تقييم النقل الخلوي المعوي لعزل تجرثم الدم الإشريكية القولونية الوليدي

تسبب الإشريكية القولونية الإنتان لدى حديثي الولادة الذين يتناولون البكتيريا في وقت قريب من الولادة. العملية التي تنطوي عليها قدرة الإشريكية القولونية على الانتقال من القناة المعوية إلى مجرى الدم غير مفهومة بشكل جيد. يقيم هذا النموذج في المختبر قدرة سلالات الإشريكية القولونية على السفر عبر الخلايا الظهارية المعوية.

يبتلع الأطفال حديثو الولادة سلالات الإشريكية القولونية الأمومية التي تستعمر الأمعاء في وقت الولادة تقريبا. تغزو سلالات الإشريكية القولونية ذات القدرة على الانتقال عبر القناة الهضمية مجرى دم المولود الجديد ، مسببة تجرثم الدم الذي يهدد الحياة. تستخدم المنهجية المقدمة هنا الخلايا الظهارية المعوية المستقطبة التي تزرع على إدخالات شبه منفذة لتقييم انتقال الخلايا من عزلات تجرثم الدم الإشريكية القولونية الوليدية في المختبر. تستخدم هذه الطريقة خط الخلايا المعوية T84 الثابت الذي لديه القدرة على النمو حتى التقاء وتشكيل تقاطعات ضيقة و desmosomes. بعد الوصول إلى نقطة التقاء ، تطور الطبقات أحادية T84 الناضجة مقاومة عبر الظهارة (TEER) ، والتي يمكن قياسها باستخدام الفولتميتر. ترتبط قيم TEER عكسيا بنفاذية الخلايا للمكونات خارج الخلية ، بما في ذلك البكتيريا ، عبر الطبقة الأحادية المعوية. من ناحية أخرى ، فإن مرور البكتيريا عبر الخلايا (transcytosis) ، لا يغير بالضرورة قياسات TEER. في هذا النموذج ، يتم تحديد الممر البكتيري عبر الطبقة الأحادية المعوية لمدة تصل إلى 6 ساعات بعد الإصابة ، ويتم إجراء قياسات متكررة ل TEER لمراقبة نفاذية الخلايا شبه الخلوية. بالإضافة إلى ذلك ، تسهل هذه الطريقة استخدام تقنيات مثل التلوين المناعي لدراسة التغيرات الهيكلية في الوصلات الضيقة وغيرها من بروتينات الالتصاق من خلية إلى أخرى أثناء النقل الخلوي البكتيري عبر الظهارة المستقطبة. يساهم استخدام هذا النموذج في توصيف الآليات التي يتم من خلالها نقل الخلايا القولونية الوليدية عبر ظهارة الأمعاء لإنتاج تجرثم الدم.

الإشريكية القولونية هي السبب الأكثر شيوعا للإنتان المبكر عند الأطفال حديثي الولادة¹،^2،3. يمكن أن يصل معدل وفيات تجرثم الدم الإشريكية القولونية الوليدي إلى 40٪ ، والتهاب السحايا هو أحد المضاعفات المحتملة المرتبطة بإعاقات النمو العصبي الشديدة². يمكن أن يؤدي ابتلاع سلالات الإشريكية القولونية الأمومية من قبل حديثي الولادة إلى تجرثم الدم الوليدي. تم تكرار هذه العملية في النماذج الحيوانية ^2,4. بمجرد تناولها ، تنتقل البكتيريا المسببة للأمراض من تجويف الأمعاء الوليدي عبر الحاجز المعوي وتدخل مجرى الدم ، مسببة تسمم الدم. تختلف سلالات الإشريكية القولونية الغازية الوليدية التي تنتج تجرثم الدم في قدرتها على غزو الخلايا الظهارية المعوية ^1,5. ومع ذلك ، فإن قدرتها على نقل الخلايا ظهارة الأمعاء بعد الغزو لم يتم توصيفها بالكامل.

يعد نموذج نقل الخلايا المعوية هذا طريقة مفيدة في المختبر لمحاكاة الممر البكتيري عبر ظهارة الأمعاء. الهدف العام من الطرق المقدمة في هذه المخطوطة هو مقارنة قدرة عزلات الإشريكية القولونية الوليدية على نقل الخلايا في ظهارة الأمعاء. يستخدم النموذج الموصوف هنا خلايا T84 ، وهي خلايا غدية معوية بشرية خلدة ^6,7. تزرع خلايا T84 لتلتقي على غشاء شبه نافذ مع مقصورتين منفصلتين. الأساس المنطقي لاستخدام هذه التقنية هو أنه ، كما يحدث في الجسم الحي ، تستقطب هذه الخلايا المعوية وتطور تقاطعات ضيقة ناضجة ^6,8. يصبح الجانب الملامس للغشاء هو الجانب القاعدي. يصبح الجانب الآخر من الخلايا هو الجانب القمي ، الذي يشبه تجويف الأمعاء حيث تلتصق مسببات الأمراض المبتلعة وتغزو. غشاء transwell قابل للنفاذ للبكتيريا ، لكن الخلايا المعوية المستقطبة تشكل تقاطعات ضيقة ، مما يضعف الحركة البكتيرية شبه الخلوية⁹. وبالتالي ، توفر هذه الطريقة ميزة البيئة المختبرية الخاضعة للرقابة باستخدام خط خلية بشرية لدراسة عملية نقل الخلايا البكتيرية ، بما في ذلك الطريق عبر الخلايا. في حين توجد طرق أخرى للتحقيق في انتقال الخلايا للبكتيريا عبر ظهارة الأمعاء ، فإن طريقة transwell المعروضة هنا توفر سهولة أكبر وإمكانية الوصول. تتوفر تقنيات بديلة ، مثل تلك التي تستخدم عينات خارج الجسم الحي تم إعدادها في أنظمة غرفة Using. ومع ذلك ، فإنهم يستخدمون عينات الأنسجة التي قد لا يمكن الوصول إليها بسهولة ، خاصة إذا كان البحث يهدف إلى دراسة علم وظائف الأعضاء البشرية¹⁰. تمثل الكائنات العضوية المعوية مثالا آخر على بديل في المختبر لدراسة تفاعلات البكتيريا المضيفة¹¹. بينما يمكن أيضا استخدام أحاديات الطبقات العضوية في نظام transwell لدراسة النقل الخلوي البكتيري ، فإنها تتطلب عزل ونمو الخلايا الجذعية واستخدام عوامل نمو محددة للحث على التمايز¹². وبالتالي ، فإن استخدامها يستغرق وقتا أطول ويرتبط بتكاليف أكبر مقارنة بطريقة transwell الموضحة في هذه المخطوطة.

تم إجراء تقييم الممر البكتيري عبر ظهارة الأمعاء باستخدام نظام transwell في المختبر بنجاح لمختلف مسببات الأمراض. وقد أظهرت هذه الدراسات فائدة نظام transwell باستخدام خلايا T84 لتوصيف نقل الخلايا من البكتيريا عبر ظهارة الأمعاء المستقطبة¹³،^14،15. ومع ذلك ، لم يتم وصف تطبيق طريقة transwell هذه لمقارنة قدرة نقل الخلايا لسلالات E. coli الوليدية المنتجة لتجرثم الدم بالتفصيل. توفر هذه المخطوطة للباحثين الآخرين بروتوكولا قياسيا للترانسويل موثوقا به وسهل الاستخدام ولا يتطلب موارد باهظة الثمن.

لمقارنة قدرة سلالات الإشريكية القولونية الغازية لحديثي الولادة على نقل الخلايا في ظهارة الأمعاء ، يمكن أن يصاب الجانب القمي من الطبقة الأحادية الظهارية المعوية بعدد معروف من الخلايا البكتيرية. بعد الحضانة ، يمكن جمع الوسط الموجود على الجانب القاعدي من الظهارة وتحديد كمية البكتيريا لتحديد كمية النقل الخلوي البكتيري بمرور الوقت. في هذه المخطوطة ، يتم استخدام الطرق المقدمة لدراسة قدرة نقل الخلايا للسلالات السريرية الوليدية E. coli المستعادة من الأطفال حديثي الولادة الذين تم إدخالهم إلى المستشفى بسبب تجرثم الدم. تم نشر معايير الإدراج لاختيار هذه العزلات السريرية لحديثي الولادة لدراسات نقل الخلايا سابقا¹،^2،16. عندما يتم تنفيذ هذه الطريقة باستخدام سلالات مختلفة من الإشريكية القولونية ، يمكن مقارنة قدراتها على نقل الخلايا. من خلال هذه العملية ، يوفر نموذج نقل الخلايا المعوية بيانات قيمة لتوصيف عوامل ضراوة الإشريكية القولونية التي تساهم في العملية متعددة الخطوات التي تتوج بتطور تجرثم الدم الوليدي.

ملاحظة: قم بإجراء جميع عمليات التلاعب بخلايا T84 والبكتيريا والألواح والكواشف في خزانة أمان من المستوى 2 للسلامة الحيوية (BSL-2) لتجنب التلوث. استخدم مناطق وحاضنات منفصلة لجميع الأعمال التي تنطوي على خلايا T84 المعقمة وخلايا T84 المصابة والإشريكية القولونية. تم الحصول على عزلات الإشريكية القولونية السريرية التي تم اختبارها بالطرق الموضحة هنا باتباع إرشادات مجلس المراجعة المؤسسية في مؤسستنا^1،16.

1. إعداد إدراج transcytosis مع خلايا T84 (حوالي 1-2 أسابيع قبل التجربة)

1. تنمو خلايا T84 من مجموعة الثقافة الأمريكية (ATCC) في وسط زراعة الأنسجة (TCM + المضادات الحيوية) التي تتكون من وسط النسر المعدل من Dulbecco: خليط المغذيات F-12 من لحم الخنزير (1: 1 ، التركيز النهائي: 50٪ لكل منهما) ، 5٪ مصل بقري جنيني ، و 1٪ (100 وحدة / مل) خليط مضاد حيوي مزدوج من البنسلين / الستربتومايسين. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂.
   ملاحظة: يتم استخدام شكل مختلف من هذه التركيبة المتوسطة بدون البنسلين / الستربتومايسين (TCM بدون مضادات حيوية) للخطوات اللاحقة (القسم 2 وما بعده) في الإجراء. تأكد من استخدام الصيغة الصحيحة لكل خطوة.
2. من خلال العمل داخل خزانة السلامة الحيوية (BSC) ، قم بزرع خلايا T84 في إدخالات ترانسويل لثقافة غشاء البولي إيثيلين تيريفثاليت مع مسام 3 ميكرومتر مصنوعة لألواح 24 بئرا. قم بتضمين نسخ متماثلة لإدراج transwell لكل حالة تجريبية مرغوبة بالإضافة إلى عناصر تحكم غير مصابة لمراقبة التلوث المحتمل.
   1. في لوحة مكونة من 24 بئرا مصممة لحمل إدخالات transwell ، املأ العدد المطلوب من آبار التجميع ب 1 مل من TCM + المضادات الحيوية.
   2. في كل بئر ، ضع ملحقا واحدا للترانسويل.
   3. بذرة هذه الإدخالات مع 1 × 10⁵ T84 الخلايا المعلقة في 500 ميكرولتر من TCM + المضادات الحيوية. حدد عدد الخلايا باستخدام مقياس الدم مع صبغة زرقاء تريبان أو عداد خلايا آلي¹⁷.
   4. احتضان لوحات transwell التي تحتوي على إدراج البذور في نفس الظروف التي نمت فيها الخلايا.
   5. تحقق باستخدام المجهر الضوئي من أن الطبقات الأحادية قد بدأت في أن تصبح متقاربة بعد بذر الإدراج ، بعد حوالي 48 ساعة من البذر.
3. كل 2 أيام بعد البذر ، قم بقياس وتسجيل المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) باستخدام مقياس فولت / أوم ظهاري (EVOM) لتقييم نضج الطبقة الأحادية. بمجرد أن تصل الإدخالات إلى TEER لا يقل عن 1000 Ω سم² ، فإنها تعتبر جاهزة للفحص¹⁸.
   ملاحظة: تستغرق الإدخالات عادة من 7 إلى 10 أيام للوصول إلى هذا TEER بعد البذر. ستظهر خلايا T84 التقاء بنسبة 100٪ تحت المجهر الضوئي بمجرد الوصول إلى هذه المقاومة.
   1. قم بتخزين مسبار EVOM مع الأقطاب الكهربائية المغمورة في 0.15 M KCl عندما لا تكون قيد الاستخدام.
   2. قبل قياس TEER ، قم بتطهير مسبار القطب عن طريق غمره في 5 مل من الإيثانول بنسبة 70٪ في أنبوب مخروطي سعة 50 مل لمدة 10-15 دقيقة. قم بإزالة المسبار ، وتخلص من الإيثانول الزائد ، واتركه يجف في الهواء داخل BSC لمدة 10 دقائق. احتفظ بأنبوب الإيثانول.
   3. اختبر EVOM والمسبار عن طريق وضع المسبار الجاف المطهر في بئر معقم يحتوي على 1 مل من TCM + المضادات الحيوية مع ملحق معقم بداخله يحتوي على 500 ميكرولتر من TCM + المضادات الحيوية. تأكد من أن قراءة EVOM هي <200 Ω. سجل هذه القيمة الفارغة لاستخدامها في حسابات المقاومة اللاحقة الموضحة في الخطوة 1.3.6.
   4. إزالة التحقيق من أنبوب TCM + المضادات الحيوية. احتفظ بهذا الأنبوب لتخزين المسبار طوال التجربة.
   5. اخفض المسبار برفق في الإدخال الأول باستخدام القطب الطويل في بئر التجميع والقطب القصير داخل الإدخال. اسمح للقطب الطويل بلمس قاع بئر التجميع ، لكن لا تضغط لأسفل لأن هذا قد يعطل الطبقة الأحادية الظهارية.
   6. كرر هذه العملية لقياس وتسجيل المقاومة بالأوم (Ω) لكل إدخال. عند الانتهاء ، قم بتطهير المسبار في الإيثانول عن طريق غمره لمدة 10-15 دقيقة أخرى. بعد ذلك ، انقل المسبار الذي تم تطهيره مرة أخرى إلى محلول KCl للتخزين. اطرح المقاومة الفارغة التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.3.3 من كل قيمة تم الحصول عليها من كل إدراج يحتوي على خلايا T84. اضرب المقاومة الناتجة (Ω) لكل ملحق في مساحة الجزء السفلي من كل ملحق (سم 2) للحصول على قياس TEER النهائي (Ω سم²).
   7. بمجرد وصول TEER إلى 1000 Ω سم² على الأقل ، تكون الطبقة الأحادية الظهارية ناضجة وجاهزة لفحوصات العدوى.
4. مع نضوج TEER ، قم بتزويد الخلايا بوسط جديد كل 1-2 أيام.
   1. في لوحة جديدة مكونة من 24 بئرا ، أضف 1 مل من TCM + المضادات الحيوية إلى بئر واحد لكل ملحق مصنف يتم تحضيره.
   2. باستخدام ملقط معقم ، انقل الإدخالات بعناية إلى الآبار التي تم تجديدها حديثا.
   3. استبدل الوسائط في الإدخالات.
      1. قم بإزالة الوسائط القديمة من الحشوات عن طريق إمالة اللوحة واستخدام شفاط فراغ داخلي لإزالة الوسائط برفق باستخدام طرف ماصة على طول جانب الملحق. يسمح الشافطة بتنظيم الشفط منخفض المستوى لمنع تعطيل الخلايا. لا تسمح لطرف الماصة بلمس الجزء السفلي من الملحق ، لأن هذا سيعطل الطبقة الأحادية الظهارية النامية.
      2. أضف 500 ميكرولتر من TCM + المضادات الحيوية إلى الإدراجات. تصور الطبقة الأحادية باستخدام المجهر الضوئي للتحقق من بقائها سليمة.
   4. كل 1-2 يوم، قم بقياس TEER عبر كل إدراج كما هو موضح أعلاه في الخطوات 1.3.2-1.3.6.

2. تحضير خلايا T84 قبل يوم واحد من التجربة باستخدام الطب الصيني التقليدي بدون مضادات حيوية

1. قم بقياس وتسجيل TEER في اليوم السابق للتجربة.
2. استبدل الطب الصيني التقليدي بنفس الطريقة كما هو الحال أثناء إعداد الخلية السابقة وصيانتها. ومع ذلك ، يتم استخدام الطب الصيني التقليدي بدون مضادات حيوية بدلا من ذلك استعدادا للعدوى (1 مل في بئر اللوحة و 500 ميكرولتر في الملحق).

3. ثقافات الإشريكية القولونية (بدأت قبل يوم واحد من التجربة)

تنبيه: استخدم احتياطات السلامة البيولوجية من المستوى 2 (BSL-2) عند العمل مع سلالات الإشريكية القولونية السريرية المسببة للأمراض.

1. خذ أنبوبا مخروطيا مكتوبا عليه 15 مل مع 5 مل من مرق الليزوجيني المعقم (LB) ، واستخدم حلقة معقمة لتلقيح المرق بمستعمرة واحدة من سلالة بكتيرية واحدة (E. coli). كرر هذه العملية ، وقم بإنشاء أنبوب مزرعة ليلي واحد لكل سلالة ليتم اختبارها.
2. احتضان الثقافة الليلية ، مع تخفيف أغطية الأنابيب ، في شاكر حاضنة (250 دورة في الدقيقة ، 37 درجة مئوية).

4. تحضير لقاح الإشريكية القولونية والخلايا الظهارية والمواد (في صباح التجربة)

ملاحظة: استخدم الطب الصيني التقليدي بدون مضادات حيوية دافئة حتى 37 درجة مئوية من هذه النقطة فصاعدا.

1. أضف 250 ميكرولتر من كل مزرعة رطل بين عشية وضحاها إلى 25 مل من الطب الصيني التقليدي بدون مضادات حيوية في أنبوب مخروطي سعة 50 مل (واحد لكل سلالة فردية). حافظ على أغطية الأنابيب مرفوخة. ضع أنابيب الاستزراع الجديدة هذه في شاكر في نفس الإعدادات (250 دورة في الدقيقة ، 37 درجة مئوية) لمدة 2 ساعة بالضبط. قم بتنفيذ الخطوات الفرعية المتبقية أثناء الانتظار.
2. قم بقياس TEER عبر كل إدراج، كما هو موضح في الخطوات 1.3.2-1.3.6. سجل هذه على أنها TEERs في الوقت (t) = 0 h.
3. انقل الإدخالات إلى الآبار في لوحة جديدة ، وقم بتغيير الوسائط باستخدام التقنية الموضحة في الخطوة 1.4.3. ومع ذلك ، هذه المرة ، املأ آبار التجميع الجديدة ب 500 ميكرولتر من الطب الصيني التقليدي بدون مضادات حيوية ، واملأ الإدخالات ب 400 ميكرولتر من الطب الصيني التقليدي بدون مضادات حيوية. الحفاظ على إدراج داخل حاضنة زراعة الأنسجة حتى وقت الإصابة.
4. ضع عددا كافيا من ألواح أجار LB المربعة للتدفئة إلى درجة حرارة الغرفة (RT) للطلاء لاحقا والقياس الكمي للبكتيريا.

5. تلقيح الخلايا (بداية التجربة)

1. بعد 2 ساعة بالضبط ، قم بإزالة المزارع البكتيرية الصباحية من شاكر ، وطرد مركزي لمدة 10 دقائق (1900 × جم ، 4 درجات مئوية).
   ملاحظة: لجميع الخطوات التالية ، احتفظ بجميع المعلقات البكتيرية على الجليد لتقليل النمو.
2. أعد تعليق حبيبات البكتيريا في الطب الصيني التقليدي بدون مضادات حيوية. استخدم مقياس الطيف الضوئي لضبط الكثافة البصرية (OD) إلى 0.7-0.9 ، وقم بتخفيفه باستخدام TCM بدون مضادات حيوية إلى تركيز 1 × 10⁶ وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) / مل (حوالي 1: 100 تخفيف). استخدم هذا المعلق البكتيري لإصابة كل ملحق ب 1 × 10⁵ CFU لكل حجم 100 ميكرولتر.
3. قم بتسمية لوحة transwell ، وقم بإصابة كل ملحق ب 100 ميكرولتر من اللقاح المعدل OD (إجمالي 1 × 10⁵ CFU لكل إدخال). وقد بدأ الفحص الآن. لاحظ الوقت ، وقم بتسجيله ك t = 0 h.
4. قم بلوحة التعليق البكتيري للقاحي لتحديد كمية CFU / mL باستخدام طريقة تخفيف الجنزير ، وطلاء 10 ميكرولتر على ألواح أجار LB مربعة¹⁹.

6. تحديد كمية نقل الخلايا

1. كل 30 دقيقة بعد التلقيح ، املأ آبارا جديدة ب 500 ميكرولتر من الطب الصيني التقليدي بدون مضادات حيوية. نقل الحشوات إلى هذه الآبار الجديدة باستخدام مجموعة مختلفة من الملقط المعقم لكل سلالة بكتيرية مختلفة.
2. اجمع الوسائط من بئر التجميع المستخدم لكل ملحق في أنابيب منفصلة ملصقة. ضع هذه الأنابيب على الثلج. أعد لوحات transwell إلى الحاضنة بين النقاط الزمنية.
3. لكل إدراج ، اجمع الوسائط المجمعة من t = 0.5 h و t = 1 h و t = 1.5 h و t = 2 h و vortex لفترة وجيزة. قم بلوحة الوسائط التي تم جمعها على ألواح أجار LB باستخدام طريقة تخفيف المسار لتحديد كمية البكتيريا المنقولة في أول 2 ساعة من التجربة.
   ملاحظة: يضمن استرجاع البكتيريا كل 30 دقيقة وإبقائها على الجليد تقليل نمو البكتيريا في آبار التجميع إلى الحد الأدنى وإجراء القياسات على البكتيريا المنقولة في الغالب.
4. ضع ألواح أجار LB لتخفيف الجنزير المسمى في الحاضنة البكتيرية عند 37 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون_{الإضافي 2} ، وأعد لوحة T84 transwell إلى حاضنة زراعة الأنسجة.
5. عند t = 4 h ، كرر الخطوة 6.3 عن طريق الجمع بين الوسائط المجمعة من t = 2.5 h و t = 3 h و t = 3.5 h و t = 4 h.
6. عند t = 6 h ، كرر الخطوة 6.3 عن طريق الجمع بين الوسائط المجمعة من t = 4.5 h و t = 5 h و t = 5.5 h و t = 6 h. بالإضافة إلى ذلك ، عند t = 6 h ، قم بلوحة الوسائط من آبار التحكم.

7. نهاية التجربة

1. قياس وتسجيل TEER في نهاية التجربة ، ر = 6 ساعات. استخدم الإجراء الموضح في الخطوات 1.3.2-1.3.6.
2. قم بتطهير المسبار عن طريق غمره في 70٪ من الإيثانول لمدة 10-15 دقيقة. تخلص من الحشوات ، أو احفظها / قم بمعالجتها لتطبيقات إضافية ، إذا رغبت في ذلك. اسمح لألواح أجار LB بالحضانة طوال الليل ، وتطهير و / أو التخلص بأمان من جميع المواد المستخدمة الأخرى.
3. بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، عد المستعمرات البكتيرية يدويا على لوحات LB لتخفيف المسار لتحديد كمية اللقاح وكمية E. coli transcytosis. تأكد من أن لوحات التحكم لا تظهر أي نمو بكتيري.

الشكل 1: T84 TEER بمرور الوقت. مع نضوج طبقة الخلية T84 على الإدخال ، تزداد المقاومة الكهربائية للطبقة الأحادية. عند TEER لا يقل عن 1000 Ω سم² ، يتم تطوير طبقة الخلية بشكل كاف لتقليل النقل البكتيري شبه الخلوي والسماح بقياس العبور البكتيري عبر الخلايا في المقام الأول. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

أثناء تكاثر خلايا T84 العقيمة الموصوفة في القسم 1 ، ترتفع TEERs عبر الطبقات الأحادية T84 باستمرار بمرور الوقت ، متجاوزة 1000 Ω سم² تقريبا بعد 7 أيام من البذر (انظر الشكل 1). على الرغم من أن استقطاب الخلايا الظهارية ونضوج TEER أكثر قوة مع خلايا T84 مقارنة بالخلايا المعوية الأخرى ، مثل Caco-2 ، فقد لا تزال هناك حاجة إلى بعض استكشاف الأخطاء وإصلاحها⁶. يجب ألا ينخفض TEER للإدراج بشكل كبير بين القياسات. مثل هذا الانخفاض في TEER يمكن أن يشير إلى اضطراب ميكانيكي في الطبقة الأحادية الظهارية. يجب على المرء التأكد من أنه أثناء التغيير المتوسط ، لا يلمس طرف الشافطة أبدا الجزء السفلي من إدراج ثقافة الخلية. في حالة الاشتباه في هذا النوع من الضرر ، يمكن تصوره بواسطة المجهر الضوئي على أنه غياب للخلايا الظهارية بالقرب من موقع الشفط. بالإضافة إلى الأضرار الناجمة عن المناولة ، يمكن أن يشير انخفاض TEER إلى التلوث.

الشكل 2: نقل الخلايا لعزلات الإشريكية القولونية الوليدية بمرور الوقت. بعد إصابة إدخالات T84 ، يتم تحديد العزلات السريرية الوليدية E. coli التي تصل بنجاح إلى بئر التجميع باستخدام طريقة تخفيف المسار. يمكن مقارنة سلالات الإشريكية القولونية المختلفة من حيث قدرتها على نقل الخلايا في ظهارة الأمعاء. تم تضمين E. coli DH5 alpha غير الممرض كمقارنة. تظهر المخططات متوسط CFUs والأخطاء القياسية في كل نقطة زمنية. تم إجراء مقارنات لمتوسط قيم نقل الخلايا مع اختبارات t أحادية الطرف ، والتي أظهرت اختلافات ذات دلالة إحصائية بين عزلات E. coli الوليدية #1 مقابل #2 عند 2 ساعة (* p < 0.05) ، 4 ساعات (** p < 0.04) ، و 6 ساعات (***p < 0.04) بعد الإصابة. في المقابل ، خضعت سلالة الإشريكية القولونية غير المسببة للأمراض DH5 alpha للحد الأدنى من انتقال الخلايا ، كما هو موضح في المخطط الثالث. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يمكن تمثيل انتقال الخلايا الكمي كما هو موضح في الشكل 2. في هذا المثال ، تم إجراء التجارب باستخدام ثلاث إدخالات ، كل منها مصاب بعزلتين مختلفتين من الإشريكية القولونية الغازية لحديثي الولادة. كما تم اختبار سلالة غير ممرضة ، DH5 alpha ، للمقارنة. كما تم تضمين اثنين من إدخالات التحكم المعقمة (لم يتم عرض أي مؤامرة لأنه لم يتم عزل أي بكتيريا). البيانات من هذا الإجراء مفيدة لوصف قدرة سلالة واحدة من الإشريكية القولونية على نقل ظهارة الأمعاء. قد تسمح البيانات أيضا بمقارنة قدرات نقل الخلايا للسلالات المختلفة (انظر قسم المناقشة لمزيد من التطبيقات).

الشكل 3: TEER مباشرة قبل الإصابة و 6 ساعات بعد الإصابة. عادة ما يزداد TEER للإدخالات بعد الإصابة بالسلالات المنتجة لتجرثم الدم E. coli الوليدي². تظهر الإدخالات المصابة زيادة أكبر في TEER من إدخالات التحكم غير المصابة. كان TEER أكبر بشكل ملحوظ في T84 أحادي الطبقات بعد 6 ساعات من الإصابة بسلالة E. coli #1 الوليدية (* p < 0.01) وسلالة E. coli #2 (** p < 0.03) ، كما تم حسابها بواسطة اختبارات t. كما زاد TEER في أحاديات الطبقة الضابطة T84 غير المصابة ، لكن الفرق بين قيم ما قبل العدوى وما بعد العدوى لم يكن ذا دلالة إحصائية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يوضح الشكل 3 نتائج TEER النموذجية قبل وبعد الإصابة بعزلتين سريريتين من الإشريكية القولونية الوليدية بقدرات مختلفة على الخلايا الظهارية المعوية عبر الخلايا. يختلف معدل وكمية انتقال الخلايا بين السلالات، كما هو موضح في الشكل 2، ولكن TEER يزداد بشكل ملحوظ بعد الإصابة بكلتا السلالتين الممرضتين.

قد يتم تغيير النتائج في وجود تلوث في هذه التجربة. لم تتسبب سلالات الإشريكية القولونية الوليدية المستخدمة في أضرار كافية للطبقة الأحادية الظهارية لإنتاج انخفاض في TEER ، ومع ذلك كانت البكتيريا قادرة على نقل الخلايا. من المعقول أن الكائن الملوث ، إن وجد ، يمكن أن يتسبب في تلف الخلايا المعوية وانخفاض لاحق في TEER. تعمل إدخالات التحكم المعقمة على المساعدة في تحديد مثل هذا التلوث المحتمل. يحتوي وسط زراعة الأنسجة المستخدم في هذا الإجراء على مؤشر الأس الهيدروجيني للفينول الأحمر. بشكل عام ، يظهر الوسط باللون الوردي الصافي عندما يكون معقما أو مصابا بلقاح صغير. مع نمو كبير أو تلوث ، قد يتحول الوسط إلى عكر أو أصفر أو كريه الرائحة. قبل الإصابة ، تظهر الوسائط في جميع إدخالات T84 عادة باللون الوردي الواضح.

بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، يكون المكان الأخير للتحقق من التلوث على ألواح أجار LB. يجب ألا تظهر لوحات التحكم أي نمو. يجب أن تحتوي الألواح المصنوعة من آبار تجميع الحشوات المصابة بالإشريكية القولونية على مستعمرات الإشريكية القولونية الصفراء المتجانسة والمستديرة. لتقليل مخاطر التلوث ، يجب تنفيذ جميع الأعمال في خزانات السلامة الأحيائية. يجب استخدام خزانات وحاضنات منفصلة لزراعة الأنسجة المعقمة ، وزراعة الأنسجة المصابة بالإشريكية القولونية ، والتلاعب البكتيري. يجب الحفاظ على مساحات العمل نظيفة ، ويجب استخدام تقنية معقمة طوال الوقت.

الشكل 4: التمثيل التخطيطي لنظام البئر وتراكيب الخلايا المعوية ذات الصلة. (أ) منظر مقطع لإدراج البئر (أزرق) ؛ تشير الخطوط الرأسية الموجودة أسفل الملحق إلى المسام القابلة للاختراق. تشكل الخلايا الظهارية المعوية المستقطبة طبقة أحادية في الجزء السفلي من الإدخال. يظهر وسط زراعة الأنسجة باللون الوردي ، مع مسبار EVOM ذو شقين مغمور فيه. يتم توصيل أسلاك المسبار الموجودة على الجانب الآخر بجهاز EVOM (غير معروض). ب: شكل مبسط لمكونات الوصلات الضيقة للخلايا الطلائية المعوية. تمثل الأسهم الرأسية الطرق المحتملة للمرور البكتيري من القمي إلى الجانب القاعدي من الطبقة الظهارية المعوية المستقطبة. الاختصارات: ZO = zona يسد البروتينات. JAM = جزيئات التصاق الموصل. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل التكميلي 1: النمو القمي لعزلات الإشريكية القولونية الوليدية بمرور الوقت. يمكن إجراء قياسات الإشريكية القولونية في المواد الطافية التي تغطي خلايا T84 داخل إدخالات transwell كنقطة نهاية اختيارية إضافية. يوضح الشكل أن النمو القمي لكل من سلالات الإشريكية القولونية المسببة للأمراض التي تم اختبارها من أجل نقل الخلايا لم يكن مختلفا بشكل كبير بمرور الوقت. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحرافات المعيارية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

هذه الطريقة مشتقة من التقنيات المستخدمة في أمراض الجهاز الهضمي والأمراض المعدية²⁰. تم استخدام نماذج في المختبر للحاجز الظهاري المعوي لتوضيح الآليات التي تتفاعل بها المحتويات اللمعية مع هذا المكون ذي الصلة من المناعة الفطرية ^6,8. كما تم تمييز التفاعلات بين المضيف والممرض للإشريكية القولونية الغازية لحديثي الولادة بشكل منفصل من خلال التحليل الجيني ، ودراسات مقاومة مضادات الميكروبات ، والتقنيات المناعية¹،⁵،^16،21. ومع ذلك ، لا يعرف سوى القليل عن الآليات الجزيئية التي تدعم قدرة عزلات E. coli حديثي الولادة على دخول مجرى الدم عبر القناة الهضمية³.

تسمح تقنية نقل الخلايا الموضحة هنا بتوصيف أكثر تفصيلا لسلالات الإشريكية القولونية الغازية الوليدية التي تنتج تسمم الدم بعد اكتسابها المعوي. تجرثم الدم الوليدي هو عملية متعددة الخطوات ، و transcytosis هي واحدة من الخطوات ذات الصلة. بالمقارنة مع نماذج الغزو ، تقدم طريقة نقل الخلايا هذه معلومات إضافية حول الآليات المشاركة في التسبب في تجرثم الدم. في بعض الحالات ، تغزو الإشريكية القولونية المسببة للأمراض الأمعاء الدقيقة دون الوصول إلى مجرى الدم ، مما يحد من العدوى إلى التسبب في مرض موضعي²². وبالتالي ، فإن قدرة البكتيريا على غزو ظهارة الأمعاء ببساطة قد لا تعكس قدرتها على المرور بالكامل عبر الحاجز الظهاري. يمكن استخدام هذا النموذج لدراسة عملية المرور البكتيري عبر ظهارة الأمعاء من خلال الطرق عبر الخلوية أو شبه الخلوية ، خاصة إذا تم دمج تقنيات إضافية مثل المجهر الإلكتروني²⁰. بالمقارنة مع النماذج الحيوانية في الجسم الحي ، فإن هذا النموذج في المختبر أكثر كفاءة ويسمح بتحكم أفضل في العديد من المتغيرات المحتملة. علاوة على ذلك ، فإنه يساهم في رعاية الحيوان من خلال توفير بديل للتجارب في الجسم الحي .

على الرغم من هذه المزايا ، لا تزال هذه التجربة لها حدودها. أولا ، لا يفسر هذا الفحص الاختلافات في نمو البكتيريا على الجانب القمي للظهارة أثناء الحضانة. قد تؤثر اختلافات النمو هذه على كمية نقل الخلايا لكل سلالة. يمكن للمستخدمين اختيار قياس النمو القمي للحصول على توصيف أكثر شمولا للنتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا النموذج. يوضح الشكل التكميلي 1 مثالا على النمو القمي لعزلتي الإشريكية القولونية المستخدمتين في تجارب نقل الخلايا بالطرق المعروضة في هذه المخطوطة. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن هذا النموذج يعيد بشكل معقول إنشاء الطبقة الأحادية الظهارية المعوية ، إلا أنه لا يمثل تماما جميع مكونات الحاجز المعوي الذي يحمي مجرى الدم من مسببات الأمراض المبتلعة. ومع ذلك ، يمكن دراسة بعض خصائص ظهارة الأمعاء مع هذا النموذج. على سبيل المثال ، تفرز خلايا T84 كلوريد وتنتج الميوسين²³. يرتبط غزو الإشريكية القولونية المنتجة للإسهال بزيادة إفراز الكلوريد في خلايا T84 وانخفاض كبير في TEER بعد 6 ساعات بعد الإصابة²⁴. من الممكن أن يؤدي غزو سلالات الإشريكية القولونية المنتجة لتجرثم الدم أيضا إلى زيادة إفراز الكلوريد في هذا النموذج وأن انخفاضا في TEER قد يحدث بعد 6 ساعات من الإصابة. يمكن تكييف هذا النموذج للدراسات حول العلاقة بين نقل الأيونات والغزو البكتيري إذا رغب باحثون آخرون في ذلك. Mucin هو حاجز مادي يحمي الظهارة من مسببات الأمراض. العدوى بسلالات الإشريكية القولونية الأخرى تقلل من تعبير الميوسين بواسطة خلايا T84²⁵. يمكن أيضا دراسة دور الميوسين في التسبب في انتقال الخلايا الإشريكية القولونية الوليدية عبر ظهارة الأمعاء باستخدام هذا النموذج. يمكن أن يكون الاستخدام الآخر لهذا النموذج هو دراسة التأثيرات السامة للخلايا للسيكلومودولين البكتيرية ودورها المحتمل في عملية نقل الخلايا لسلالات الإشريكية القولونية الوليدية. على سبيل المثال ، يستهدف عامل النخر السام للخلايا -1 (CNF-1) ، الذي تنتجه بعض سلالات الإشريكية القولونية المسببة للأمراض ، Rho GTPases ، والتي تعتبر حاسمة في تنظيم وظيفة التوصيل الضيق وموت الخلايا المبرمج للخلايا حقيقية النواة المصابة²⁶. يمكن تكييف نموذج transwell هذا لفهم الآليات التي تؤثر بها هذه السموم الخلوية على ظهارة الأمعاء²⁷ بشكل أفضل. عند استخدام هذا النموذج لدراسة تفاعل سلالات الإشريكية القولونية الوليدية مع ظهارة الأمعاء ، من المهم مراعاة أن خلايا T84 المستخدمة لنمذجة ظهارة الأمعاء يتم الحصول عليها من ورم خبيث رئوي لسرطان القولون الغدي لدى شخص بالغ⁶. في حين أن الدراسات التي أجريت على خلايا T84 قد أعادت إنتاج تأثيرات محددة على نفاذية الأمعاء التي ترجمت إلى تأثيرات مماثلة في الخلايا المعوية الحيوانية البشرية حديثي الولادة وحديثي الولادة²⁸،^{29 ،} قد تتصرف ظهارة الأمعاء الجنينية والوليدية بشكل مختلف في وجود الإشريكية القولونية الغازية.

قد تكون هناك حاجة إلى بعض استكشاف الأخطاء وإصلاحها لتحسين هذا النموذج وجودة البيانات التي يوفرها. تتم مناقشة استخدام إدخالات التحكم المعقمة بالتفصيل في قسم النتائج التمثيلية. يمكن أيضا تضمين سلالات الإشريكية القولونية الأخرى غير الغازية كضوابط سلبية / الحد الأدنى من انتقال الكتل. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام خط خلوي مختلف ، مثل Caco-2 ، لتقييم قدرة سلالات E. coli الوليدية على ظهارة الأمعاء المستقطبة عبر الخلايا. تم العثور على غزو ونقل الخلايا من E. coli لتكون أكبر لخلايا T84 بالمقارنة مع خلايا Caco-2³⁰. لذلك ، يجب مراعاة هذه الاختلافات عند استخدام هذا النموذج لتقييم النقل الخلوي البكتيري مع هذه الخلايا الظهارية وغيرها من الخلايا التي تستقطب وتشكل تقاطعات ضيقة. يتطلب أخذ قياسات TEER لكل إدخال نقل فردي عدة ثوان ، وعندما يتم اختبار سلالات متعددة ، يجب أخذ وقت المشغل الإضافي في الاعتبار. يستمر تطوير طرق أكثر كفاءة لمراقبة TEER في أنظمة transwell. تسمح هذه الأجهزة الأحدث بمراقبة TEER في وقت واحد في إدخالات متعددة وفي الوقت الفعلي³¹. سيحتاج الباحثون الذين يفكرون في هذه الخيارات إلى تحديد ما إذا كان الوقت الذي تم توفيره يمكن أن يعوض السعر المتزايد لهذه الأجهزة الأحدث مقارنة بقياسات القطب الواحد الموصوفة هنا.

على الرغم من بعض التحديات المحتملة ، يسمح هذا الفحص للباحثين بدراسة آليات محددة تشارك في التسبب في تجرثم الدم E. coli بما يتجاوز مجرد كمية النقل الخلوي. عند دمجها مع تقنيات علم الأحياء الدقيقة الجزيئية ، يمكن استخدام هذه العملية لتحديد تأثيرات الجينات الفردية على قدرة الإشريكية القولونية على نقل الخلايا في ظهارة الأمعاء ، كما تمت تجربته في النماذج الحيوانية³². يمكن أيضا تعديل هذا النموذج عن طريق الزراعة المشتركة للخلايا المناعية أو إضافة السيتوكينات وعوامل النمو والتدخلات الصيدلانية لمحاكاة الاستجابات المناعية والديناميكية الدوائية الأكثر تعقيدا³³.

اي.

تم دعم هذا العمل من خلال منحة سارة موريسون الطلابية الصادرة عن كلية الطب بجامعة ميسوري-كانساس سيتي إلى الذكاء الاصطناعي.