان مستمد الخلايا الجذعية الوسيطة عن طريق إضافتها إلى الثقافة. ويفضل الخلايا الجذعية الوسيطة في التجارب السريرية لأنها متاحة بسهولة مع الحد الأدنى من الجراحة ، يمكن أن تتوسع بسهولة وذاتي. بعد 24 ساعة من زراعة المشتركة ، تم صبغ الخلايا مع calcein وإيثيديوم homodimer إلى التفريق بين الخلايا الحية والميتة. يسمح لنا هذا الإعداد للتحقيق في الاتصالات بين الخلايا باستخدام المجهر الفلورسنت مبائر ولقياس معدل البقاء على قيد الحياة من خلايا تال للإقفار بواسطة التدفق الخلوي. وأظهر الفحص المجهري مبائر التفاعلات بين السكان الخلية اثنين من الممثلين والانصهار وتشكيل خلية من الأنابيب النانومترية بين الخلايا. وكشف تحليل التدفق الخلوي 3 مجموعات من الخلايا التالفة والتي يمكن رسم على رسم بياني وتحليلها إحصائيا. ويمكن تحقيق هذه التجمعات السكانية بشكل منفصل والاستنتاجات التي يمكن استخلاصها من هذه البيانات على فعالية محاكاةالعلاجية النهج.

Watch this Scientific Journal Video about Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model at JoVE.com

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

نحن لشرح كيفية انشاء<em&gt; في المختبر</em&gt; نقص التروية / ضخه النموذجية وكيفية تقييم تأثير العلاج بالخلايا الجذعية على خلايا القلب تال للإقفار.

زرع الخلايا الجذعية في في المختبر مقلد نقص التروية / إعادة إشباع الخلايا النموذجي

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

stem-cell-transplantation-an-vitro-simulated-ischemiareperfusion

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

14.0K Views.  Semmelweis University. نحن لشرح كيفية انشاء في المختبر نقص التروية / ضخه النموذجية وكيفية تقييم تأثير العلاج بالخلايا الجذعية على خلايا القلب تال للإقفار.

Video: Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

جيل ومسمار سفن الهندسة الأنسجة في نموذج الفأر

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Bioengineering

Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ischemia, when the blood supply and therefore oxygen is decreased to the intestine. This leads to intestinal barrier loss and damage to the underlying tissue. Intestinal stem cells reside at the base of the crypts of Lieberk&#252;hn and are responsible for intestinal renewal during homeostasis and following injury. Ex vivo cell culture techniques have allowed for the successful study of epithelial stem cell interactions by establishing culture conditions that support the growth of three-dimensional epithelial organ-like systems (termed "enteroids" and "colonoids" from the small and large intestine, respectively). These enteroids are composed of crypt and villus-like domains and mature to contain all of the cell types found within the epithelium. Historically, murine models have been utilized to study intestinal injury. However, a porcine model offers several advantages including similarity of size as well as gastrointestinal anatomy and physiology to that of humans. By utilizing a porcine model, we establish a protocol in which segmental loops of intestinal ischemia can be created within a single animal, enabling the study of differing time points of ischemic injury and repair in vivo. Additionally, we describe a method to isolate and culture the intestinal stem cells from the ischemic loops of intestine, allowing for the continued study of epithelial repair, modulated by stem cells, ex vivo.

This protocol will enable readers to successfully establish a porcine model of segmental intestinal ischemia and subsequently isolate and culture intestinal stem cells for the study of epithelial repair following injury.

عزل الخلايا الجذعية المعوية والثقافة في نموذج الخنزير من المجزأ الاسكيمية الأمعاء الصغيرة

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ...

Two-vessel Occlusion Mouse Model of Cerebral Ischemia-reperfusion

In this study, a middle cerebral artery (MCA) occlusion mouse model is employed to study cerebral ischemia-reperfusion. A reproducible and reliable mouse model is useful for investigating the pathophysiology of cerebral ischemia-reperfusion and determining potential therapeutic strategies for patients with stroke. Variations in the anatomy of the circle of Willis of C57BL/6 mice affects their infarct volume after cerebral-ischemia-induced injury. Studies have indicated that distal MCA occlusion (MCAO) can overcome this problem and result in a stable infarct size. In this study, we establish a two-vessel occlusion mouse model of cerebral ischemia-reperfusion through the interruption of the blood flow to the right MCA. We distally ligate the right MCA and right common carotid artery (CCA) and restore blood flow after a certain period of ischemia. This ischemia-reperfusion injury induces an infarct of stable size and a behavioral deficit. Peripheral immune cells infiltrate the ischemic brain within the 24 h infiltration period. Additionally, the neuronal loss in the cortical area is less for a longer reperfusion duration. Therefore, this two-vessel occlusion model is suitable for investigating the immune response and neuronal recovery during the reperfusion period after cerebral ischemia.

A mouse model of cerebral ischemia-reperfusion is established to investigate the pathophysiology of stroke. We distally ligate the right middle cerebral artery and right common carotid artery and restore blood flow after 10 or 40 min of ischemia.

انسداد السفينتين الماوس النموذجي لضخه الاسكيمية الدماغي

In this study, a middle cerebral artery (MCA) occlusion mouse model is employed to study cerebral ischemia-reperfusion. A reproducible and reliable mouse ...

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent neuronal loss. Numerous evidence suggests that the interaction between glial and neuronal cells exert beneficial effects after an ischemic event. Therefore, to explore potential protective mechanisms, it is important to develop models that allow studying neuron-glia interactions in an ischemic environment. Herein we present a simple approach to isolate astrocytes and neurons from the rat embryonic cortex, and that by using specific culture media, allows the establishment of neuron- or astrocyte-enriched cultures or neuron-glia cultures with high yield and reproducibility.
To study the crosstalk between astrocytes and neurons, we propose an approach based on a co-culture system in which neurons cultured in coverslips are maintained in contact with a monolayer of astrocytes plated in multiwell plates. The two cultures are maintained apart by small paraffin spheres. This approach allows the independent manipulation and the application of specific treatments to each cell type, which represents an advantage in many studies.
To simulate what occurs during an ischemic stroke, the cultures are subjected to an oxygen and glucose deprivation protocol. This protocol represents a useful tool to study the role of neuron-glia interactions in ischemic stroke.

Here, we present a simple approach using specific culture media that allows the establishment of neuron- and astrocyte-enriched cultures, or neuron-glia cultures from the embryonic cortex, with high yield and reproducibility.

نموذج ثقافة الخلية لدراسة دور التفاعلات العصبية-غليا في الإقفاري

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

Neuroscience

Pre-clinical Model of Cardiac Donation after Circulatory Death

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after circulatory death (DCD) is a solution to address this limited availability, but due to a period of prolonged warm ischemia and the risk of tissue injury, its routine use in cardiac transplantation is seldom seen. In this manuscript we provide a detailed protocol closely mimicking current clinical practices in the context of DCD with continuous monitoring of heart function, allowing for the evaluation of novel cardioprotective strategies and interventions to decrease ischemia-reperfusion injury.
In this model, the DCD protocol is initiated in anesthetized Lewis rats by stopping ventilation to induce circulatory death. When systolic blood pressure drops below 30 mmHg, the warm ischemic time is initiated. After a pre-set warm ischemic period, hearts are flushed with a normothermic cardioplegic solution, procured, and mounted onto a Langendorff ex vivo heart perfusion system. Following 10 min of initial reperfusion and stabilization, cardiac reconditioning is continuously evaluated for 60 min using intraventricular pressure monitoring. A heart injury is assessed by measuring cardiac troponin T and the infarct size is quantified by histological staining. The warm ischemic time can be modulated and tailored to develop the desired amount of structural and functional damage. This simple protocol allows for the evaluation of different cardioprotective conditioning strategies introduced at the moment of cardioplegia, initial reperfusion and/or during ex vivo perfusion. Findings obtained from this protocol can be reproduced in large models, facilitating clinical translation.

This protocol shows a simple and flexible approach for the evaluation of new conditioning agents or strategies to increase the feasibility of cardiac donation after circulatory death.

نموذج ما قبل السريرية للتبرع القلبي بعد الوفاة الدورة الدموية

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after ...

A Pre-clinical Rat Model for the Study of Ischemia-reperfusion Injury in Reconstructive Microsurgery

Ischemia-reperfusion injury is the main cause of flap failure in reconstructive microsurgery. The rat is the preferred preclinical animal model in many areas of biomedical research due to its cost-effectiveness and its translation to humans. This protocol describes a method to create a preclinical free skin flap model in rats with ischemia-reperfusion injury. The described 3 cm x 6 cm rat free skin flap model is easily obtained after the placement of several vascular ligatures and the section of the vascular pedicle. Then, 8 h after the ischemic insult and completion of the microsurgical anastomosis, the free skin flap develops the tissue damage. These ischemia-reperfusion injury-related damages can be studied in this model, making it a suitable model for evaluating therapeutic agents to address this pathophysiological process. Furthermore, two main monitoring techniques are described in the protocol for the assessment of this animal model: transit-time ultrasound technology and laser speckle contrast analysis.

Here, we describe a pre-clinical animal model for studying the pathophysiology of ischemia-reperfusion injury in reconstructive microsurgery. This free skin flap model based on the superficial caudal epigastric vessels in the rat may also allow for the evaluation of different therapies and compounds to counteract ischemia-reperfusion injury-related damage.

نموذج الفئران قبل السريرية لدراسة نقص التروية-ضخ الاصابه في جراحه المجهرية الترميمية

Ischemia-reperfusion injury is the main cause of flap failure in reconstructive microsurgery. The rat is the preferred preclinical animal model in many ...

Delayed Intramyocardial Delivery of Stem Cells after Ischemia Reperfusion Injury in a Murine Model

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, cardiac stem cell therapy is studied by delivering SCs concurrently with the induction of myocardial injury. However, this approach presents two significant limitations: the early hostile pro-inflammatory ischemic environment may affect the survival of transplanted SCs, and it does not represent the subacute infarction scenario where SCs will likely be used. Here we describe a two-part series of surgical procedures for the induction of ischemia-reperfusion injury and delivery of mesenchymal stem cells (MSCs). This method of stem cell administration may allow for the longer viability and retention around damaged tissue by circumventing the initial immune response. A model of ischemia reperfusion injury was induced in mice accompanied by the delivery of mesenchymal stem cells (3.0 x 105), stably expressing the reporter gene firefly luciferase under the constitutively expressed CMV promoter, intramyocardially 7 days later. The animals were imaged via ultrasound and bioluminescent imaging for confirmation of injury and injection of cells, respectively. Importantly, there was no added complication rate when performing this two-procedure approach for SC delivery. This method of stem cell administration, collectively with the utilization of state-of-the-art reporter genes, may allow for the in vivo study of viability and retention of transplanted SCs in a situation of chronic ischemia commonly seen clinically, while also circumventing the initial pro-inflammatory response. In summary, we established a protocol for the delayed delivery of stem cells into the myocardium, which can be used as a potential new approach in promoting regeneration of the damaged tissue.

Stems cells are continuously investigated as potential treatments for individuals with myocardial damage, however, their decreased viability and retention within injured tissue can impact their long-term efficacy. In this manuscript we describe an alternative method for stem cell delivery in a murine model of ischemia reperfusion injury.

تأخر التسليم داخل القلب للخلايا الجذعية بعد إصابة إعادة ضخ الإقفاري في نموذج مورين

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, ...

Organ Ischemia-Reperfusion Injury by Simulating Hemodynamic Changes in Rat Liver Transplant Model

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, including ischemia-reperfusion injury (IRI) of extrahepatic organs. This model requires numerous experiments and devices. The duration of anhepatic phase is closely related to the time to develop IRI after transplantation. In this experiment, we used hemodynamic changes to induce extrahepatic organ damage in rats and determined the maximum tolerance time. The time until the most severe organ injury varied for different organs. This method can easily be replicated and can also be used to study IRI of the extrahepatic organs after liver transplantation.

This paper provides a detailed description of how to build an animal model of the anhepatic phase (liver ischemia) in rats to facilitate basic research into ischemia-reperfusion injury after liver transplantation.

إصابة الجهاز الإقصاب الإقفاري-Reperfusion عن طريق محاكاة التغيرات الديناميكية الدموية في نموذج زراعة كبد الفئران

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, ...

A Heterotopic Rat Heart Transplantation Model using Circulatory Death Donor Hearts

The objective of this protocol is to set up a rat heterotopic heart transplantation model with donation after circulatory death (DCD) donor hearts. There are two setups for this protocol: heart donor setup and recipient setup. In the heart donor setup, Sprague Dawley rats are anesthetized, endotracheally intubated, and ventilated. The right carotid artery is cannulated to deliver heparin and the paralytic agent vecuronium-bromide. The DCD process is initiated by terminating the ventilation. After 20 min, the heart is exposed and the aorta distal to the brachiocephalic branch is clamped. At 25 min from terminating the ventilator, ice-cold University of Wisconsin (UW) solution is perfused through the carotid catheter to flush the heart. The heart is procured by dividing the aorta, pulmonary artery, venae cavae, and pulmonary veins and stored in UW solution for implantation. In the recipient setup, the Lewis rat is anesthetized with isoflurane. Slow-release buprenorphine is administered subcutaneously to facilitate a smooth postoperative recovery. Through a midline abdominal incision, the infra-renal aorta and the inferior vena cava are isolated and clamped with an atraumatic vascular clamp. The donor heart aorta and pulmonary artery are sutured to the recipient abdominal aorta and vena cava, respectively, with a running 8-0 Prolene. The vascular clamp is removed to reperfuse the heart. The abdominal wall is closed and the rat is recovered. After a set interval (24 h to 2 weeks), the recipient rat is anesthetized, the transplanted heart is exposed, and a balloon-tip-catheter is inserted into the left ventricle via the apex to record developed pressure and dP/dt using a data acquisition system. The heart tissue is collected for histology, immunology, or molecular analysis. A successful DCD donor rat heart transplantation model will allow further studies on the cardioprotective approaches to improve heart transplantation outcomes from DCD donors.

Here, we describe the preparation and technical details of murine heterotopic heart transplantation utilizing a circulatory death donor heart.

The objective of this protocol is to set up a rat heterotopic heart transplantation model with donation after circulatory death (DCD) donor hearts. There ...

Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

Ischemic heart disease is the leading cause of death and disability worldwide. Reperfusion causes additional injury beyond ischemia. Endothelial cells (ECs) can protect cardiomyocytes (CMs) from reperfusion injury through cell-cell interactions. Co-cultures can help investigate the role of cell-cell interactions. A mixed co-culture is the simplest approach but is limited as isolated treatments and downstream analyses of single cell types are not feasible. To investigate whether ECs can dose-dependently attenuate CM cell damage and whether this protection can be further optimized by varying the contact distance between the two cell lines, we used Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells and Adult Mouse Cardiomyocytes to test three types of cell culture inserts which varied in their inter-cell layer distance at 0.5, 1.0, and 2.0 mm, respectively. In CMs-only, cellular injury as assessed by lactate dehydrogenase (LDH) release increased significantly during hypoxia and further upon reoxygenation when the distance was 2.0 mm compared to 0.5 and 1.0 mm. When ECs and CMs were in nearly direct contact (0.5 mm), there was only a mild attenuation of the reoxygenation injury of CMs following hypoxia. This attenuation was significantly increased when the spatial distance was 1.0 mm. With 2.0 mm distance, ECs attenuated CM injury during both hypoxia and hypoxia/reoxygenation, indicating that sufficient culture distancing is necessary for ECs to crosstalk with CMs, so that secreted signal molecules can circulate and fully stimulate protective pathways. Our findings suggest, for the first time, that optimizing the EC/CM co-culture spatial environment is necessary to provide a favorable in vitro model for testing the role of ECs in CM-protection against simulated ischemia/reperfusion injury. The goal of this report is to provide a step-by-step approach for investigators to use this important model to their advantage.

Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

Spatial distance is a key parameter in assessing hypoxia/reoxygenation injury in a co-culture model of separate endothelial and cardiomyocyte cell layers, suggesting, for the first time, that optimizing the co-culture spatial environment is necessary to provide a favorable in vitro model for testing the role of endothelial cells in cardiomyocyte protection.

تطوير نموذج الزراعة المشتركة للخلايا لمحاكاة نقص تروية القلب / التروية في المختبر

Ischemic heart disease is the leading cause of death and disability worldwide. Reperfusion causes additional injury beyond ischemia. Endothelial cells ...