وكان هذا المشروع الدعم من K01OD0199 المعاهد الوطنية للصحة، والمعاهد الوطنية للصحة T32 OD011130، P30DK034987 المعاهد الوطنية للصحة، وقسم العلوم السريرية نشر الأموال

لهذه التجارب، وقد أقر جميع الدراسات الحيوانية "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة ولاية كارولينا الشمالية.
1-التحضير للثقافة
ملاحظة: يتم سرد كافة الكواشف في الجدول للمواد. تركيزات عامل النمو محددة مدرجة في الجدول 1.
<ol><li>إعداد حل حمض (يدتا) الإيثيلين 0.5 متر في المياه المقطرة (ddH2س). مزيج كاف وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 استخدام محاليل هيدروكسيد الصوديوم و/أو HCl. ملاحظة: تشكل الحل الأسهم يدتا جديدة قبل كل تجربة.</li>
	<li>إعداد كاشف تفارق #1 (الدكتور #1) على النحو التالي ووضع على الجليد: الفوسفات الجمع مخزنة المالحة دون Ca2 + و Mg2 + (PBS)، 0.5 م يدتا، 1 م 1، 4-ديثيوثريتول (DTT)، 10 ميكرون Y27632 والحل س مضاد حيوي فطري 1 (مكافحة المضادة) تتضمن البنسلين والستربتوميسين والامفوتريسين باء ملاحظة: إضافة Y27632 قبل جمع الأنسجة مباشرة.</li>
	<li>إعداد كاشف تفارق #2 (الدكتور #2) على النحو التالي ووضع في حمام مائي 37 درجة مئوية: "الجمع بين برنامج تلفزيوني" دون Ca2 + و Mg2 +، يدتا 0.5 متر، 10 ميكرون Y27632 والمضادة لمكافحة س 1. ملاحظة: إضافة Y27632 قبل جمع الأنسجة مباشرة.</li>
	<li>تعد الخلايا الجذعية الظهارية المعوية (إيسك) وسائط الإعلام على النحو التالي: ميكس 25 مل متقدمة متوسطة DMEM/F12 مع الملحق X N2 1، الملحق 1 X B-27، 10 مم حبيس، 2 مم جلوتاماكس والمضادة لمكافحة س 1. تخزين في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.</li>
	<li>إعداد مزيج رئيسي لانخفاض النمو عامل الغشاء مصفوفة (مصفوفة) وعوامل النمو الإضافي كما يلي: ذوبان الجليد المصفوفة على الجليد. في أنبوب ميكروسينتريفوجي، إضافة 100 نانوغرام/مليلتر رأس الإنسان المؤتلف، 500 نانوغرام/مليلتر المؤتلف 1 R-سبوندين البشرية، 50 نانوغرام/مل الماشوب البشري البشرة عامل النمو (لو)، 100 نانوغرام/مل Wnt3a البشري المؤتلف، 10 مم نيكوتيناميد، 10 نانومتر جاسترين، 500 نانومتر A-83-01، 10 ميكرون Y-27632 ، 10 مم SB202190، 500 نانومتر LY2157299 و 2.5 ميكرون الجليكوجين synthase كيناز 3 المانع (GSK3i، CHIR99021). عندما يتم إذابة المصفوفة، مع استكمال هذا المزيج عامل النمو (صنع مزيج الرئيسي) وتخزينها على الجليد. ملاحظة: كن حذراً لتجنب إدخال فقاعات الهواء كما سيؤدي هذا إلى إنشاء قطعة أثرية داخل باتي مصفوفة أثناء الطلاء.</li>
	<li>قبل الحارة طبق استنبات الأنسجة 24-جيدا في حاضنة 37 درجة مئوية قبل البدء بإجراءات عزل الخلية.</li>
</ol>2-الجراحي النموذجي الاسكيمية، وجمع الأنسجة
<ol><li>نيوزيلند استخدام ثمانية إلى يوركشاير عمرها عشر الأسبوع الخنازير من أي من الجنسين (مستحسن). قم بإزالة جميع الأعلاف ح 16-18 قبل الجراحة. تسمح الخنازير للحصول على المياه في جميع الأوقات.</li>
	<li>جدولة الخنازير يصل إلى مالا يقل عن 48 ساعة قبل التجارب للسماح للتأقلم البيئي. ملاحظة: توفير فنيين مدربين في الطب البيطري و/أو المختبر تحت إشراف طبيب بيطري مرخص الرعاية الحيوانية الروتينية والمساعدة مع إجراءات مخدر.</li>
	<li>بريميديكاتي الخنزير مع إكسيلازيني (1.5 مغ/كغ عضليا (IM)) والكيتامين (11-20 مغ/كغ (IM))15. وبمجرد وقور، التنبيب أوروتراتشيلي خنزير.</li>
	<li>الحفاظ على الخنازير تحت التخدير العام مع إيسوفلوراني (2-5%) ويتبخر في 100% O2 حتى وقت القتل الرحيم.</li>
	<li>ضع قسطرة (رابعا) عن طريق الحقن الوريدي (الوريد الإذن الموصى بها) وإدارة سوائل استبدال مثل الحل قارعو الأجراس لاكتاتيد صيانة بمعدل 15 مل/كغ/ساعة.</li>
	<li>إجراء روتيني مخدر الرصد بما في ذلك pulse oximetry وكهربيه و قياسات ضغط الدم غير المباشرة15. رصد معدل التنفس للخنزير والجهد ويحققوا يدوياً أو آليا حسب الحاجة إذا كان نهاية المد CO2 ترتفع إلى 55-60 مم زئبق. ملاحظة: التخدير المناسبة ويتأكد من الرصد المستمر للاتجاهات في معدل ضربات القلب (مجموعة 80-130 نبضة/دقيقة)، وضغط الدم غير الغازية (يعني الضغط الشرياني 75-100 مم زئبق)، ومعدل التنفس (10-25 نفسا/دقيقة)16، والتدقيق الدوري لعدم وجود فكه ولهجة الشرج. يمكن أيضا الحكم على عمق التخدير بدرجة استرخاء العضلات وتليف العضلات بعد التحفيز الجراحية. عادة ما تكون ردود الفعل العين من لا قيمة16. ويمكن توفير التسكين حسب توجيهات السياسة IACUC المؤسسات. وفي هذه الحالة، يمكن أن تدار شبائه الأفيون، مثل البوبرينورفين، أثناء الجراحة.</li>
	<li>مكان في الخنزير على وسادة تدفئة وكبح جماح في ريكومبينسي الظهرية للعملية الجراحية.</li>
	<li>يحلق في البطن البطني والإعدادية باستخدام فرك الجراحية (محلول الكلورهيكسيدين) وكحول الأيزوبروبيل.</li>
	<li>جعل شق 8-10-سم البطني خط الوسط باستخدام شفرة المبضع تركزت في السرة للوصول إلى البطن.</li>
	<li>تحديد الفم الأمعاء (صائم) حوالي 40 سم إلى مفترق اللفائفيه. تحدد سم عشرة حلقات طويلة من صائم قبل circumferentially ligating الأمعاء مرتين، سم واحد بين كل حرف مزدوج، قبل إنشاء لاحقة حلقات 10 سم يقع شفويا (الشكل 1).</li>
	<li>إنشاء اثنين من الحلقات كل نقطة الوقت من الاسكيمية المجاورة لبعضها البعض، وواحدة الاسكيمية، وواحد الاسكيمية مع ح 1 إضافية من ضخه إذا رغبت في ذلك. لإنشاء الاسكيمية كاملة (أي تدفق للشرايين أو الأوردة)، المشبك أو سد المفرج المساريقي العلوي استخدام المشابك لدغ الأوعية الدموية أو منحنية هالستد البعوض هيموستاتس الحرير غير الامتصاص 2-0 ل 1، 2، 3 و 4 ح ومن ثم إزالة المشابك ح 1 من ضخه، إذا رغبت في ذلك. ملاحظة: الكتاب تم إنشاؤها جميع الحلقات من الاسكيمية بالترتيب بدءاً بحلقة الدماغية ح 4 وتقدم نقل بروكسيمالي (لتقليل وقت جراحة الكلي). للتصدي لإمكانية أن قطاعات الأمعاء الدماغية المجاورة قد تتلف الحلقات المتاخمة، يمكن أن تختلف ترتيب الحلقات الدماغية. وهذا قد يغير إجمالي الوقت الجراحية. ملاحظة: الإطار الزمني لضخه يمكن أن تختلف استناداً إلى البحوث مسألة الفائدة أو إذا كانت العلاجات ترغب في اختبارها خلال فترة ضخه. بيد تلف الأنسجة يصبح أكثر شدة من زيادة مدد الاسكيمية وحدها، ضخه الضرر المحتمل لا يسهم في زيادة الإصابة الظهارية. ضخه المرجح أن تقوم بدور عقب فترات معتدلة من الإصابات الدماغية.</li>
	<li>الفترات الفاصلة بين النقاط الزمنية الاسكيمية، الحفاظ على البطن تغطيتها أو إغلاق باستخدام منشفة عقيمة و/أو المشبك منشفة. ملاحظة: داخل حيوان وحيد لهذه التجربة، يمكن إنشاء ثمانية قطاعات الدماغية. تحديد جزء jejunal إضافية، على الأقل 5-10 سم الدانية إلى آخر حلقة الدماغية، التي ستكون بمثابة رقابة داخلية عادية.</li>
	<li>تعرقل حوالي ثلاث سفن المساريقي العلوي كل لدغ المشبك الأوعية الدموية أو منحنية هالستد البعوض هيموستات. يجب الحرص أثناء تطبيق هيموستات لأن هذه السفن هي صدمة بسهولة. محاولة المكدس بالسفن داخل الفكين المشابك.</li>
	<li>في نهاية هذه التجربة، القتل الرحيم التالية مع بينتوباربيتال الرابع 85-100 مغ/كغ، بجمع جميع الحلقات من الأنسجة باستخدام مقص ميتزينبوم، بعد أن تأكدت وفاة لا ضربات القلب أوسكولتاتيد وفقدان منعكس القرنية. ابدأ بجمع قطعة تحكم صائم العادي على الأقل 5-10 سم الدانية حلقة الدماغية الأخير.</li>
	<li>فصل وتخزين الحلقات من كل نقطة وقت الإصابة في حاويات صغيرة من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني حتى جاهزة لعزل سرداب. ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، جعل الدماغية الحلقات طويلة بما يكفي لتقسيم عينات منفصلة لعلم الأنسجة والخلايا الجذعية المعوية الثقافة؛ ومع ذلك، وجدت الكتاب أن الحلقات أكبر من طول 10 سم تقريبا الأكثر احتمالاً أن تصبح النزفية.</li>
</ol>3-سرداب (الخلايا الجذعية) في معزل عن الدماغية وحلقات التحكم
<ol><li>عكس كل حلقة من الأمعاء الدقيقة باستخدام أسلاك 20-قياس وملقط الأنسجة لفضح السطح المخاطي. ربط أعلى وأسفل الحلقة بشكل أمن إلى السلك باستخدام خياطة (2-0 الحرير غير الامتصاص أو ما يعادلها).</li>
	<li>وفي أعقاب الانقلاب، شطف كل حلقة في برنامج تلفزيوني الباردة الجليد لإزالة الحطام لومينال.</li>
	<li>وضع العينات فورا إلى 50 مل أنابيب مخروطية تحتوي على الدكتور #1 على الجليد لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>جمع الحلقات بدءاً من مراقبة ومتابعة مع الحلقات تدريجيا زيادة مدد الاسكيمية. يمكن اهتزت الحلقات من أقل الأنسجة التالفة (أي عنصر التحكم وح 1 الدماغية الأنسجة) قوة العض المعصم للحصول على أفضل النتائج. ينبغي هز الأنسجة من الأنسجة لحقت بها أضرار بالغة (ح 3 و 4 من الاسكيمية) بلطف أو مقلوب فقط كما تهتز كثيرا سوف يسبب تعطل سرداب وتدمير الأنسجة الإضافية. وينبغي أن اهتزت أنابيب أو مقلوب كل 5 دقائق في حين على الجليد.</li>
	<li>نقل العينات إلى الدكتور #2 لمدة 10 دقائق في حمام مائي 37 درجة مئوية. اهتزاز أو عكس أنابيب كل 5 دقائق.</li>
	<li>بعد نقل الأنسجة، الطرد المركزي أنابيب مخروطية تحتوي على الدكتور #1 من الحلقات ح 2-4 أضرار لإزالة يدتا طافية (200 غ س لمدة 5 دقائق). كما تتلف هذه الأنسجة بدرجة عالية من الممكن الأقبية قد تصبح نات بالفعل. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه مع كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني (5 مل) وانتقل إلى الخطوة 3، 9.</li>
	<li>إزالة عينات من الدكتور #2 ووضع عينات الأنسجة مباشرة إلى 25 مل من برنامج تلفزيوني الباردة على الجليد (التسمية كغسل #1). وضع العينات على شاكر مداري على الجليد في دورة في الدقيقة 60. ما زالت تهز أو عكس كل أنبوب لمدة 30 ثانية كل دقيقة 2 إلى 5.</li>
	<li>بعد نقل الأنسجة، تدور هذه الأنابيب المخروطية التي تحتوي على الدكتور #2 من ح 2-4 أضرار الحلقات لإزالة يدتا طافية (200 غ س لمدة 5 دقائق). كما تضررت هذه الأنسجة شديدة فمن الممكن أنه قد أصبح فصل في الأقبية. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه مع كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني (5 مل) وانتقل إلى الخطوة 3، 9.</li>
	<li>إزالة من قاسمة 50 ميليلتر من يغسل #1 (أو من الدكتور) للتحقق من درجة الانفصال من سرداب وكمية من الحطام. وضع الأنسجة في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد (أغسل #2، #3، إلخ) مليئة 25 مل الباردة برنامج تلفزيوني ويهز حتى الأقبية سليمة معزولة مع الحد الأدنى من الحطام والزوائد. ملاحظة: الهدف أن تكون قادرة على عزل جزء نظيف مع الأقبية سليمة والحد الأدنى من الحطام. كل غسل إضافية سوف تنظيف الخلايا تهتز ولكن الكثير سوف تبدأ أن ينجم عنه ضرر ثانوي الأنسجة/خلية. وعلاوة على ذلك، يتحقق أفضل النتائج مع أقل من التلوث إذا هي مطلي الأقبية من خطوة غسيل وليس من خطوة كاشف الانفصال.</li>
	<li>إزالة الأنسجة المتبقية والطرد المركزي هذه الأنابيب المخروطية 50 مل في 200 x ز لمدة 5 دقائق لإزالة المادة طافية، ثم ريسوسبيند المتبقية بيليه سرداب في حجم أصغر من برنامج تلفزيوني (5 مل).</li>
	<li>استخدام مجهر مقلوب، فحص 50 ميليلتر مختبرين لكل عينة لتحديد عدد من الأقبية/الكسر. والهدف هو 50-100 ميليلتر الخبايا/50، كما سيكون هذا حجم أتى المصفوفة النهائي. ملاحظة: إذا كانت العينة مركزة جداً، استمر في إضافة برنامج تلفزيوني الباردة حتى يتم الوصول إلى التركيز المطلوب. إذا كان نموذج مخفف جداً، تحديد عدد مختبرين اللازمة للوصول إلى سرداب المطلوب الغلة وضبط.</li>
	<li>الكوة وحدات مناسبة للأقبية (يحدده الملاحظات الكوة) في أنبوب ميكروسينتريفوجي. على سبيل المثال، إذا كان نموذج يحتوي على 50 الأقبية/50 ميليلتر ثم ميليلتر 50 الكوة الواحدة باتي يتطابق X 3 = 150 ميليلتر/أنبوب ميكروسينتريفوجي. إذا كان النموذج يحتوي فقط على 25 الأقبية/50 ميليلتر ثم 2 مختبرين الحاجة/يتطابق باتي X 3 = 300 ميليلتر/الأنبوبة.</li>
	<li>بيليه الأقبية في 200 غ س لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.</li>
	<li>ريسوسبيند برفق الأقبية الأعلاف مع حجم المناسبة من مزيج الرئيسي (50 ميليلتر للبئر الواحد). مزيج دقيق بسرعة بيبيتينج 15 مرة دون خلق فقاعات الهواء. ملاحظة: قبل بارد نصيحة ماصة مع PBS العقيمة الباردة قبل يسفط مزيج الرئيسي. وهذا سيساعد على الحفاظ مزيج الرئيسي من يتباعد. نصائح يمكن أيضا الاحتفاظ في الثلاجة ووضعها في غطاء محرك السيارة فورا قبل استخدامها.</li>
	<li>الاستغناء عن 50 ميليلتر ميكس الرئيسية بالإضافة إلى سرداب الحبرية إلى مركز لكل بئر من صفيحة جيدا 24 المعالجون مسبقاً.</li>
	<li>احتضان لوحة الثقافة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.</li>
	<li>تراكب كل أتى مصفوفة مع 500 ميليلتر/جيدا من إيسك الوسائط (لا نمو العوامل الإضافية اللازمة في اليوم 0 كما هي واردة ضمن مزيج الرئيسي).</li>
	<li>إضافة 500 ميليلتر PBS العقيمة إلى الآبار غير المستعملة أي اليسار في لوحة للحفاظ على رطوبة.</li>
	<li>عد عدد من الأقبية مطلي في اليوم 0. ملاحظة: أنها مفيدة للشبكة قبل كل خلية ثقافة لوحة في الأرباع للمساعدة على ضمان العد أكثر دقة.</li>
	<li>عد عدد من انتيروسفيريس كل 24 ساعة، ورصد للتنمية انتيرويد يوميا.</li>
	<li>إضافة عوامل النمو لكل حاء 48 جيدا كل إزالة الوسائط إيسك كل ح 96 واستبدال مع 500 ميليلتر وسائط جديدة (عوامل النمو يجب ثم إضافة إلى وسائل الإعلام).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Eltzschig, H. K., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia+and+reperfusion--from+mechanism+to+translation.">Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation.</a> Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).</li><li>Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+gastrointestinal+ischemic+injury.">Treatment of gastrointestinal ischemic injury.</a> Vet Clin North Am Equine Pract. 19 (3), 715-727 (2003).</li><li>Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ischemia-reperfusion-induced+intestinal+injury:+progress+and+promise+for+translational+research.">Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: progress and promise for translational research.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308 (2), 63-75 (2015).</li><li>Podolsky, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immunity+and+inflammation.+V.+Innate+mechanisms+of+mucosal+defense+and+repair:+the+best+offense+is+a+good+defense.">Mucosal immunity and inflammation. V. Innate mechanisms of mucosal defense and repair: the best offense is a good defense.</a> Am J Physiol. 277 (3), 495-499 (1999).</li><li>Collard, C. D., Gelman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology,+clinical+manifestations,+and+prevention+of+ischemia-reperfusion+injury.">Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury.</a> Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).</li><li>Mallick, I. H., Yang, W., Winslet, M. C., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia-reperfusion+injury+of+the+intestine+and+protective+strategies+against+injury.">Ischemia-reperfusion injury of the intestine and protective strategies against injury.</a> Dig Dis Sci. 49 (9), 1359-1377 (2004).</li><li>Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+models+of+digestive+disease:+the+future+of+large+animal+translational+research.">Porcine models of digestive disease: the future of large animal translational research.</a> Transl Res. 166 (1), 12-27 (2015).</li><li>Ziegler, A., Gonzalez, L. M., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+animal+models:+The+key+to+translational+discovery+in+digestive+disease+research.">Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2 (6), 716-724 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Meneses, A. M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids-Current+and+future+applications.">Intestinal organoids-Current and future applications.</a> Veterinary Sciences. 3 (4), 31 (2016).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+epithelial+enteroids+and+colonoids+from+whole+tissue+and+biopsy.">Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li><li>Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+gastrointestinal+development+and+disease.">Organoid models of human gastrointestinal development and disease.</a> Gastroenterology. 150 (5), 1098-1112 (2016).</li><li>Swindle, M. M., Smith, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging &amp; Experimental Techniques, 3rd Ed. , (2015).</li><li>Riebold, T. W., Geiser, D. R., Goble, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Large Animal Anesthesia: Principles and Techniques, 2nd Ed. , (1995).</li><li>Parks, D. A., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+ischemia+and+reperfusion+to+mucosal+lesion+formation.">Contributions of ischemia and reperfusion to mucosal lesion formation.</a> Am J Physiol. 250 (6), 749-753 (1986).</li><li>Schoenberg, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+neutrophils+in+postischaemic+damage+to+the+small+intestine.">Involvement of neutrophils in postischaemic damage to the small intestine.</a> Gut. 32 (8), 905-912 (1991).</li><li>Nilsson, U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals+and+pathogenesis+during+ischemia+and+reperfusion+of+the+cat+small+intestine.">Free radicals and pathogenesis during ischemia and reperfusion of the cat small intestine.</a> Gastroenterology. 106 (3), 629-636 (1994).</li><li>Osborne, D. L., Aw, T. Y., Cepinskas, G., Kvietys, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ischemia/reperfusion+tolerance+in+the+rat+small+intestine.+An+epithelium-independent+event.">Development of ischemia/reperfusion tolerance in the rat small intestine. An epithelium-independent event.</a> J Clin Invest. 94 (5), 1910-1918 (1994).</li><li>Blikslager, A. T., Roberts, M. C., Rhoads, J. M., Argenzio, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+reperfusion+injury+an+important+cause+of+mucosal+damage+after+porcine+intestinal+ischemia.">Is reperfusion injury an important cause of mucosal damage after porcine intestinal ischemia.</a> Surgery. 121 (5), 526-534 (1997).</li><li>Shegarfi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CCN1+(Cyr61)+in+a+porcine+model+of+intestinal+ischemia/reperfusion.">Regulation of CCN1 (Cyr61) in a porcine model of intestinal ischemia/reperfusion.</a> Innate Immun. 21 (5), 453-462 (2015).</li><li>Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+intestinal+ischemia-reperfusion+injury.">Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

تطوير نموذج الاسكيمية المعوية قطعي النقانق ويتوسع نماذج مورين السابقة عن طريق السماح لدراسة نقاط زمنية متعددة من إصابة الأنسجة داخل الحيوان نفسه. وهناك عدة نقاط المناقشة الحاسمة لهذا البروتوكول بما في ذلك ربط السفن السليم وضخه الأنسجة وسرداب نجاح زراعة الخلايا.
ربط السفن السليم أمر ضروري لإيجاد نموذج الاسكيمية كاملة. إذا كانت مرتبطة الخياطة موزعة أو المشبك تشديد تماما، لا الدم من الشريان السميكة قد يستمر لإدخال الأنسجة ولا يمكن الخروج منه بسبب انهيار الوريد رقيقة الجدران. ينتج عن هذا التسرب دم إلى بروبريا الصفيحة يسبب تلف الأنسجة الإضافية. ومع ذلك، تبعاً لنوع الإصابة الدماغية قيد الدراسة، قد رغبت في الاسكيمية كاملة أو نزفية. على سبيل المثال، عملية زرع الأمعاء، يفصل الأمعاء تماما من إمدادات الأوعية الدموية (الشريان والوريد) أثناء مرحلة الاستئصال الداخلي، الذي ينتج الاسكيمية المعوية كاملة. بدلاً من ذلك، ومع ذلك، عندما هو الملتوية في مساريق أثناء حدث مثل انفتال الأمعاء، عودة وريدي هو غالباً ما أعاقت أولاً، المؤدية إلى الدم إضافية داخل الأنسجة قبل أن الإمداد الشرياني إعاقة، وبالتالي خلق الاسكيمية النزفية.
الإصابات الدماغية ينتج عن تلف الأنسجة بدءاً من طرف زغابة وتوسيع وصولاً إلى القاعدة من سرداب3. خلال الاسكيمية، لا تزال تستخدم الطاقة في شكل أدينوسين ثلاثي الفوسفات ويولد هيبوكسانثيني المستقلب. عندما يتم ريبيرفوسيد الأنسجة بالأكسجين، يصبح استقلاب طريق أوكسيديز زانتيني hypoxanthine وتنتج الجذور الحرة دسموتاز مما أدى إلى إصابة الغشاء المخاطي والجذب من نسيج إتلاف العَدلات17،18. أنواع الاختلافات في بنية الأوعية المخاطية فضلا عن التعبير متفاوتة من أوكسيديز زانتيني، يؤدي إلى درجات متفاوتة من الإصابة ضخه3. نماذج القطط والقوارض من الاسكيمية-الاكسجينيه أكثر عرضه للإصابة ضخه من الأكسجين التفاعلية والايضات19،20. وفي المقابل، تم العثور على الخنازير أقل أوكسيديز زانتيني، وذلك أقل الإصابة ضخه، مما يجعل هذا النموذج أكثر قابلية للمقارنة لأن الاسكيمية المعوية البشرية21. في هذا الوقت، استخدام نماذج الخنزير المعدلة وراثيا لدراسة الإصابة المعوية أو خروج المغلوب لا وصف، مما يجعل هذا قيداً رئيسيا لهذا النموذج. اختيار النموذج الحيوان السليم يعتمد على عملية المرض أو شرط محدد الباحث يرغب في الدراسة. على سبيل المثال، كانت نماذج الخنزير من الإصابات الدماغية تصل إلى 6 ح22من وصف، بينما هي الإجراءات الأكثر الدماغية في نماذج مورين23من 45-60 دقيقة.
يسمح عزل ناجحة من الخبايا المعوية من الأمعاء إيشيميكالي التالفة والعادي للدراسة لاسترداد الظهارية في الثقافة. هذا النظام يسمح للباحث أن يركز فريد ظهارة وحدها، كما أن هناك إمدادات لا الأوعية الدموية أو مكونات الخلايا المناعية للنظر. وهذا يتيح الفرصة لدراسة التفاعلات بين الخلايا الظهارية والانتعاش بعد الإصابة بالإضافة إلى الاستجابة لعوامل النمو المختلفة، أو العلاجات التي يديرها أثناء الجراحة أو عزل سرداب التالية المكمل لوسائط الإعلام الثقافة. وتظل هذه الخطوة الأكثر صعوبة، كما تتطلب عزل من الحلقات لحقت بها أضرار بالغة تهز لطيف والإزالة السريعة للحلول التي تحتوي على يدتا في حال الأقبية تصبح قبل الأوان فصلها. إذا كانت هذه الحلقات من الأمعاء لا تغسل جيدا، الأقبية قد يمكن أن تصبح ملوثة في الثقافة. نتيجة لذلك تمت إضافة حل مضاد حيوي فطري إلى كلا الحلول الدكتور بالإضافة إلى وسائط الإعلام إيسك. نقطة نقاش أخرى تركز على الأمعاء التي يتم جمعها كعنصر تحكم عادي. الأنسجة التحكم حتى "طبيعية" كما الحيوانات الخضوع للتخدير مع التعديلات الممكنة في نضح الأنسجة النظمية، جنبا إلى جنب مع إمكانية تعميم وسطاء التهابات ثانوية الاسكيمية، قد لا تمثل عنصر تحكم حقيقية. في هذه التجارب، أنها ملاحظة أنه يبدو أن الأنسجة مراقبة مماثلة صارخ والأشيع للأنسجة من الحيوانات التي لم تطرأ الاسكيمية في تجارب أخرى (غونزاليس، ل. م.، معطيات غير منشورة، عام 2017).
وباختصار، يصف هذا الأسلوب نموذج استنساخه من الخنزير الاسكيمية المعوية، أن نماذج عن كثب ما يحدث في الإصابات الدماغية البشرية. بالإضافة إلى ذلك، يرد وصف لعزل الخلايا الجذعية المعوية من الحلقات الدماغية، الذي يعمل على دراسة إصلاح الظهارية واستجابة ممكنة للعلاج في الثقافة.

الإصابات الدماغية المعوية، ونتيجة لتوافر الأوكسجين انخفض بسبب تخفيض أو انسداد كامل لتدفق الدم إلى الأمعاء، ما زالت سببا هاما للمراضة والوفيات في المرضى الإنسان والحيوان1،2. الأضرار الدماغية، جنبا إلى جنب مع التهاب لاحقة وتسلل الخلوية، يؤدي إلى حل وسط الحاجز المخاطي. أن الحاجز المخاطي أمر حاسم لمنع إزفاء البكتيرية والسموم المرتبطة بها إلى الدوران الجهازي3،4. يمكن أن يؤدي تشكيل إلحاق الضرر بالأنواع الأكسجين التفاعلية التي يمكن أن تؤدي إلى تفاقم إصابة5ضخه اللاحقة من الأنسجة الدماغية. منذ الاسكيمية المعوية نادراً ما يمكن الوقاية منها، معظم الأبحاث الحالية تركز على النهوض بتقنيات الكشف المبكر عن الاسكيمية وتطوير رواية النهج العلاجية التي تقلل من ضخه الإصابة أو هدف إصلاح الغشاء المخاطي.
نماذج حيوانية قد استخدمت على نطاق واسع لتوسيع معرفتنا العلوم الأساسية من الإصابة ضخه الاسكيمية، وتظل الحتمية للبحوث متعدية الجنسيات. وكانت نماذج القوارض الأكثر استخداماً نظراً لقدرتها على أن تكون محوره وراثيا6. في الآونة الأخيرة بيد استخدام نماذج حيوانية كبيرة، على وجه التحديد الخنزير، قد دعت للدراسات متعدية الجنسيات في المستقبل نظراً لوجود عدد من المزايا بما في ذلك أوجه التشابه الخنازير التشريحية والفسيولوجية للبشر7،8. وقد وضعت مجموعة متنوعة من نماذج الضرر لدراسة الإصابة الاسكيمية-ضخه وتشمل انسداد الأوعية الدموية كاملة، الاسكيمية التدفق المنخفض وانسداد الأوعية الدموية المساريقي العلوي القطاعي. استعراضاً كاملا لهذه النماذج هو خارج نطاق هذه المقالة المباشر الكتاب القراء إلى مراجعة الأخيرة3.
ويتيح الاستخدام السابقين فيفو نظم الثقافة الخلوية بالإضافة إلى نماذج في فيفو ، أداة واعدة لدراسة التوازن المعوية وإصلاح بعد الإصابة. الأمعاء والخلايا الجذعية المسؤولة عن انتشار الهاتف الخلوي ودوران البطانة الظهارية المعوية. عندما معزولة من الأمعاء العادية أو الجرحى، الخلايا الجذعية المعوية يمكن الحفاظ على الثقافة، وتخدم كأداة أو نموذج لدراسة الخلايا الجذعية وبيولوجيا الخلايا الظهارية. طرق عزل وإقامة هذه ثلاثية الأبعاد الثقافة نظم (يطلق عليها انتيرويدس وكولونويدس عند المستمدة من الأمعاء الصغيرة والكبيرة، على التوالي) وقد وصف لمجموعة متنوعة من الجهاز وأنواع نظم9،10 11، ،،من1213. على وجه التحديد، داخل الجهاز الهضمي، استخدمت هذه النظم الثقافة إلى أمراض معوية نموذجية بما في ذلك السرطان والإصابة بمسببات الأمراض و مرض التهاب الأمعاء14. وفي هذا الوقت، لا توجد تقارير تصف بالعزلة والحفاظ على الخلايا الجذعية المعوية من إيشيميكالي إصابة الأمعاء الدقيقة في أي من الأنواع. ولذلك، نحن هنا وصف عملية الاسكيمية المعوية في الرواية كبير حيوان الخنزير نموذج، مما يسفر عن إصابة استنساخه والقدرة على عزل الخلايا الجذعية المعوية من الأمعاء العادية والمصابين إيشيميكالي لدراسة إضافية استرداد السابقين فيفو.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:640px;" width="640">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Phosphate Buffered Saline, Ca2+, Mg 2+ free</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BP-399</td>
			<td style="width:167px;">Dilute 1:10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Distilled, deionized water (ddH2O)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used to prepare EDTA and PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">20688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Ethylenediamene tetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">ED45</td>
			<td>Make fresh before each experiment; pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">1,4-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Y-27632</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">N2 Supplement</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">B-27 Supplement</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">HEPES</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15630-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Glutamax</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15240-096</td>
			<td>Anti-Anti solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Recombinant human Wnt-3a</td>
			<td style="width:107px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">5036 WN/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Recombinant human Rspondin1</td>
			<td style="width:107px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">4645- RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Recombinant human Noggin</td>
			<td style="width:107px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">6057-NG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Recombinant human EGF</td>
			<td style="width:107px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">LY2157299</td>
			<td style="width:107px;">SelleckChem</td>
			<td align="right" style="width:119px;">52230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:107px;">Cayman Chemical</td>
			<td align="right" style="width:119px;">13122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Human [leu]15-Gastrin 1</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">SB202190</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">57067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">A83-01</td>
			<td style="width:107px;">Tocris</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Nicotinamide</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Water, WFI Quality</td>
			<td style="width:107px;">Corning, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">25-055-CM</td>
			<td>Referred to as sterile water (SW); for growth factor stocks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Matrigel Matrix, GFR</td>
			<td style="width:107px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">356231</td>
			<td>Phenol red free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">24 Well Culture Dish</td>
			<td style="width:107px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Conical Tube, 50 ml&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Scalpel Handle</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">500236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Carbon Steel Surgical Blade, No. 10</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">504169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Tissue Forceps</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">15918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Debakey Tissue Forceps</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">501239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Mayo Scissors</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">501752</td>
			<td>Curved or straight</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Metzenbaum Scissors</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">501739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Mosquito Forceps, Curved</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td>503724-12</td>
			<td>Curved or straight (503728-12)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Hopkins Bulldog Clamp</td>
			<td style="width:107px;">Stoelting Co.</td>
			<td>52120-40P</td>
			<td>Straight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Silk, 2-0&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">685S-BUT</td>
			<td>Any similar brand is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Towel Clamps</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">501700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Needle Holder</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">V503382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Wire suture, 20 gauge</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td align="right" style="width:119px;">19075</td>
			<td>Cut and straighten before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Surgical Towels</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">ST1833</td>
			<td>Any similar product is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Lactated Ringers Solution</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td align="right" style="width:119px;">9851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Chlorhex antiseptic scrub (4%)</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">VINV-CHMX-SCRB</td>
			<td>Any similar brand is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Isopropyl Alcohol 70%</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">MS071HS</td>
			<td>Any similar brand is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">IV catheter, 22 gauge</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">2225PUR</td>
			<td>May need 20g or 24 g depending on size of the vein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Xylazine (100 mg/ml)</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td align="right" style="width:119px;">33198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Ketamine (100 mg/ml)</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">11695-6835-1</td>
			<td>Controlled medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Isoflurane solution</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10015516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Pentobarbital (Fatal Plus Euthanasia Solution (390 mg/ml))</td>
			<td style="width:107px;">Vortech Pharm.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Multiple brands of Pentobarbital Sodium available.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Heating pad&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Gaymar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Tpump Core Warming System; others are available.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Mindray Datascope Monitor</td>
			<td style="width:107px;">Mindray North America</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any equivalent piece of monitoring equipment acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Vaporizer&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Vetland Medical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Recommended to use a Circle System w/ Y piece; multiple suppliers available.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Fluid Pump</td>
			<td style="width:107px;">Abbott Hospira</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Plum A+; Any similar manufacturer is recommended.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intestinal stem cell isolation and culture in a porcine model of segmental small intestinal ischemia

ويظل الاسكيمية المعوية سببا رئيسيا للمراضة والوفيات في المرضى البشرية والبيطرية. تؤدي العديد من الأمراض العمليات في الاسكيمية المعوية، عندما انخفضت إمدادات الدم، وبالتالي الأكسجين للامعاء. هذا يؤدي إلى فقدان جدار الأمعاء والأضرار التي لحقت الأنسجة الكامنة. تتواجد في قاعدة الخبايا Lieberkühn الخلايا الجذعية المعوية وهي المسؤولة عن تجديد المعوية خلال التوازن والإصابات التالية. وأتاحت دراسة التفاعلات بين الخلايا الجذعية الظهارية ناجحة السابقين فيفو تقنيات استزراع خلية بوضع شروط الثقافة التي تدعم نمو النظم مثل جهاز الظهارية ثلاثي الأبعاد (يسمى "انتيرويدس" و " كولونويدس "من الأمعاء الصغيرة والكبيرة، على التوالي). هذه انتيرويدس مكونة من سرداب ومجالات مثل زغابة وناضجة لاحتواء كافة أنواع الخلايا وجدت داخل الظهارة. تاريخيا، استخدمت نماذج مورين لدراسة الإصابة المعوية. ومع ذلك، يقدم نموذجا الخنزير العديد من المزايا بما في ذلك تشابه الحجم فضلا عن تشريح الجهاز الهضمي وعلم وظائف الأعضاء للبشر. باستخدام نموذج الخنزير، يمكننا وضع بروتوكول التي قطعي حلقات من الأمعاء الاسكيمية يمكن أن تنشأ داخل حيوان مفردة، وتمكن الدراسة من اختلاف الوقت النقاط من الإصابات الدماغية وإصلاح فيفو. بالإضافة إلى ذلك، يمكننا وصف طريقة لعزل والثقافة أن الخلايا الجذعية المعوية من الحلقات الدماغية من الأمعاء، مما يسمح لمواصلة دراسة إصلاح الظهارية، عن طريق الخلايا الجذعية، والتضمين السابقين فيفو.

تم إنشاؤه الاسكيمية المعوية كاملة في حلقات الأمعاء الصغيرة عن طريق استخدام انسداد الأوعية الدموية مع خياطة أو المشابك كما هو مبين في الشكل 1. عن طريق الإفراج عن المشابك، يمكن أن يؤديها فترة ضخه الخاضعة لمراقبة، مما يسمح لدراسة إضافية للإصابة ضخه اللاحقة إذا رغبت في ذلك. ونجا جميع الحيوانات أثناء الإجراء مع الحد الأدنى من المضاعفات حتى القتل الرحيم. المضاعفات الجراحية الأكثر شيوعاً هو انخفاض ضغط الدم، التي تحل مع مكملات من المقوى إيجابية مثل الدوبوتامين.
إذا أجرى بشكل صحيح، سوف تبدأ في غيض الزوائد المعوية الإصابات الدماغية وتهاجر إلى أسفل داخل السرداب كفترة زيادات الاسكيمية (الشكل 2). يمكن أن يحدث خطأ مشترك واحد مع تقنية جراحية عندما الأوعية الدموية غير متصلة أو فرضت بالتساوي. والنتيجة هي الاسكيمية نزفية (الشكل 3)، الذي ينهار على المنوال رقيقة الجدران قبل الشريان، مما يسمح للدم الإضافية اختراق الأنسجة. ويعتبر هذا صارخ على سطح سيرسال أرجواني داكن (الرقم 3من اليسار) بالمقارنة مع سطح اشحب خلال كامل الاسكيمية (الشكل 3، حق).
وبعد إزالة الحلقات المعوية الدماغية، الخبايا المعوية كانت معزولة بنجاح عقب الانفصال من البروتوكول (الشكل 4). كما هو متوقع، كثيرا ما كانت أقبية من تيميبوينتس التالفة أكثر شدة مكسورة (و؛ بلغة) ويرد الكسور القبو أكثر الحطام الخلوية في الخلفية عند مقارنتها بتلك التي خضعت للا أضرار خفيفة. خلال البروتوكول، يجب أن تهتز الأمعاء إصابة شديدة برفق لتجنب المزيد من الضرر للأنسجة الكامنة. هز جداً تقريبا يمكن أن يؤدي المزيد من سرداب الأضرار والغالبية من أقبية ينتهي بهم المطاف في الحلول الدكتور المحتوية على يدتا، أسفر عن تعطل إضافية.
وبمجرد مطلي، الأقبية من جميع النقاط الزمنية من الاسكيمية البقاء على قيد الحياة وقادرون على ترسخ في الثقافة (الشكل 5). عندما يتم مطلي الخبايا المعوية العادية وتلف أقل ما يقال في الثقافة، ونموذج انتيروسفيريس داخل ح 24-48. مع أضرار الدماغية (ح 3 و 4)، الخبايا المعوية البقاء على قيد الحياة، لكن معطوبة، أسفر عن تشكيل المجالات أصغر بكثير في البداية. من ح 72-120، انتيرويدس أصبحت أكثر تعقيداً مع لومن مركزية واضحة وهياكل مهدها. وعموما، هناك من كفاءة نمو انخفض من أقبية، فضلا عن انخفاض حجم انتيرويدس المستمدة من الأنسجة المعوية لحقت بها أضرار بالغة (غونزاليس، ل. م.، معطيات غير منشورة، عام 2017).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig1.jpg"> الشكل 1 : نموذج الجراحية من الاسكيمية المعوية كاملة في نموذج خنزيري. A) الطبيعي صائم الخنزير اكستيريوريزيد. ب) وقد كانت متصلة سفن المساريقي العلوي مع خياطة خلق الاسكيمية المعوية. ج) الاسكيمية التي تم إنشاؤها باستخدام المشابك لدغ الأوعية الدموية للسماح للأنسجة ضخه إذا رغبت في ذلك. د) المعوية المفرج فور إزالة المشابك الأوعية الدموية. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig2.jpg"> الشكل 2 : الأدلة النسجية (الهيماتوكسيلين وويوزين وصمة (H & E)) لزيادة الأضرار الظهارية بعد فترات أطول من الاسكيمية المعوية كاملة- يبدأ الضرر في غيض الزوائد مع فقدان تدريجي طبقة طلائي خلية مفردة، وأحبطت زغابة والأضرار الخلوية توسيع وصولاً إلى سرداب قاعدة مع إصابة شديدة (لمدة تصل إلى 4 ح). شريط مقياس 100 ميكرومتر. أنا = الاسكيمية. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig3.jpg"> الشكل 3 : الأدلة الإجمالية ونسيجية من الاسكيمية النزفية. A) الصورة الإجمالي مقارنة الاسكيمية النزفية (حلقة الأيسر) وكامل الاسكيمية (حلقة الحق). عند المفرج غير متصلة أو فرضت بالتساوي، الدم يمكن الاستمرار في التسلل الأنسجة، مما يؤدي إلى التهاب إضافية والضرر. ب) صور الاسكيمية النزفية من زيادة المدة من 1-4 ح ح & ه. بالإضافة إلى الأضرار الخلوية ينظر مع الاسكيمية كاملة، هناك دليل على تسلل خلايا الدم الحمراء داخل بروبريا الصفيحة المحيطة بها. شريط مقياس 100 ميكرومتر. أنا = الاسكيمية. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig4.jpg"> الشكل 4 : مختبرين الخبايا المعوية المعزولة من حلقات الأمعاء الدماغية وعادي. الخبايا المعوية كاملة وسليمة (علامات نجمية) كانت معزولة بنجاح من كل حلقة من الأمعاء. كما هو متوقع، الأقبية من أكثر النقاط الزمنية لحقت بها أضرار بالغة كثيرا ما تكون مقطوعة (و؛ يفتت) ويرد الكسور القبو أكثر الحطام الخلوية في الخلفية عند مقارنتها بتلك التي خضعت للا أضرار خفيفة. شريط مقياس 100 ميكرومتر. أنا = الاسكيمية. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig5.jpg"> الشكل 5 : دورة الوقت لنمو الخلايا الجذعية المعوية بعد عزلة من الحلقات الدماغية من الأمعاء. عندما كانت مطلي الخبايا المعوية العادية في الثقافة، شكلت انتيروسفيريس داخل ح 24-48. مع أضرار الدماغية (ح 3 و 4)، الأقبية البقاء على قيد الحياة، لكن تشكل مجالات أصغر بكثير في البداية. من ح 72-120، انتيرويدس أصبحت أكثر تعقيداً مع لومن مركزية واضحة وهياكل مهدها. 20 ميكرون حجم شريط ما سجلته. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>عامل النمو</td>
			<td>مخفف</td>
			<td>تركز الأسهم</td>
			<td>تمييع الأسهم</td>
			<td>تمييع العمل</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-سبوندين</td>
			<td>برنامج تلفزيوني</td>
			<td>100 X</td>
			<td>100 ميكروغرام/مل</td>
			<td>1 ميكروغرام/مل</td>
		</tr>
<tr>
<td>رأس</td>
			<td>SW/0.1%BSA</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>100 ميكروغرام/مل</td>
			<td>100 نانوغرام/مليلتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>لو</td>
			<td>10 ملم حمض الخليك</td>
			<td>10,000 X</td>
			<td>500 ميكروغرام/مل</td>
			<td>50 نانوغرام/مليلتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>ألف-83-01</td>
			<td>[دمس]</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>500 ميكرومتر</td>
			<td>500 نانومتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>SB202190</td>
			<td>[دمس]</td>
			<td>3000 X</td>
			<td>30 مم</td>
			<td>10 ميكرومتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>نيكوتيناميد</td>
			<td>SW</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>م 1</td>
			<td>1 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>جاسترين</td>
			<td>برنامج تلفزيوني</td>
			<td>10,000 X</td>
			<td>100 ميكرومتر</td>
			<td>10 نانومتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>Y-27632</td>
			<td>برنامج تلفزيوني</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>10 ملم</td>
			<td>10 ميكرومتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>LY2157299</td>
			<td>[دمس]</td>
			<td>10,000 X</td>
			<td>5 مم</td>
			<td>0.5 ميكرومتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>برنامج تلفزيوني</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>2.5 مم</td>
			<td>2.5 ميكرون</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wnt3a</td>
			<td>برنامج تلفزيوني</td>
			<td>2000 X</td>
			<td>200 ميكروغرام/مل</td>
			<td>100 نانوغرام/مليلتر</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: جدول الكاشف عامل نمو. ملخص الحلول الأسهم عامل النمو وعمل الحلول المستخدمة في هذا البروتوكول.

Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia at JoVE.com

Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

وسيمكن هذا البروتوكول للقراء بنجاح إنشاء نموذج الاسكيمية المعوية قطعي النقانق وبعد ذلك عزل والثقافة المعوية الخلايا الجذعية لدراسة إصلاح الظهارية بعد إصابة.

عزل الخلايا الجذعية المعوية والثقافة في نموذج الخنزير من المجزأ الاسكيمية الأمعاء الصغيرة

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ...

intestinal-stem-cell-isolation-culture-porcine-model-segmental-small

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Medicine

Unit 1

Stem Cell Biology And Renewal in Epithelial Tissue

SCIENTISTS IN ACTION

10.7K Views.  North Carolina State University. وسيمكن هذا البروتوكول للقراء بنجاح إنشاء نموذج الاسكيمية المعوية قطعي النقانق وبعد ذلك عزل والثقافة المعوية الخلايا الجذعية لدراسة إصلاح الظهارية بعد إصابة.

Video: Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

نموذج الفأر من في الرحم زراعة

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and finding new sources for implantable cells are the focus of recent research4,5. Investigating the effectiveness of cell therapies is not an easy task and new tools are needed to investigate the mechanisms involved in the treatment process6. We designed an experimental protocol of ischemia/reperfusion in order to allow the observation of cellular connections and even subcellular mechanisms during ischemia/reperfusion injury and after stem cell transplantation and to evaluate the efficacy of cell therapy. H9c2 cardiomyoblast cells were placed onto cell culture plates7,8. Ischemia was simulated with 150 minutes in a glucose free medium with oxygen level below 0.5%. Then, normal media and oxygen levels were reintroduced to simulate reperfusion. After oxygen glucose deprivation, the damaged cells were treated with transplantation of labeled human bone marrow derived mesenchymal stem cells by adding them to the culture. Mesenchymal stem cells are preferred in clinical trials because they are easily accessible with minimal invasive surgery, easily expandable and autologous. After 24 hours of co-cultivation, cells were stained with calcein and ethidium-homodimer to differentiate between live and dead cells. This setup allowed us to investigate the intercellular connections using confocal fluorescent microscopy and to quantify the survival rate of postischemic cells by flow cytometry. Confocal microscopy showed the interactions of the two cell populations such as cell fusion and formation of intercellular nanotubes. Flow cytometry analysis revealed 3 clusters of damaged cells which can be plotted on a graph and analyzed statistically. These populations can be investigated separately and conclusions can be drawn on these data on the effectiveness of the simulated therapeutical approach.

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

We demonstrate how to set up an in vitro ischemia/reperfusion model and how to evaluate the effect of stem cell therapy on postischemic cardiac cells.

زرع الخلايا الجذعية في في المختبر مقلد نقص التروية / إعادة إشباع الخلايا النموذجي

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the complex cellular and molecular of intestinal pathology. Although the tunica mucosa is often the organ of interest in many inflammatory diseases, recent works demonstrated that the muscularis externa (ME) is also a highly immunocompetent organ that harbours a dense network of resident immunocytes.1,2 These works were performed within the standardized model of intestinal manipulation (IM) that leads to inflammation of the bowel wall, mainly limited to the ME. Clinically this inflammation leads to prolonged intestinal dysmotility, known as postoperative ileus (POI) which is a frequent and unavoidable complication after abdominal surgery.3 The inflammation is characterized by liberation of proinflammatory mediators such as IL-64 or IL-1&beta; or inhibitory neurotransmitters like nitric oxide (NO).5 Subsequently, tremendous numbers of immunocytes extravasate into the ME, dominated by polymorphonuclear neutrophils (PMN) and monocytes and finally maintain POI.2 Lasting for days, this intestinal paralysis leads to an increased risk of aspiration, bacterial translocation and infectious complications up to sepsis and multi organ failure and causes a high economic burden.6
In this manuscript we demonstrate the standardized model of IM and in vivo assessment of gastrointestinal transit (GIT) and colonic transit. Furthermore we demonstrate a method for separation of the ME from the tunica mucosa followed by immunological analysis, which is crucial to distinguish between the inflammatory responses in these both highly immunoactive bowel wall compartments. All analyses are easily transferable to any other research models, affecting gastrointestinal function.

Postoperative ileus (POI) is a complication of abdominal surgery leading to increased morbidity and a prolonged hospital stay. Because prophylactic or therapeutic strategies are lacking intensified research is necessary. Therefore we established a standardized and feasible mouse model to investigate the pathophysiology of POI and to study potential therapeutic options.

وظيفية تقييم الحركة المعوية والتهاب الأمعاء الجدار في القوارض: التحليلات في نموذج موحد من التلاعب المعوية

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

Heterotopic Renal Autotransplantation in a Porcine Model: A Step-by-Step Protocol

Kidney transplantation is the treatment of choice for patients suffering from end-stage renal disease. It offers better life expectancy and higher quality of life when compared to dialysis. Although the last few decades have seen major improvements in patient outcomes following kidney transplantation, the increasing shortage of available organs represents a severe problem worldwide. To expand the donor pool, marginal kidney grafts recovered from extended criteria donors (ECD) or donated after circulatory death (DCD) are now accepted for transplantation. To further improve the postoperative outcome of these marginal grafts, research must focus on new therapeutic approaches such as alternative preservation techniques, immunomodulation, gene transfer, and stem cell administration.
Experimental studies in animal models are the final step before newly developed techniques can be translated into clinical practice. Porcine kidney transplantation is an excellent model of human transplantation and allows investigation of novel approaches. The major advantage of the porcine model is its anatomical and physiological similarity to the human body, which facilitates the rapid translation of new findings to clinical trials. This article offers a surgical step-by-step protocol for an autotransplantation model and highlights key factors to ensure experimental success. Adequate pre- and postoperative housing, attentive anesthesia, and consistent surgical techniques result in favorable postoperative outcomes. Resection of the contralateral native kidney provides the opportunity to assess post-transplant graft function. The placement of venous and urinary catheters and the use of metabolic cages allow further detailed evaluation. For long-term follow-up studies and investigation of alternative graft preservation techniques, autotransplantation models are superior to allotransplantation models, as they avoid the confounding bias posed by rejection and immunosuppressive medication.

Porcine models of organ transplantation provide an important platform to study mechanisms of organ preservation. This article describes a heterotopic porcine renal autotransplantation model, which allows investigating new approaches to improve the outcome of transplantation using marginal kidney grafts.

منتبذ الكلوي الزرع الذاتي في لحم الخنزير نموذج: بروتوكول خطوة بخطوة

Kidney transplantation is the treatment of choice for patients suffering from end-stage renal disease. It offers better life expectancy and higher quality ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, hypotension, necrotizing enterocolitis, bowel transplantation, trauma and chronic inflammation. Intestinal ischemia-reperfusion (IR) injury is a consequence of acute mesenteric ischemia, caused by inadequate blood flow through the mesenteric vessels, resulting in intestinal damage. Reperfusion following ischemia can further exacerbate damage of the intestine. The mechanisms of IR injury are complex and poorly understood. Therefore, experimental small animal models are critical for understanding the pathophysiology of IR injury and the development of novel therapies.
Here we describe a mouse model of acute intestinal IR injury that provides reproducible injury of the small intestine without mortality. This is achieved by inducing ischemia in the region of the distal ileum by temporally occluding the peripheral and terminal collateral branches of the superior mesenteric artery for 60 min using microvascular clips. Reperfusion for 1 hr, or 2 hr after injury results in reproducible injury of the intestine examined by histological analysis. Proper position of the microvascular clips is critical for the procedure. Therefore the video clip provides a detailed visual step-by-step description of this technique. This model of intestinal IR injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

Here we describe the detailed procedure of intestinal ischemia-reperfusion in mice which results in reproducible injury without mortality to encourage the standardization of this technique across the field. This model of intestinal ischemia-reperfusion injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

نموذج الفئران من المعوية الإسكيمية-ضخه إصابة

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Forskolin-الناجم عن تورم في الأمعاء Organoids: ل<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لتقييم الاستجابة للدواء في التليف الكيسي المرضى

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

A Pre-clinical Rat Model for the Study of Ischemia-reperfusion Injury in Reconstructive Microsurgery

Ischemia-reperfusion injury is the main cause of flap failure in reconstructive microsurgery. The rat is the preferred preclinical animal model in many areas of biomedical research due to its cost-effectiveness and its translation to humans. This protocol describes a method to create a preclinical free skin flap model in rats with ischemia-reperfusion injury. The described 3 cm x 6 cm rat free skin flap model is easily obtained after the placement of several vascular ligatures and the section of the vascular pedicle. Then, 8 h after the ischemic insult and completion of the microsurgical anastomosis, the free skin flap develops the tissue damage. These ischemia-reperfusion injury-related damages can be studied in this model, making it a suitable model for evaluating therapeutic agents to address this pathophysiological process. Furthermore, two main monitoring techniques are described in the protocol for the assessment of this animal model: transit-time ultrasound technology and laser speckle contrast analysis.

Here, we describe a pre-clinical animal model for studying the pathophysiology of ischemia-reperfusion injury in reconstructive microsurgery. This free skin flap model based on the superficial caudal epigastric vessels in the rat may also allow for the evaluation of different therapies and compounds to counteract ischemia-reperfusion injury-related damage.

نموذج الفئران قبل السريرية لدراسة نقص التروية-ضخ الاصابه في جراحه المجهرية الترميمية

Ischemia-reperfusion injury is the main cause of flap failure in reconstructive microsurgery. The rat is the preferred preclinical animal model in many ...

Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was not possible in classical cell culture monolayers. Moreover, monolayer cell cultures are good in vitro model systems but do not represent the complex cellular differentiation processes and functions that rely on 3D structure. This has so far only been possible in animal experiments, which are laborious, time consuming, and hard to assess by optical techniques. Here we describe an assay to quantitatively determine the barrier integrity over time in living small intestinal mouse organoids. To validate our model, we applied interferon gamma (IFN-&#947;) as a positive control for barrier destruction and organoids derived from IFN-&#947; receptor 2 knock out mice as a negative control. The assay allowed us to determine the impact of IFN-&#947; on the intestinal barrier integrity and the IFN-&#947; induced degradation of the tight junction proteins claudin-2, -7, and -15. This assay could also be used to investigate the impact of chemical compounds, proteins, toxins, bacteria, or patient-derived probes on the intestinal barrier integrity.

Here we describe a technique to quantify the barrier integrity of small intestinal organoids. The fact that the method is based on living organoids enables the sequential investigation of different barrier integrity modulating substances or combinations thereof in a time-resolved manner.

التحقيق في انهيار الحاجز المعوي في الأعضاء الحية

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was ...

Real-Time Assessment of Spinal Cord Microperfusion in a Porcine Model of Ischemia/Reperfusion

Spinal cord injury is a devastating complication of aortic repair. Despite developments for the prevention and treatment of spinal cord injury, its incidence is still considerably high and therefore, influences patient outcome. Microcirculation plays a key role in tissue perfusion and oxygen supply and is often dissociated from macrohemodynamics. Thus, direct evaluation of spinal cord microcirculation is essential for the development of microcirculation-targeted therapies and the evaluation of existing approaches in regard to spinal cord microcirculation. However, most of the methods do not provide real-time assessment of spinal cord microcirculation. The aim of this study is to describe a standardized protocol for real-time spinal cord microcirculatory evaluation using laser-Doppler needle probes directly inserted in the spinal cord. We used a porcine model of ischemia/reperfusion to induce deterioration of the spinal cord microcirculation. In addition, a fluorescent microsphere injection technique was used. Initially, animals were anesthetized and mechanically ventilated. Thereafter, laser-Doppler needle probe insertion was performed, followed by the placement of cerebrospinal fluid drainage. A median sternotomy was performed for exposure of the descending aorta to perform aortic cross-clamping. Ischemia/reperfusion was induced by supra-celiac aortic cross-clamping for a total of 48 min, followed by reperfusion and hemodynamic stabilization. Laser-Doppler Flux was performed in parallel with macrohemodynamic evaluation. In addition, automated cerebrospinal fluid drainage was used to maintain a stable cerebrospinal pressure. After completion of the protocol, animals were sacrificed, and the spinal cord was harvested for histopathological and microsphere analysis. The protocol reveals the feasibility of spinal cord microperfusion measurements using laser-Doppler probes and shows a marked decrease during ischemia as well as recovery after reperfusion. Results showed comparable behavior to fluorescent microsphere evaluation. In conclusion, this new protocol might provide a useful large animal model for future studies using real-time spinal cord microperfusion assessment in ischemia/reperfusion conditions.

Spinal cord microcirculation plays a pivotal role in spinal cord injury. Most methods do not allow real-time assessment of spinal cord microcirculation, which is essential for the development of microcirculation-targeted therapies. Here, we propose a protocol using Laser-Doppler-Flow Needle probes in a large animal model of ischemia/reperfusion.

في الوقت الحقيقي تقييم النخاع الشوكي Microperfusion في نموذج Porcine من الإقفارية / Reperfusion

Spinal cord injury is a devastating complication of aortic repair. Despite developments for the prevention and treatment of spinal cord injury, its ...

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. Here, we describe a protocol to generate a two-dimensional (2D) monolayer from three-dimensional (3D) non-human primate enteroids derived from intestinal crypts of the terminal ileum. These enteroid-derived monolayers were then utilized in an in vitro scratch wound assay to test the ability of hyaluronan 35 kDa (HA35), a human milk HA mimic, to promote cell migration and proliferation along the epithelial wound edge. After the monolayers were grown to confluency, they were manually scratched and treated with HA35 (50 &#181;g/mL, 100 &#181;g/mL, 200 &#181;g/mL) or control (PBS). Cell migration and proliferation into the gap were imaged using a transmitted-light microscope equipped for live-cell imaging. Wound closure was quantified as percent wound healing using the Wound Healing Size Plugin in ImageJ.&#160;The scratch area and rate of cell migration and the percentage of wound closure were measured over 24 h. HA35 in vitro accelerates wound healing in small intestinal enteroid monolayers, likely through a combination of cell proliferation at the wound edge and migration to the wound area. These methods can potentially be used as a model to explore intestinal regeneration in the preterm human small intestine.

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

This protocol describes a method to establish and perform a scratch wound assay on two-dimensional (2D) monolayers derived from three-dimensional (3D) enteroids isolated from non-human primate ileum.

تأثير حمض الهيالورونيك 35 كيلو دال أمبير على نموذج في المختبر للإصابات المعوية الصغيرة المبكرة والشفاء باستخدام الطبقات الأحادية المشتقة من الأمعاء

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. ...