This work was supported by The British Heart Foundation and The Oak Foundation.

أداء جميع التجارب على الحيوانات وفقا لبروتوكولات وافقت عليها اللجنة المؤسسية لاستخدام ورعاية الحيوانات المختبرية. 1. إعداد الثقافة وسائل الإعلام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل وسائل الإعلام ثقافة لخط الخلية الليفية البشري CCL-153: F-12K متوسطة، و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 100 U / البنسلين مل والستربتومايسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل إعادة برمجة وسائل الإعلام لتوليد PiPSC: النسر خروج المغلوب Dulbecco لتعديل متوسطة (DMEM) تحتوي على 20٪ استبدال خروج المغلوب المصل، 0.1 ملم β المركابتويثانول، 0.1 ملي الدنيا الأساسية المتوسطة (MEM) الأحماض الأمينية غير الأساسية، و 10 نانوغرام / عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية مل 2 (bFGF-2) و 100 U / البنسلين مل والستربتومايسين. إضافة bFGF-2 حديثا في كل مرة قبل استخدام وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل التمايز وسائل الإعلام (DM) للحث على خلية العضلات الملساء (SMC) التمايز: α-MEM وسائل الإعلام التي تحتوي على 10٪ FBS عامل نمو، 0.1 ملم β المركابتويثانول، و 100 U / مل البنسلين والستربتومايسين و 25 نانوغرام / مل صفائح الدم المشتقة(PDGF-ββ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل غشائي التمايز وسائل الإعلام (EC-DM) للحث الخلايا البطانية (EC) التمايز: نمو بطانة الإعلام-2 (EGM-2) وسائل الإعلام التي تحتوي على 50 نانوغرام / مل الأوعية الدموية غشائي عامل النمو (VEGF)، و 100 U / البنسلين مل والستربتومايسين. </li></ol> 2. إعادة برمجة الخلايا الليفية الإنسان إلى الناجمة جزئيا الخلايا الجذعية المحفزة (PiPSC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة خط الخلية الليفية البشري CCL-153 على 0.04٪ من محلول الجيلاتين قوارير المغلفة في مستنبت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا مرور كل 3 أيام في نسبة 1: 6. استخدام الخلايا قبل مرور 9 لالكفاءة المثلى من الجيل PiPSC. الخلايا جاهزة للترنسفكأيشن عند بلوغه 80-90٪ confluency. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطي متعدد المقارين pCAG2LMKOSimO البلازميد التي تحتوي على 4 عوامل إعادة برمجة-octamer ملزمة النسخ عامل 4 (OCT4)، SOX2، عامل Kruppel شبيهة 4 (KLF4) وC-MYC (pCAG-OSKM). هضم 5 ميكروغرام البلازميد مع 5 وحدات من PvuI انزيم التقييد لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية. طهرالبلازميد مع مجموعة تجارية وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالنقل 2 × 10 6 الخلايا الليفية الإنسان مع 4 ميكروغرام من خطي pCAG-OSKM البلازميد التي كتبها Electroporation للمع مجموعة الخلايا الليفية الجلدية الإنسان (NHDF) nucleofection وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. بلطف البذور الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل على ما قبل 0.04٪ الجيلاتين المغلفة T25 قارورة تحتوي على 5 مل من قبل تحسنت إعادة برمجة وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة، وتغيير المتوسطة مع المكملات الغذائية من 25 ميكروغرام / مل النيوميسين لتحديد السكان نقية من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير المتوسطة كل يوم حتى يوم 4. ملاحظة: الخلايا الليفية الإنسان أن تصبح PiPSC بعد 4 أيام من إعادة برمجة. </li></ol> 3. تمايز PiPSC إلى غشائي وخلايا العضلات الملساء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PiPSC البذور على أطباق المغلفة قبل الكولاجين IV تحتوي DM لمدة 4 أيام للحث على التمايز إلى SMCS. تغيير المتوسطة كل يوم حتى يوم 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PiPSC البذور على الكولاجين IV-المغلفة قبل أطباق جontaining البطانية-DM لمدة 6 أيام للحث على التمايز في الخلايا البطانية. تغيير المتوسطة كل يوم حتى يوم 6. </li></ol> 4. Decellularized الأبهر الكسب غير المشروع التحضير ملاحظة: ينبغي لجميع الحلول والمعدات يكون معقم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الماوس عن طريق خلع عنق الرحم وإصلاح الماوس في موقف ضعيف تحت المجهر تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع طريق القص وحول القفص الصدري لفتح التجويف الصدري. إزالة القلب والرئتين والمريء لفضح الشريان الأورطي. بلطف إزالة الدهون شبه الشريان الأورطي بالملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الشريان الأورطي من نهاية الأمامي مع مقص وعقد بلطف نهاية بالملقط حادة. فصل الشريان الأورطي من العمود الفقري وراء من قبل تشريح حادة. إغلاق بعناية جميع الشرايين المتفرعة من الشريان الأورطي عن طريق ربط مع electrocoagulator القطبين وقطع من النهاية البعيدة للربط مع مقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام حقنة 5 مل لطرد لمعة الشريان الأورطي مع 3 ملتر من محلول ملحي يحتوي على 100 U الهيبارين لمنع تشكيل جلطات الدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع نهاية الخلفي من الشريان الأورطي قبل أن فروع في الكلى. الحفاظ على سلامة الشريان الأورطي من المهم جدا خلال الإجراء بأكمله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح التجويف الشريان الأورطي مع 5 مل من 0.075٪ دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS) محلول مخفف في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقع الأبهر الصدري في 0.075٪ SDS الحل في 10 سم طبق بتري. وضع طبق بتري على شاكر المداري لمدة 2 ساعة على 150 دورة في الدقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح التجويف الشريان الأورطي مع 5 مل من برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقع الشريان الأورطي في برنامج تلفزيوني في 10 سم طبق بتري. وضع طبق بتري على شاكر المداري لمدة 2 ساعة على 150 دورة في الدقيقة في RT. تحديث PBS كل 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح التجويف الشريان الأورطي مع 5 مل من برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ decellularized الكسب غير المشروع الشريان الأورطي في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى واحد. </li></ol> 5. المزدوج البذر من PiPSC وتكييف مفاعل حيوي ملاحظة: جميع حليجب أن تكون الصورة والمعدات المعقمة. أداء جميع العمليات في نسيج الثقافة هود. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع الدوائر تدفق مفاعل حيوي كما هو موضح في الشكل رقم 1. قم بتوصيل غرفة الحضانة، خزان سائل الإعلام، مضخة تحوي غرفة والامتثال الأنابيب. حجم الحد الأدنى من المتوسط ​​اللازمة للتداول هو 40 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشرط المسبق السفينة decellularized مع الثقافة المتوسطة عن طريق نقع الشريان الأورطي في DM المتوسطة في 10 سم طبق بتري. وضع طبق بتري على شاكر المداري لمدة 1 ساعة على 50 دورة في الدقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضاف 1 سم طول أنابيب نايلون (OD 0.9 ملم، ID 0.75 مم) في كلا طرفي السفينة decellularized تحت المجهر. ربط السفينة وأنابيب مع 8-0 خيوط الحرير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع الكسب غير المشروع الشريان الأورطي decellularized في غرفة الحضانة من خلال ربط أنابيب نايلون مع مدخل ومخرج الموانئ (1/32 &quot;أنابيب) من جدار الغرفة. الحفاظ على غرفة الحضانة مع 5mls من المتوسط ​​في كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض للتريبسين PiPSC بإضافة قبل حرارةالتربسين لتغطية الطبق الثقافة وصخرة بلطف الطبق 10 مرات. تجاهل التربسين وترك الطبق في الحاضنة لمدة 2-3 دقيقة. إضافة قبل تحسنت مستنبت في طبق وتخلط المتوسطة مع الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. الطرد المركزي اثنين aliquots من تعليق خلية تحتوي على 5 × 10 5 خلايا لكل لمدة 5 دقائق في 300 × ز. نضح طاف تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الشفط طاف تماما، و resuspend 1 بيليه من نقطة الكريات الخلايا في 50 ميكرولتر من DM. حقن هذا تعليق خلية في التجويف سفينة decellularized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم، و resuspend الآخرين بيليه الخلية نقطة في 100 ميكرولتر من Matrigel. ماصة بعناية الخليط على الشريان الأورطي الكسب غير المشروع decellularized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتظار لمدة 10 - 15 دقيقة حتى يتحول الخليط إلى دولة مثل هلام وبشكل متساو يلتف حول السطح الخارجي السفينة. ملء غرفة الحضانة مع DM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مفاعل حيوي كله وضع في 5٪ CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية. تدوير يدويا الكسب غير المشروع decellularized 90 درجة حول المحور الطولي كل نصف ساعة في ساعة 2 الأولى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حافظ على ثقافة ثابتة لمدة 12 ساعة لتمكين التصاق الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقديم DM من خلال التجويف بواسطة مضخة تحوي للحث على نحو سلس تمايز الخلايا العضلية. بدء معدل التدفق الأولي في 5 مل / دقيقة وزيادة تدريجية إلى 20 مل / دقيقة أكثر من 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على معدل التدفق المتوسط ​​المتداولة في 20 مل / دقيقة لمدة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف تدفق المتوسط ​​ونقل مفاعل حيوي يحدد من الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة البذور لمعة من الكسب غير المشروع مع PiPSC. يعرض للتريبسين، عد وأجهزة الطرد المركزي 1 × 10 6 PiPSC كما في الخطوات 5،5-5،6. resuspend الخلايا في 50 ميكرولتر من EGM-2 المتوسط ​​تحتوي على 50 نانوغرام / مل VEGF. حقن الخليط خلية في التجويف من الكسب غير المشروع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير المتوسطة في غرفة الحضانة والدورة الدموية كله لEGM-2 المتوسط ​​تحتوي على 50 نانوغرام / مل VEGF للحث على تمايز البطانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل مفاعل حيوي وضع العودة إلى thالبريد الحاضنة. تدوير يدويا الكسب غير المشروع 90 درجة كل 30 دقيقة في ساعة 2 الأولى ومن ثم الحفاظ على ثقافة ثابتة لمدة 12 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تعميم تدفق من 5 مل / دقيقة وزيادة تدريجية إلى 35 مل / دقيقة. الحفاظ على معدل التدفق في 35 مل / دقيقة لمدة 5 أيام. تغيير تعميم وغرفة متوسطة كل يوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الكسب غير المشروع هندسيا لمزيد من التطعيم إلى الماوس. </li></ol> 6. مسمار مزدوج المصنف PiPSC الكسب غير المشروع في الفئران <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام NOD.CB17-Prkdc SCID / NcrCrl ذكور الفئران كمتلقين سفينة الكسب غير المشروع. تأكد دائما أن الفئران هي حوالي 10 أسابيع من العمر، تزن حوالي 25 - 35 جم، وتكون في حالة صحية جيدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الماوس المتلقي عن طريق إعطاء مزيج من Hypnorm (25 ملغ / كلغ) وHypnovel (25 ملغ / كلغ) البريتونى. تطبيق الفازلين مرهم للعين على العيون لمنع جفاف بينما تحت التخدير. تأكيد التخدير كفاءة من خلال ضمان أن الفئران لها استرخاء العضلات والتنفس بشكل مطرد. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الماوس في موقف ضعيف مع عنقه حلق ومددت. إدارة سلفات الأتروبين (1.7 ملغ / كلغ) في تركيبة مع أدوية التخدير للتأكد من أن الجهاز التنفسي الماوس لا يزال واضحا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد شق خط الوسط من الفك السفلي لعظمة القص من الفأرة. تحت المجهر تشريح مع 5- إلى 10 أضعاف التضخيم، ورفع الغدد اللعابية اليمنى أفقيا وإزالة العضلات ترقوي خشائي الصحيحة لفضح الصحيح الشريان السباتي المشترك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف إزالة الأنسجة المرفقة لتعبئة الصحيح الشريان السباتي المشترك من نهاية البعيدة نحو نهاية القريبة. Ligate الجزء الأوسط من الشريان السباتي المشترك مرتين مع خياطة الحرير 8-0 وتشريح بين علاقات البلدين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمر عبر صفعة مصنوعة من autoclavable أنبوب النايلون في نهاية كل سفينة وإصلاح كل طرف مع المشابك microhemostat. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة خياطة ربطة عنق واحدة على نهاية وتطبيق قطرة من الهيبارين (100 U / مل). بعدها مباشرة، عكس النهاية البعيدة من الالشريان الإلكترونية لتغطي الجسم كله صفعة وإصلاح السفينة المقلوبة مع خياطة 8-0 الحرير لالكفة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر نفس الإجراء إلى الجزء الآخر من الشريان. الشريان مطاردة مع محلول ملحي لإزالة جلطات الدم. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زرع الكسب غير المشروع سفينة decellularized بين طرفي من الشريان السباتي عن طريق تحريك نهايات سفينة decellularized من خلال الأصفاد الشريان وتحديد ذلك مع 8-0 خيوط الحرير. إزالة المشابك الأوعية الدموية من أي تنتهي قبل تقييم نبض من الكسب غير المشروع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الغدة اللعابية الحق في العودة إلى موقعها الأصلي. إغلاق الجلد على موقع الجراحية مع خياطة متقطعة باستخدام خياطة 6-0 polyglactin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة العلامات الحيوية باستمرار من الماوس بعد الانتهاء من إجراءات، حتى يستأنف الوعي. التضحية الفئران المتلقي عن طريق عنق الرحم التفكك والأوعية الحصاد الطعوم إما 24 ساعة أو 3 أسابيع في وقت لاحق لمزيد من التحليل. </li></ol>

<ol><li>Kurobe, H., Maxfield, M. W., Breuer, C. K., Shinoka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+Tissue-Engineered+Vascular+Grafts+for+Cardiac+Surgery%3A+Past%2C+Present%2C+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Concise Review: Tissue-Engineered Vascular Grafts for Cardiac Surgery: Past, Present, and Future.</a> Stem Cells Transl Med. 1 (7), 566-571 (2012).</li>
<li>Jonas, R. A., Freed, M. D., Mayer, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+follow-up+of+patients+with+synthetic+right+heart+conduits%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term follow-up of patients with synthetic right heart conduits.</a> Circulation. 72, II77-II83 (1985).</li>
<li>Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technology+insight%3A+the+evolution+of+tissue-engineered+vascular+grafts-from+research+to+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Clin+Pract+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Technology insight: the evolution of tissue-engineered vascular grafts-from research to clinical practice.</a> Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, 389-395 (2007).</li>
<li>Zhang, W. J., Liu, W., Cui, L., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+blood+vessel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of blood vessel.</a> J Cell Mol Med. 11, 945-957 (2007).</li>
<li>Cearbhaill, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+mesenchymal+stem+cells+to+the+biomechanical+environment+of+the+endothelium+on+a+flexible+tubular+silicone+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Response of mesenchymal stem cells to the biomechanical environment of the endothelium on a flexible tubular silicone substrate.</a> Biomaterials. 29, 1610-1619 (2008).</li>
<li>Gong, Z., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-diameter+human+vessel+wall+engineered+from+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+%28hMSCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs).</a> FASEB J. 22, 1635-1648 (2008).</li>
<li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-expression+of+HSP47+augments+mouse+embryonic+stem+cell+smooth+muscle+differentiation+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Over-expression of HSP47 augments mouse embryonic stem cell smooth muscle differentiation and chemotaxis.</a> PLoS One. 9 (1), e86118(2014).</li>
<li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+functional+CD34%2B+progenitor+cells+by+combined+modulation+of+the+MEK%2FERK+and+BMP4+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells into functional CD34+ progenitor cells by combined modulation of the MEK/ERK and BMP4 signaling pathways.</a> Blood. 116, 5762-5772 (2010).</li>
<li>Samuel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functionally+competent+and+durable+engineered+blood+vessels+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Generation of functionally competent and durable engineered blood vessels from human induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 12774-12779 (2013).</li>
<li>Margariti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+fibroblasts+into+endothelial+cells+capacble+of+angiogenesis+and+reendothelialization+in+tissue-engineered+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of fibroblasts into endothelial cells capacble of angiogenesis and reendothelialization in tissue-engineered vessels.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 13793-13798 (2012).</li>
<li>Karamariti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+cells+differentiated+from+reprogrammed+embryonic+lung+fibroblasts+through+DKK3+signaling+are+potent+for+tissue+engineering+of+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle cells differentiated from reprogrammed embryonic lung fibroblasts through DKK3 signaling are potent for tissue engineering of vascular grafts.</a> Circ Res. 112, 1433-1443 (2013).</li>
<li>Udelsman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+operator-independent+method+for+seeding+tissue-engineered+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of an operator-independent method for seeding tissue-engineered vascular grafts.</a> Tissue Eng Part C Methods. 17 (7), 731-736 (2011).</li>
<li>Cearbhaill, E. D., Murphy, M., Barry, F., McHugh, P. E., Barron, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+human+mesenchymal+stem+cells+in+fibrin-based+vascular+tissue+engineering+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Behavior of human mesenchymal stem cells in fibrin-based vascular tissue engineering constructs.</a> Ann Biomed Eng. 38 (3), 649-657 (2010).</li>
<li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+control+vascular+stem%2Fprogenitor+cell+plasticity+through+tumor+necrosis+factor-%CE%B1-mediated+nuclear+factor-%CE%BAB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Macrophages control vascular stem/progenitor cell plasticity through tumor necrosis factor-α-mediated nuclear factor-κB activation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (3), 635-643 (2014).</li>
<li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sirolimus+stimulates+vascular+stem%2Fprogenitor+cell+migration+and+differentiation+into+smooth+muscle+cells+via+epidermal+growth+factor+receptor%2Fextracellular+signal-regulated+kinase%2F%CE%B2-catenin+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Sirolimus stimulates vascular stem/progenitor cell migration and differentiation into smooth muscle cells via epidermal growth factor receptor/extracellular signal-regulated kinase/β-catenin signaling pathway.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (10), 2397-2406 (2013).</li>
<li>Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+matrices%3A+State+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture matrices: State of the art.</a> Tissue Eng Part B Rev. 14, 61-86 (2008).</li>
<li>Hung, H. S., Hsu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Advances+of+stem+cell-based+approaches+to+tissue-engineering+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22OA+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Current Advances of stem cell-based approaches to tissue-engineering vascular grafts.</a> OA Tissue Engineering. 1 (1), 2(2013).</li>
<li>Quint, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+tissue-engineered+blood+vessel+as+an+arterial+conduit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (22), 9214-9219 (2011).</li>
<li>Zhang, X., Xu, Y., Thomas, V., Bellis, S. L., Vohra, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+an+antiplatelet+adhesion+layer+on+an+electrospun+scaffold+using+porcine+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Engineering an antiplatelet adhesion layer on an electrospun scaffold using porcine endothelial progenitor cells.</a> J Biomed Mater Res A. 97 (2), 145-151 (2011).</li>
<li>Hibino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+use+of+an+induced+puripotent+stem+cell+sheet+for+the+construction+of+tissue-engineered+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the use of an induced puripotent stem cell sheet for the construction of tissue-engineered vascular grafts.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 143 (3), 696-703 (2012).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+to+engineer+small-diameter+vascular+grafts+from+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Artif+Organs%22%5BJournal%5D)">A novel strategy to engineer small-diameter vascular grafts from marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Artif Organs. 36 (1), 93-101 (2012).</li>
<li>Tsai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+stem+cells+to+neointimal+formation+of+decellularized+vessel+grafts+in+a+novel+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Contribution of stem cells to neointimal formation of decellularized vessel grafts in a novel mouse model.</a> Am J Pathol. 181 (1), 362-373 (2012).</li>
<li>Kasimir, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+decellularization+procedures+of+porcine+heart+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Artif+Organs%22%5BJournal%5D)">Comparison of different decellularization procedures of porcine heart valves.</a> Int J Artif Organs. 26 (5), 421-427 (2003).</li>
<li>Stephenson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+propagation+of+human+embryonic+stem+cell+lines+from+frozen+embryos+in+an+animal+product-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation and propagation of human embryonic stem cell lines from frozen embryos in an animal product-free environment.</a> Nature Protocols. 7, 1366-1381 (2012).</li>
<li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).</li>
<li>McCall, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarction+and+intramyocardial+injection+models+in+swine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine.</a> Nature Protocols. 7, 1479-1496 (2012).</li>
<li>Olausson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+an+allogeneic+vein+bioengineered+with+autologous+stem+cells%3A+a+proof-of-concept+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study.</a> Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).</li>
</ol>

الكتاب ليس لديهم مصالح مالية متضاربة.

ويشير البروتوكول الحالي لوسريعة استراتيجية سليمة وبسيطة وفعالة وقابلة للتكرار الذي يمكن توليد الأنسجة المهندسة السفن الوظيفية باستخدام PiPSC من الخلايا الليفية الإنسان. هذه التقنية تمثل أداة قيمة للطب التجديدي، هندسة الأنسجة والعلاج بالخلايا يحتمل المريض محددة في المستقبل القريب. وتشمل الخطوات الحاسمة لضمان فعالية بروتوكول إعداد PiPSC، وإعداد ترقيع الشريان الأبهر معقمة وdecellularized بالكامل، بذر ناجحة والتفريق بين PiPSC في السقالات والحفاظ على عقم ترقيع الشريان الأبهر في مفاعل حيوي الأوعية الدموية. لبدء الجيل الناجح لترقيع الأنسجة المهندسة، فإنه من الأهمية بمكان لضمان أن إعداد PiPSC ونفذت على نحو فعال. بروتوكول تمت بنجاح &quot;برمجة&quot; خط الخلية الليفية البشري إلى PiPSC عبر nucleofection مع البلازميد pCAG2LMKOSimO OSKM. وsurvivآل الخلايا الليفية بعد nucleofection تعتمد على عدة نقاط رئيسية مثل استخدام البلازميدات OSKM جودة عالية، البلازميدات تركيزات تتراوح بين 500 - 1،000 نانوغرام / ميكرولتر، وتجنب التأخير في البذر من الخلايا الليفية مباشرة بعد nucleofection باسم خلايا حساسة بشكل خاص بعد إدخال البلازميدات كبيرة نسبيا، وأخيرا إضافة FGF-2 وهو أمر حاسم وينبغي أن يضاف إلى وسائل الإعلام الطازجة فقط قبل الاستخدام. بالإضافة إلى ذلك، وجدنا أنه من الضروري استخدام الخلايا لمدة تصل إلى مرور 9 لتجنب الشيخوخة تنسخي، لضمان كفاءة &quot;إعادة برمجة&quot; في PiPSC والتمايز لاحقا إلى خلايا البطانية والعضلات الملساء. نقاء PiPSC يمكن تحسين اختيار الخلايا nucleofected مع النيوميسين. البلازميد pCAG2LMKOSimO لديه الجين المقاوم بالنيوميسين وبالتالي إضافة النيوميسين في مجموعة من 25 ميكروغرام / مل بعد يوم واحد nucleofection لمدة 3 أيام سيؤدي في اختيار من السكان نقية منPiPSC. مهندس سفينة PiPSC فعالة للتطعيم في الفئران، رأيناها على سلامة والعقم من aortas decellularized أن تكون ذات أولوية قصوى. للحفاظ على سلامة aortas قبل وبعد decellularization، كان من الضروري أن تطبق باستمرار البراعة اليدوية في حين التعامل مع السفن، كما كانت هشة نسبيا وضآلة كبيرا من حيث الحجم. وكانت إزالة فعالة من الأنسجة المحيطة بالأوعية وختم المتفرعة الشرايين باستخدام ثنائي القطب الكهربائي مخثار حاسمة لضمان احق البذر الخلية المختصة وتجنب تسرب سائل الإعلام. في أي لحظة، ونحن ضمان أن جميع المواد والأجهزة المستخدمة لتوليد مفاعل حيوي كانت (أي ملقط، وأنابيب وقوارير والغرف، ومقص، ومحولات والموصلات) autoclavable، وبالتالي تقليل مخاطر التلوث الجرثومي والفشل الطعوم الوعائية قبل الجراحة . في حين أن البروتوكول الحالي يحمل التطبيقات السريرية الواعدة في فردوس القلب والأوعية الدمويةASES، وهناك عدد قليل من القيود التي ينبغي تحسينها في المستقبل القريب لمواصلة تعزيز منهجية. حتى الآن، تم عرض عوامل النسخ OSKM في الخلايا الليفية الإنسان عبر nucleofection. في حين أن هذا الأسلوب هو بسيطة نسبيا ومباشرة، وأسفرت أيضا عن الكفاءة ترنسفكأيشن متغيرة في بعض الأحيان التجريبية المختلفة. والجدير بالذكر، يمكن التغلب على هذا التناقض من خلال إدخال خطوة إضافية من اختيار النيوميسين المذكورة آنفا. وبالمثل، يمكن للمرء أن ينظر مقدمة من العوامل الأربعة في الخلايا الليفية الإنسان باستخدام التكامل الفيروسة البطيئة، والتي قد يحتمل زيادة كفاءة &quot;إعادة برمجة&quot; وتعزيز بقاء الخلايا بعد الإصابة. من حيث مفاعل حيوي، وجدنا أن decellularization كاملة من aortas يمكن تحقيقه باستخدام 0.075٪ SDS. على الرغم من أن هذا الأسلوب كان يعتبر الأمثل لإزالة الخلايا بالمقارنة مع المنظفات الأخرى (على سبيل المثال، تريتون X-100)، فإنه قد يسبب ومع ذلك عالتعديلات otential داخل هياكل جدا من البروتينات المصفوفة خارج الخلية 23. ولهذه الظاهرة يستوجب استراتيجيات decellularization أكثر كفاءة للحد من اختلال المرتبطة البروتينات المصفوفة خارج الخلية. بالإضافة إلى ذلك، رأيناها أيضا أن قطر وجدار سمك aortas decellularized تختلف بين الفئران، اعتمادا على السن والسلالة والخلفية، وبالتالي يسبب اختلافات محتملة في سرعة تدفق وإجهاد القص داخل المفاعلات الحيوية وتوزيع PiPSC التالية PiPSC البذر . كل هذا لا يزال بحاجة إلى توضيح. هذا البروتوكول وصفت هنا توليد الأنسجة المهندسة وظيفية ترقيع باستخدام PiPSC التي تحمل إمكانات واعدة لالتطبيقات السريرية في المستقبل في العلاج بالخلايا الجذعية لمرض القلب والأوعية الدموية. هذه العملية التي يستخدم برمجة مباشرة من النسب الجسدية واحد (الليفية) إلى آخر (إما خلايا العضلات الملساء أو البطانية) من خلال تخطي pluripotency قد يكون وسيلة للحصول على خلايا آمنة ومناسبة للاهتمام. في الواقع، وقد نشرت عدة بروتوكولات لوصف جيل من خطوط الخلايا الجذعية من الأجنة البشرية، وخلايا الجذع والخلايا الجذعية البالغة 24-26، والتي مع ذلك لا تزال تثير فيما يتعلق بقضايا فيما يتعلق باستخدامها في العيادة. ومن المعروف الآن أن PiPSC لا تتطور مسخي المبيض في الفئران SCID، وبالتالي القضاء على القلق من تشكيل الورم. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا تستغرق وقتا أقصر بكثير لتوليد والثقافة والتفريق 10،11، وقد أظهرت لتوليد الأنسجة المهندسة السفن ترقيع ناجحة وظيفية قابلة للمقارنة لaortas الأم. ولذلك، PiPSC الحاضر كمصدر خلية واعد لعلاج المرضى الذين يستخدمون العلاج بالخلايا شخصية لأن الخلايا الليفية (على سبيل المثال، من الجلد) يمكن أن تستمد من شخص معين. النظام سفينة decellularised في هذا البروتوكول يوفر نموذج أكثر بيوميمتيك التي توفر خلايا المصنف مع extracellulالبروتين مصفوفة AR الذي هو أكثر تمثيلا لتلك التي من الشريان الأورطي الأصلي 11. هذه النقاط الرئيسية هي حاسمة لضمان بقاء والتمايز وظائف الخلايا والأنسجة المهندسة المصنفة السفن بعد ذلك. أظهرت دراسة حديثة أجرتها Sumitran-Holgersson وزملاؤه إعادة تعمير الناجح لdecellularized سابقا الكسب غير المشروع illiac الوريد من شخص متوفى قبل engraftment 27، وبالتالي الافتراض قيمة متعدية من البروتوكول الحالي إلى البشر في المستقبل القريب. وعلاوة على ذلك، يجوز للترقيع الأوعية decellularized تمثل نموذجا جيدا التي يمكن تقييم دور والسلوك من أنواع الخلايا الوعائية الأخرى التي تسهم أيضا في ترقيع الأنسجة المهندسة. ويمكن لهذا النظام النموذجي في الفئران توفر أداة قوية لفحص المخدرات في المستقبل، وأيضا في توضيح الآليات الخلوية والجزيئية المشاركة في الأوعية الدموية بيولوجيا الخلايا الجذعية. أخذت معا، فإن البروتوكول الحالي يحمل قيمة واعدة لتطبيقه في VASCهندسة الأنسجة الجزيئية وطفرة في الطب شخصية.

بناء قنوات الأوعية الدموية هي استراتيجية أساسية للإصلاح الجراحي للتلف وإصابة الأوعية الناتجة عن أمراض القلب والأوعية الدموية. حتى الآن، والمواد الكسب غير المشروع المستخدمة في الجراحة وتشمل حيويا البوليمرات الاصطناعية (تترافلوروإيثيلين [تفلون]، وسعت تترافلوروإيثيلين [EPTFE، غور تكس] أو البولي ايثلين [الداكرون])، المغايرة، الأنسجة ذاتي (التامور أو الوريد الصافن) وxenografts 1. في حين الطعوم الاصطناعية (على سبيل المثال، غور تكس والداكرون) هي الأكثر شيوعا، وهذه المواد المحتمل أن يسبب العديد من المضاعفات على المدى القصير والمدى الطويل التي تشمل تضيق، ترسب الكالسيوم وخثرات الانصمام والالتهابات. على الرغم من أن المرضى الذين يعانون من الطعوم البيولوجية الحالية مع تراجع أحداث خثرات صمية، فإنها لا تزال تواجه القيود مثل فشل الكسب غير المشروع الثانوي والمتانة تقصير بسبب تدهور تكلس 2. لذلك، على الرغم من التحسينات الكبيرة في تي الجراحيةلا تزال مثقلة echniques على مر السنين، والباحثين والأطباء مع ضرورة تحديد قناة مثالية لأمراض الأوعية الدموية. وفي الآونة الأخيرة، وقد ولدت مجال أبحاث هندسة الأنسجة الوعائية مفهوم التي تدرج بها الخلايا في السقالات القابلة للتحلل، وذلك بهدف خلق بيئة بيوميمتيك التي تجسد سفينة الوظيفية لنجاح تطعيم 1. في الأساس، فإن نجاح يبني الأوعية الدموية يعتمد على ثلاثة عناصر أساسية. الخلايا التي تتكون من سقالة، أي طبقة داخلية خلية البطانية وطبقة الخلايا العضلية الملساء، سقالة تحتوي على المصفوفة خارج الخلية المناسبة لتوفير الخصائص الميكانيكية مماثلة لالأوعية الدموية الأصلي، والإشارات الجزيئية / الخلوي ما هو مطلوب لبدء / تنظيم إصلاح. طويلة المدى المباح الكسب غير المشروع والتنمية المستدامة للأنسجة الجدد تعتمد اعتمادا كبيرا على بذر خلية فعالة السقالات، عشرereby تقديم قرار نوع من الخلايا ذات أهمية حاسمة. وتظهر عدة تقارير استخدام البطانية ناضجة وخلايا العضلات الملساء من مصادر مختلفة لتطوير قنوات صغيرة قطرها 3-6. وعلى الرغم من واعدة، وعدم وجود السفن ذاتي كافية للحصول تبقى البطانية ناضجة وخلايا العضلات الملساء عبئا كبيرا. وفي الآونة الأخيرة، تم استغلال الخلايا الجذعية من مصادر مختلفة لتطبيقات هندسة الأنسجة الوعائية. خلايا وحيدات النوى في الواقع، ومجموعة متنوعة من أنواع الخلايا الجذعية بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية 7، الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) 8،9، PiPSC 10،11، والمستمدة نخاع العظم 12، الخلايا الجذعية الوسيطة 13، الخلايا الاصلية البطانية وجدار الوعاء الدموي الكبار -derived الخلايا الجذعية مستضد 1 (SCA-1) + الخلايا الجذعية / السلف كلها قد أثبتت 14،15 لتكون قادرة على التمايز إلى خلايا إما البطانية وظيفية أو العضلات الملساء ردا على وسائل الاعلام محددة وشروط الثقافة. وعلاوة على ذلك، فإن القدرة تجديد الذات غير محدودة من الخلايا الجذعية جعلها المرشحين الأفضل على عكس البطانية ناضجة وخلايا العضلات الملساء التي يمكن أن يقسم إلا لعدد محدود من المرات قبل ان يخضع لاعتقال النمو والشيخوخة. اختيار المواد سقالة لتوليد الأنسجة ناجحة سفينة هندسيا للتطعيم يعتمد على عدة عوامل مثل توافق مع الحياة، خصائص النشاط الحيوي، ومعدل التحلل البيولوجي. في الأساس، والمواد المستخدمة في إنشاء السقالات لترقيع يجب أن تكون قابلة للتحلل ولن جبل المتلقي لزوم لها الاستجابات المناعية. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تشمل المسامية مناسبة والمجهرية لمرفق الخلية والبقاء على قيد الحياة لاحق. حتى الآن، والمواد الأكثر شيوعا لالسقالات في هندسة الأنسجة الوعائية وتشمل البوليمرات من حمض polyglycolic، عديد حمض اللبنيك، وبولي ε-caprolactone 16. وفي الآونة الأخيرة، المواد البيولوجية decellularized لهاكما تم تطبيقه مع بعض النجاح. وقد أظهرت العديد من المختبرات التي البذر السفن الخنازير البشرية decellularized، والكلاب أو مع خلايا ذاتي قدمت الكسب غير المشروع البيولوجي التي قاومت تخثر وباطنة تضخم 17-19. وتشمل الاستراتيجيات الأخرى في هندسة الأنسجة الوعائية خارج الخلية ترقيع الأوعية الدموية القائمة على البروتينات المصفوفة على سبيل المثال، بذر الخلايا في الليفين هلام 13 وأوراق خلية توليد دون دعم سقالة 20 و 21. يوضح البروتوكول الحالي تمايز PiPSC الإنسان في البطانية الوظيفية وخلايا العضلات الملساء، وتوليد مفاعل حيوي يتكون من سقالة سفينة decellularized لإيواء خلايا الأوعية الدموية PiPSC المشتقة وظيفية، وترقيع الأوعية الأنسجة المهندسة إلى نقص المناعة الشديد مجتمعة (SCID ) الفئران. PiPSC تشكل نوع من الخلايا الأمثل لاستخدامها لهندسة الأنسجة الطعوم السفينة لأن هذه الخلايا لا تشكل الأورام في الفئران أو رفع الأخلاقي وردود ألو-المناعية. وعلاوة على ذلك، لقد أظهرنا أن استراتيجية لتوليد بالنقاط، البطانية الخلايا ونقطة على نحو سلس خلايا العضلات هي فعالة وقابلة للتكرار 10،11. بعد ذلك، قمنا بتصميم سفينة decellularized لزرع البذور من خلايا الأوعية الدموية PiPSC المشتقة من لتقليد بشكل وثيق البروتينات المصفوفة موجود داخل سفينة الأم، وبالتالي تعزيز التطعيم وبقاء فعالية. وعلاوة على ذلك، فإن decellularization من السفن قبل PiPSC البذر يمنع وقوع الاستجابات الالتهابية التي شنت من قبل أنواع الخلايا المناعية مثل الضامة. الأهم من ذلك، هذا البروتوكول لا تمثل سوى منهجية لتوليد واعدة قنوات الأوعية الدموية للترجمة إلى البشر، ولكنها توفر أيضا وسيلة قيمة لدراسة وفهم الآليات الجزيئية التي تتحكم في تجديد الأنسجة الوعائية من خلال نماذج الماوس.

<table><tbody><tr><td>Human Fibroblasts CCL-153</td><td>ATCC</td><td>CCL-153</td><td>Prenatal human embryonic fibroblasts</td></tr><tr><td>ATCC F-12K Medium (Kaighn&#039;s Modification of Ham&#039;s F-12 Medium)</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM medium optimized for embryonic stem cells</td><td>Life technologies (Gibco)</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Life technologies (Invitrogen)</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Human Basic FGF-2&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-837</td><td></td></tr><tr><td>alpha-MEM medium</td><td>Life technologies (Invitrogen)</td><td>32571093</td><td></td></tr><tr><td>Human PDGF</td><td>R&amp;amp;D System</td><td>120-HD-001</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin Solution 2%</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC)</td><td>Addgene</td><td>20866</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;PvuI Restriction Enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>RO150S</td><td></td></tr><tr><td>SureClean Plus</td><td>Bioline</td><td>BIO-37047</td><td></td></tr><tr><td>Nucelofection Kit (NHDF Kit)</td><td>LONZA</td><td>VPD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin</td><td>SIGMA</td><td>G418</td><td></td></tr><tr><td>KL 1500 LCD, Illumination for Stereo Microscopy</td><td>SCHOTT</td><td>KL 1500 LCD</td><td>Cold light illumination for stereo microscopy</td></tr><tr><td>Nikon Zoom Steromicroscope SMZ800</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>10% SDS Stock Solution Molecular Biology Reagent</td><td>Severn Biotech</td><td>CAS 151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (10mg/ml)</td><td>BD</td><td>A6661</td><td></td></tr><tr><td>Shaker IKA Vibrax with Shaking platform VX 7&amp;nbsp;</td><td>Jepson Bolton&#039;s, Janke&amp;amp;Kunkel</td><td>S32-102</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Digital Pump Drive</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-07523-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 6-channel, 6-roller cartridge pump head</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-15</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S large cartridges for pump head</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-75</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14, 25 ft</td><td>Cole-Parmer&amp;nbsp;</td><td>WZ-96410-14</td><td>Tubing goes through the peristaltic pump</td></tr><tr><td>0.5mm ID, 0.8 mm OD Silicone Tubing</td><td>SILEX</td><td>N/A</td><td>Tubings connect incubation chamber, media reservoir and compliance chamber&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fitting Reducer 0.5 to 1.6, natural Polypropyline</td><td>Ibidi</td><td>10829</td><td>Adapter connect above two types of tubings</td></tr><tr><td>1/32&quot; Tubing, ID 0.01&quot; (250&amp;micro;m) Material: PEEK</td><td>LabSmith</td><td>T-132-010P</td><td>Tubing through the incubation chamber wall which connects the graft with outside tubing</td></tr><tr><td>One-Piece Fittings&amp;nbsp;</td><td>LabSmith</td><td>T-132-100</td><td>Fix the above tubings through the incubation chamber wall</td></tr><tr><td>Nylon tubes (OD 0.9mm, ID 0.75mm)&amp;nbsp;</td><td>Smiths Medical</td><td>N/A</td><td>Tubings insert into two ends of the aorta graft</td></tr><tr><td>NOD.CB17-Prkdc&lt;sup&gt;scid&lt;/sup&gt;/NcrCrl mouse</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgical sutures, 8-0&amp;nbsp; silk</td><td>ETHICON</td><td>W819</td><td></td></tr><tr><td>Hypnorm</td><td>Vetapharm</td><td>Vm21757/4000</td><td>Neuroleptanalgesic for use in mice</td></tr><tr><td>Hypnovel (Midazolam)</td><td>Roche</td><td>59467-70-8</td><td>Induction of anaesthesia</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Tubing</td><td>Portex LTD</td><td>800/200/100/200</td><td>0.65 mm in diameter and 1 mm in length; to make artery cuff</td></tr><tr><td>Electrocoagulator</td><td>Martin&amp;nbsp;</td><td>SN 54.131</td><td>Ligation of artery branches on aorta</td></tr><tr><td>Bipolar micro hemostat forceps</td><td>Martin</td><td>80-91-12-04</td><td>Fixation of vessel ends</td></tr><tr><td>Vessel Dilator</td><td>S&amp;amp;T</td><td>JFX-7</td><td></td></tr><tr><td>Vessel Dilator</td><td>S&amp;amp;T</td><td>JFL-3dZ</td><td></td></tr><tr><td>Vessel Dilator</td><td>S&amp;amp;T</td><td>D-5aZ</td><td></td></tr><tr><td>Mini applier&amp;nbsp;</td><td>AESCULAP</td><td>FE572K</td><td></td></tr><tr><td>Micro hemostats clips</td><td>AESCULAP</td><td>FE720K</td><td></td></tr><tr><td>Surgical sutures, 6-0 VICRYL</td><td>ETHICON</td><td>V489</td><td></td></tr></tbody></table>

generation and grafting of tissue-engineered vessels in a mouse model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

وأكد الجيل الناجح لPiPSC 4 أيام بعد nucleofecting الخلايا الليفية الإنسان مع البلازميد pCAG2LMKOSimO خطي تحمل 4 عوامل النسخ، OCT4، SOX2، KLF4 وج-MYC (OSKM). PiPSC عرض النمط الظاهري واضح بشكل ملحوظ بالمقارنة مع الخلايا الليفية (الشكل 2A)، وأعرب عن عوامل إعادة برمجة 4 في مرنا (الشكل 2B) والبروتين (الشكل 2C) مستويات 10. فعالية الكسب غير المشروع الأوعية الدموية مقرها PiPSC-تعتمد بشكل كبير على قدرة PiPSC على التمايز إلى كل من الأنساب العضلات البطانية وعلى نحو سلس. لذلك من المهم لتأكيد هذه الخصائص من PiPSC في المختبر عن طريق التفريق الخلايا في وسائل الإعلام تعريف قبل الاستفادة منها لتوليد ترقيع الأوعية الشكل 3 يبين قدرة PiPSC على التمايز إلى خلايا بطانة الأوعية الدموية وظيفية في كل من الجين (الشكل 3A) والبروتين ( الشكل 3B-D) ليفإلس، استنادا إلى علامات البطانية محددة 10. وبالمثل، PiPSC هي أيضا قادرة على التمايز إلى نسب العضلات الملساء ردا على وسائل الاعلام محددة (الشكل 3E-H) 11. وقد تحقق كله الشريان الأورطي decellularization عن طريق العلاج مع SDS، والمنظفات أنيوني أن lyses الخلايا وsolubilizes مكونات حشوية. بعد 2 ساعة من العلاج، وبدا الشريان الأورطي decellularized كما سقالة ديكي شفافة بالمقارنة مع الشريان الأورطي المقطوع حديثا (الشكل 4A-B) 22. ويوضح التقييم النسيجي في الشكل 4C-F غياب نوى أو تلطيخ حشوية في الأوعية decellularized، ولكن ليس في الشريان الأورطي الفأر العادي. بعد غرس البذور مزدوج من البطانية PiPSC المشتقة وخلايا العضلات الملساء داخل aortas decellularized، عرض الطعوم الأوعية الدموية المهندسة خصائص الخلايا العضلية البطانية وسلس على التوالي. الهيماتوكسيلين ويوزين (HE) تلطيخ للق مزدوجكشفت الطعوم eeded بنية مماثلة لتلك السفن الأم (الشكل 4G) مع طبقات متعددة من خلايا العضلات الملساء وأحادي الطبقة من الخلايا البطانية كما أكد تلطيخ إيجابي لسلسة العضلات 22α (SM22)، على نحو سلس العضلات α الأكتين (SMA) ، CD31 وعلامات CD144 على التوالي (الشكل 4H-M) 11. لتأكيد المباح من نسيج الأوعية هندسيا في الجسم الحي، والمطعمة على المصنفة السفن مزدوجة PiPSC المشتقة في الفئران - استخدمت كل من الفأر العادي والشرايين decellularized والضوابط. وأظهر تحليل لاحق أنه في حين أن الفئران المطعمة مع السفن decellularized قدمت مع ارتفاع معدلات الوفيات بشكل ملحوظ في وقت مبكر من يوم 1، تمنح PiPSC ترقيع الأوعية معدل البقاء على قيد الحياة من 60٪ بعد 3 أسابيع زرع (الشكل 5A) 11. بالإضافة إلى ذلك، تم الأسبوع 3 الطعوم PiPSC المستمدة من العمر تتميز بشكل كامل لوجود الإنسان البطانية PiPSC المستمدة من و<html> خلايا العضلات الملساء والتسلل بلعم المضيف (الشكل 5B والجدول 1) 11. أخذت معا، وتشير النتائج إلى أن PiPSC لديها القدرة على التمايز إلى كل من الأنساب الأوعية الدموية وتكون قوية لتوليد الأوعية الأنسجة المهندسة الوظيفية التي يمكن أن تكون بديلا السفن الأم في الجسم الحي. <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52565/52565fig1.jpg" /> الشكل 1. تمثيل تخطيطي للdecellularized دائرة الكسب غير المشروع تدفق مفاعل حيوي. يتم تجميعها والكسب غير المشروع سفينة decellularized في غرفة الحضانة. مضخة تحوي هي في المنبع من غرفة الحضانة لتوفير مستقر تدفق نضح المتوسط. خزان سائل الإعلام في المصب من غرفة الحضانة. غرفة الامتثال هو تحسين نظام التدفق. يشار الاتجاه تدفق من السهام.large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52565/52565fig2.jpg" /> الشكل 2. جيل من PiPSC من الخلايا الليفية الإنسان. وقد nucleofected الخلايا الليفية الإنسان مع أي أربع جينات إعادة برمجة (OCT4، SOX2، KLF4 وC-MYC) أو ناقلات الفارغة (السيطرة). (A) المرحلة الصور المقابل تظهر مورفولوجية نقطة بعد 4 أيام. وأعرب PiPSC كل عوامل النسخ الأربع، سواء في مرنا (B) وبروتين (C) المستويات. شريط مقياس للصور المعروضة هي 50 ميكرون والبيانات هي وسائل ± SEM (ن = 3)؛ * P &lt;0.05، *** P &lt;0.001. تم تعديل هذا الرقم من Margariti، A. وآخرون 10 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52565/52565fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم &lt;.</a>/ أ&gt; <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52565/52565fig3.jpg" /> الشكل 3. PiPSC يمكن أن تفرق في كل من خلايا العضلات البطانية وعلى نحو سلس. وتختلف الخلايا PiPSC أو السيطرة على الخلايا البطانية. (A) وبالمقارنة مع السيطرة على الخلايا، PiPSC المشتقة من الخلايا البطانية أعرب علامات البطانية محددة مثل CD31، CD144، مستقبلات كيناز إدراج النطاق (KDR)، البطانية سينسيز أكسيد النيتريك (أنوش) وفون ويلبراند عامل (VWF) في مرنا المستوى. (B) وأكد ذلك في مستوى البروتين باستخدام تحليل لطخة الغربي. (C) المناعي تلطيخ أشار تلطيخ الإيجابي للCD144 (VE كادهيرين) في PiPSC-البطانية، ولكن ليس السيطرة على الخلايا. (D) تحليل تدفق cytometric أكد التعبير خلية PiPSC-البطانية من CD31 و CD144. تم التفريق PiPSC (أو السيطرة خلايا) الكولاجين IV-المصنفة أيضا فيخلايا العضلات الملساء. (E، F) خلافا للسيطرة على الخلايا، أعربت خلايا العضلات الملساء PiPSC المستمدة من علامات العضلات الملساء محددة على مستوى الجينات، بما في ذلك SMA، calponin، SM22، الميوسين العضلات الملساء السلسلة الثقيلة II (SMMHC)، عامل استجابة المصل (SRF) ، myocardin، smoothelin، الإيلاستين والكولاجين 1A1. (G) وأكد مستويات التعبير عن SMA، calponin وSM22 في الخلايا PiPSC المشتقة باستخدام تحليل لطخة الغربي. (H) المناعي تلطيخ باستخدام المجهر مبائر أظهر نموذجي سلس تلطيخ علامة العضلات لcalponin وSM22. تمثل البيانات يعني ± SEM (ن = 3)؛ * P &lt;0.05، ** P &lt;0.01، *** P &lt;0.001. شريط مقياس للصور المعروضة هي 25 ميكرون أو 50 ميكرون. تم تعديل هذه الأرقام من Margariti، A. وآخرون. (10) وKaramariti، E. وآخرون 11 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52565/52565fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء</a>انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52565/52565fig4.jpg" /> الشكل 4. توليد نقرا مزدوجا المصنفة الأنسجة PiPSC المستمدة الهندسة ترقيع الأوعية الدموية. (A، B) Decellularization من الماوس الأبهر الصدري الحفاظ على هيكلها ومازال يشبه أن سفينة العادية، التكبير الأصلي 2X. (CF) سعادة تلطيخ من الشريان الأورطي decellularized أكد decellularization ناجحة والإزالة الكاملة للخلايا بالمقارنة مع الضوابط، التكبير الأصلي: 50X أو 200X. (G) سعادة تلطيخ البطانية PiPSC المشتقة وخلايا العضلات الملساء كشفت السفن نقرا مزدوجا المصنفة في العمارة التي كانت مشابهة لسفينة الأم. (J، M) PiPSC الأنسجة المهندسة السفن مزدوجة المصنف ملطخة إيجابية لالبطانية (CD31 وCD144) وخلايا العضلات الملساء (SM22 وSMA) علامات على عكس deceترقيع الأوعية llularized. (H، K) والتعبير يصاحب ذلك من علامات الأوعية الدموية وكذلك مورفولوجيا مميزة وتوطين البطانية PiPSC المشتقة وخلايا العضلات الملساء داخل المناطق الإنسي وباطنة كانت مماثلة لسفن الأم. شريط مقياس للصور المعروضة هي 50 ميكرون. تم تعديل هذه الأرقام من تساي، T. وآخرون. 22 وKaramariti، E. وآخرون 11 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52565/52565fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52565/52565fig5.jpg" /> الشكل 5. انقر نقرا مزدوجا المصنفة PiPSC المشتقة من الأنسجة المهندسة ترقيع الأوعية الدموية هي براءة اختراع لاستبدال السفن الأم في الجسم الحي. والمطعمة السفن PiPSC المشتقة في الشريان السباتي من نقص المناعة المشترك الشديد (SCID) الفئران، ومذكرة التفاهم العاديواستخدمت حد ذاته والشرايين decellularized والضوابط. (A) تحليل الفئران المطعمة مع السفن PiPSC المستمدة من أظهر 60٪ معدل البقاء على قيد الحياة بعد الجراحة 3 أسابيع، في حين أن الفئران المطعمة مع السفن decellularized قدمت مع ارتفاع معدلات الوفيات بشكل ملحوظ والبقاء على قيد الحياة أقل (20٪). تمثل البيانات سائل (ن = 10). (ب) كانت تحصد السفن الأنسجة المهندسة أيضا 3 أسابيع بعد التطعيم وتعرض للسعادة (لوحات اليسار) أو تلطيخ المناعي (لوحات اليمين) لوجود CD144 البشري وcalponin أو الماوس CD11b / CD18 (ماك-1)؛ وتتلخص الكمي لتلطيخ في الجدول 1. التكبير الأصلي للصور المعروضة هي 400X ما لم يذكر. تم تعديل هذا الرقم من Karamariti، E. وآخرون 11 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52565/52565fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tboدى&gt; <tr><td> خلايا إيجابية الميدانية (40X) </td><td> هندستها السفينة قبل التطعيم </td><td> المهندسة والأوعية الدموية الكسب غير المشروع (3 أسابيع) </td></tr><tr><td> calponin </td><td> 72 ± 9 </td><td> 22 ± 11 * </td></tr><tr><td> CD144 </td><td> 20 ± 8 </td><td> 5 ± 6 * </td></tr><tr><td> ماك-1 </td><td> 0 </td><td> 71 ± 11 * </td></tr></tbody></table> الجدول 1. توصيف السفن الأنسجة المهندسة بعد 3 أسابيع التطعيم. وكان كميا عدد البطانية PiPSC المشتقة والعضلات الملساء الخلايا والضامة المضيف التالية المناعي تلطيخ مع calponin الإنسان، CD144 الإنسان والفأر ماك-1 على التوالي. تمثل البيانات يعني ± SEM (ن = 6)؛ * P &lt;0.05، فرق كبير من السفن الأنسجة المهندسة قبل التطعيم. تم تعديل هذا الجدول من Karamariti، E. وآخرون 11

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model at JoVE.com

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

هنا، نقدم بروتوكول لتوليد الأنسجة المهندسة ترقيع الأوعية التي هي وظيفية للتطعيم في الفئران عن طريق بذر المزدوج الناجم جزئيا الخلايا الجذعية المحفزة (PiPSC) - المشتقة خلايا العضلات الملساء وPiPSC - الخلايا البطانية مشتقة على decellularized سفينة سقالة مفاعل حيوي.

جيل ومسمار سفن الهندسة الأنسجة في نموذج الفأر

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

generation-and-grafting-of-tissue-engineered-vessels-in-a-mouse-model

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.0K Views.  King's College London BHF Centre.  هنا، نقدم بروتوكول لتوليد الأنسجة المهندسة ترقيع الأوعية التي هي وظيفية للتطعيم في الفئران عن طريق بذر المزدوج الناجم جزئيا الخلايا الجذعية المحفزة (PiPSC) - المشتقة خلايا العضلات الملساء وPiPSC - الخلايا البطانية مشتقة على decellularized سفينة سقالة...

Video: Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

الطعوم الوعائية الهندسة البيولوجية ، عن طريق بناء مفاعل حيوي نابض

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. This is largely true, but there are a number of important principles that can reduce the difficulty of these procedures and enhance reproducibility. Orthotopic aortic transplantation is an excellent procedure in which to learn these principles because it involves only two end-to-end anastomoses, but requires good suturing technique and handling of the vessels for consistent success. This procedure begins with the procurement of a length of abdominal aorta from a donor animal, followed by division of the native aorta in the recipient. The procured aorta is then placed between the divided ends of the recipient aorta and sutured into place using end-to-end anastomoses. To accomplish this objective successfully requires a high degree of concentration, good tools, a steady hand, and an appreciation of how easily the vasculature of a mouse can be damaged, resulting in thrombosis. Learning these important principles is what occupies most of the beginner's time when learning microsurgery in small rodents. Throughout this protocol, we refer to these important points. This model can be used to study vascular disease in a variety of different experimental systems1-8. In the context shown here, it is most often used for the study of post-transplant vascular disease, a common long-term complication of solid organ transplantation in which intimal hyperplasia occurs within the allograft. The primary advantage of the model is that it facilitates quantitative morphometric analyses and the transplanted vessel lies contiguous to the endogenous vessel, which can serve as an additional control9. The technique shown here is most often used for mice weighing 18-25 grams. We have accumulated most of our experience using the C57BL/6J, BALB/cJ, and C3H/HeJ strains.

We describe a technique in which a section of the abdominal aorta from a mouse is transplanted orthotopically to just below the renal arteries in an allogeneic or syngeneic recipient. This technique can be useful in studies in which transplantation of large arteries of uniform size is deemed advantageous.

زرع مثلي الشريان الأورطي في الفئران لدراسة أمراض الأوعية الدموية

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. ...

Medicine

Mouse Models for Graft Arteriosclerosis

Graft arteriosclerois (GA), also called allograft vasculopathy, is a pathologic lesion that develops over months to years in transplanted organs characterized by diffuse, circumferential stenosis of the entire graft vascular tree. The most critical component of GA pathogenesis is the proliferation of smooth muscle-like cells within the intima. When a human coronary artery segment is interposed into the infra-renal aortae of immunodeficient mice, the intimas could be expand in response to adoptively transferred human T cells allogeneic to the artery donor or exogenous human IFN-&gamma; in the absence of human T cells. Interposition of a mouse aorta from one strain into another mouse strain recipient is limited as a model for chronic rejection in humans because the acute cell-mediated rejection response in this mouse model completely eliminates all donor-derived vascular cells from the graft within two-three weeks. We have recently developed two new mouse models to circumvent these problems. The first model involves interposition of a vessel segment from a male mouse into a female recipient of the same inbred strain (C57BL/6J). Graft rejection in this case is directed only against minor histocompatibility antigens encoded by the Y chromosome (present in the male but not the female) and the rejection response that ensues is sufficiently indolent to preserve donor-derived smooth muscle cells for several weeks. The second model involves interposing an artery segment from a wild type C57BL/6J mouse donor into a host mouse of the same strain and gender that lacks the receptor for IFN-&gamma; followed by administration of mouse IFN-&gamma; (delivered via infection of the mouse liver with an adenoviral vector. There is no rejection in this case as both donor and recipient mice are of the same strain and gender but donor smooth muscle cells proliferate in response to the cytokine while host-derived cells, lacking receptor for this cytokine, are unresponsive. By backcrossing additional genetic changes into the vessel donor, both models can be used to assess the effect of specific genes on GA progression. Here, we describe detailed protocols for our mouse GA models.

We describe protocols for our mouse graft arteriosclerois (GA) models which involve interposition of a mouse vessel segment into a recipient of the same inbred strain. By backcrossing additional genetic changes into the vessel donor, the model can assess the effect of specific genes on GA.

نماذج الماوس لتصلب الشرايين الكسب غير المشروع

Graft arteriosclerois (GA),  also called allograft vasculopathy, is a pathologic lesion that develops over  months to years in transplanted organs ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

تقنية جراحية لزرع الأنسجة المهندسة الأوعية الدموية الطعوم واللاحقة<em&gt; في فيفو</em&gt; الرصد

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen supply to the cell microenvironment, as passive diffusion is limited to a very thin layer. Although various materials have been described to restore the integrity of full-thickness defects of the abdominal wall, no material has yet proved to be optimal, due to low graft vascularization, tissue rejection, infection, or inadequate mechanical properties. This protocol describes a means of engineering a fully vascularized flap, with a thickness relevant for muscle tissue reconstruction. Cell-embedded poly L-lactic acid/poly lactic-co-glycolic acid constructs are implanted around the mouse femoral artery and vein and maintained in vivo for a period of one or two weeks. The vascularized graft is then transferred as a flap towards a full thickness defect made in the abdomen. This technique replaces the need for autologous tissue sacrifications and may enable the use of in vitro engineered vascularized flaps in many surgical applications.

To date, thick tissue defects are typically reconstructed by applying autologous tissue flaps or engineered tissues. In this protocol, we present a new method for engineering vascularized tissue flap bearing an autologous pedicle, to serve as a substitute to autologous flaps.

المهندسة أوعية دموية العضلات رفرف

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. The long-term clinical results showed excellent patency rates, however, with significant incidence of stenosis. To investigate the cellular and molecular mechanisms of vascular neotissue formation and prevent stenosis development in tissue engineered vascular grafts (TEVGs), we developed a mouse model of the graft with approximately 1 mm internal diameter. First, the TEVGs were assembled from biodegradable tubular scaffolds fabricated from a polyglycolic acid nonwoven felt mesh coated with &#949;-caprolactone and L-lactide copolymer. The scaffolds were then placed in a lyophilizer, vacuumed for 24 hr, and stored in a desiccator until cell seeding. Second, bone marrow was collected from donor mice and mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation. Third, approximately one million cells were seeded on a scaffold and incubated O/N. Finally, the seeded scaffolds were then implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. The implanted grafts demonstrated excellent patency (&#62;90%) without evidence of thromboembolic complications or aneurysmal formation. This murine model will aid us in understanding and quantifying the cellular and molecular mechanisms of neotissue formation in the TEVG.

To improve our knowledge of cellular and molecular neotissue formation, a murine model of the TEVG was recently developed. The grafts were implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. This model achieves similar results to those achieved in our clinical investigation, but over a far shortened time-course.

زرع الوريد الأجوف السفلي مداخلة الكسب غير المشروع في نموذج الفأر

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.

التحجيم من المهندسة الطعوم الأوعية الدموية عن طريق 3D مطبوعة أدلة والطوق زرع الطريقة

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression must be pursued. Employing vascularized bone marrow transplantation and co-transplantation of the thymus have shown promise in this regard in various animal models.1-11 Vascularized bone marrow transplantation allows for the uninterrupted transfer of donor bone marrow cells within the preserved donor microenvironment, and the incorporation of thymus tissue with vascularized bone marrow transplantation has shown to increase T-cell chimerism ultimately playing a supportive role in the induction of immune regulation. The combination of solid organ and vascularized composite allotransplantation can uniquely combine these strategies in the form of a novel transplant model. Murine models serve as an excellent paradigm to explore the mechanisms of acute and chronic rejection, chimerism, and tolerance induction, thus providing the foundation to propagate superior allograft survival strategies for larger animal models and future clinical application. Herein, we developed a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique. The experience in syngeneic and allogeneic transplant settings is described for future broader immunological investigations via an instructional manuscript and video supplement.

To study combined solid organ and vascularized composite allotransplantation, we describe a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique.

A المجهرية نموذج رواية لمنتبذ، جناح كتلة جدار الصدر، الغدة الصعترية، وزرع القلب في الفئران

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression ...

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional tissue. Tissue engineering holds great promise as a potential solution with its ability to integrate cells and signaling molecules into a 3-dimensional scaffold. Recent work with tissue engineered tracheal grafts (TETGs) has seen some success but their translation has been limited by graft stenosis, graft collapse, and delayed epithelialization. In order to investigate the mechanisms driving these issues, we have developed a mouse model for tissue engineered tracheal graft implantation. TETGs were constructed using electrospun polymers polyethylene terephthalate (PET) and polyurethane (PU) in a mixture of PET and PU (20:80 percent weight). Scaffolds were then seeded using bone marrow mononuclear cells isolated from 6-8 week-old C57BL/6 mice by gradient centrifugation. Ten million cells per graft were seeded onto the lumen of the scaffold and allowed to incubate overnight before implantation between the third and seventh tracheal rings. These grafts were able to recapitulate the findings of stenosis and delayed epithelialization as demonstrated by histological analysis and lack of Keratin 5 and Keratin 14 basal epithelial cells on immunofluorescence. This model will serve as a tool for investigating cellular and molecular mechanisms involved in host remodeling.

Graft stenosis poses a critical obstacle in tissue engineered airway replacement. To investigate cellular mechanisms underlying stenosis, we utilize a murine model of tissue engineered tracheal replacement with seeded bone marrow mononuclear cells (BM-MNC). Here, we detail our protocol, including scaffold manufacturing, BM-MNC isolation, graft seeding, and implantation.

بذر وغرس الاختلاس الرغامى السكروز هندسة الأنسجة في طراز الماوس

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

Implantation of Tissue-Engineered Vascular Graft in Mouse Carotid Artery via Cuff Technique

The development of small-diameter vascular grafts has been a global endeavor, with numerous research groups contributing to this field. Animal experimentation plays a pivotal role in assessing the efficacy and safety of vascular grafts, particularly in the absence of clinical applications. Compared to alternative animal models, the mouse implantation model offers several advantages, including a well-defined genetic background, a mature method for disease model construction, and a straightforward surgical procedure. Based on these advantages, the present study devised a simple cuff technique for the implantation of tissue-engineered vascular grafts in the mouse carotid artery. This technique began with the fabrication of polycaprolactone (PCL) small-diameter vascular grafts via electrostatic spinning, followed by the seeding of macrophages onto the grafts through perfusion adsorption. Subsequently,&#160;the cellularized tissue-engineered vascular grafts were transplanted into the mouse carotid artery using the cuff technique to evaluate patency and regenerative capability. After 30 days of in vivo implantation, vascular patency was found to be satisfactory, with evidence of neo-tissue regeneration and the formation of an endothelial layer within the lumen of the grafts. All data were analyzed using statistical and graphing software. This study successfully established a mouse carotid artery implantation model that can be used to explore the cellular sources of vascular regeneration and the mechanisms of action of active substances. Furthermore, it provides theoretical support for the development of novel small-diameter vascular grafts.

Here, a protocol is presented for the implantation of a tissue-engineered vascular graft into the mouse carotid artery using the cuff technique, providing a suitable animal model for investigating vascular tissue regeneration mechanisms.

جيل ومسمار سفن الهندسة الأنسجة في نموذج الفأر

Summary

Explore More Videos