Method Article
يصف البروتوكول الحالي إنشاء ثقافات ثلاثية الأبعاد "على القمة " لخط الخلايا الظهارية غير المتحولة للثدي ، MCF10A ، الذي تم تعديله لدراسة التحول الناجم عن عامل تنشيط الصفائح الدموية (PAF). تم استخدام التألق المناعي لتقييم التحول ويتم مناقشته بالتفصيل.
تم تطوير العديد من النماذج لدراسة السرطان ، مثل نماذج القوارض وخطوط الخلايا الثابتة. تم توفير رؤى قيمة حول التسرطن من خلال الدراسات التي تستخدم هذه النماذج. وقد وفرت خطوط الخلايا فهما لإزالة القيود التنظيمية من الإشارات الجزيئية المرتبطة بتكوين أورام الثدي، في حين تستخدم نماذج القوارض على نطاق واسع لدراسة الخصائص الخلوية والجزيئية لسرطان الثدي في الجسم الحي. إنشاء ثقافات 3D من الخلايا الظهارية والسرطانية الثدي يساعد في سد الفجوة بين في الجسم الحي والنماذج في المختبر من خلال محاكاة الظروف في الجسم الحي في المختبر. يمكن استخدام هذا النموذج لفهم تحرير أحداث الإشارات الجزيئية المعقدة والخصائص الخلوية أثناء تسرطن الثدي. هنا ، يتم تعديل نظام ثقافة 3D لدراسة التحول الناجم عن وسيط الدهون الفوسفاتية (عامل تنشيط الصفائح الدموية ، PAF). تلعب أجهزة المناعة والجزيئات المفرزة الأخرى دورا رئيسيا في بدء الورم وتقدمه في الثدي. في هذه الدراسة ، تتعرض ثقافات 3D acinar للخلايا الظهارية للثدي لخصائص التحول PAF المعروضة مثل فقدان القطبية والخصائص الخلوية المتغيرة. سيساعد نظام زراعة 3D هذا في إلقاء الضوء على الاضطرابات الجينية و / أو اللاجينية التي تسببها مختلف كيانات الجزيئات الصغيرة في البيئة الدقيقة للورم. بالإضافة إلى ذلك ، سيوفر هذا النظام أيضا منصة لتحديد الجينات الجديدة والمعروفة التي قد تشارك في عملية التحول.
يتوفر عدد لا يحصى من النماذج لدراسة تطور السرطان ، كل منها فريد من نوعه ويمثل نوعا فرعيا من هذا المرض المعقد. يوفر كل نموذج رؤى فريدة وقيمة في بيولوجيا السرطان وقد حسن الوسائل لمحاكاة حالة المرض الفعلية. قدمت خطوط الخلايا الراسخة التي نمت كطبقة أحادية رؤى قيمة في العمليات الحيوية في المختبر ، مثل الانتشار والغزو والهجرة وموت الخلايا المبرمج1. على الرغم من أن زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد (2D) كانت الأداة التقليدية للتحقيق في استجابة خلايا الثدييات للعديد من الاضطرابات البيئية ، إلا أن استقراء هذه النتائج للتنبؤ بالاستجابات على مستوى الأنسجة لا يبدو مقنعا بما فيه الكفاية. القيد الرئيسي للثقافات ثنائية الأبعاد هو أن البيئة الدقيقة التي تم إنشاؤها تختلف إلى حد كبير عن تلك الموجودة في أنسجة الثدي نفسها2. تفتقر ثقافة 2D إلى تفاعل الخلايا مع المصفوفة خارج الخلية ، وهو أمر حيوي لنمو أي أنسجة. أيضا ، فإن قوى الشد التي تعاني منها الخلية في مزارع الطبقة الأحادية تعيق قطبية هذه الخلايا ، وبالتالي تغير إشارات الخلية وسلوكها3،4،5. فتحت أنظمة الاستزراع ثلاثية الأبعاد (3D) طريقا جديدا في مجال أبحاث السرطان مع قدرتها على محاكاة الظروف في الجسم الحي في المختبر. يمكن إعادة إنشاء العديد من الإشارات البيئية الدقيقة الحاسمة التي تضيع في زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد باستخدام ثقافات ثلاثية الأبعاد من المصفوفة خارج الخلية الغنية باللامينين (lrECM)6.
حددت دراسات مختلفة أهمية البيئة الدقيقة للورم في التسرطن 7,8. العوامل المرتبطة بالالتهاب هي جزء رئيسي من البيئة الدقيقة. عامل تنشيط الصفائح الدموية (PAF) هو وسيط فوسفوليبيد تفرزه خلايا مناعية مختلفة تتوسط استجابات مناعية متعددة 9,10. يتم إفراز مستويات عالية من PAF بواسطة خطوط خلايا سرطان الثدي المختلفة وترتبط بالانتشار المعزز11. أظهرت الدراسات التي أجريت في مختبرنا أن الوجود المطول ل PAF في الثقافات الأسينارية يؤدي إلى تحول الخلايا الظهارية للثدي12. يقوم PAF بتنشيط مستقبل PAF (PAFR) ، وتنشيط محور الإشارة PI3K / Akt13. وتفيد التقارير أيضا أن PAFR مرتبط ب EMT والغزو والانبثاث14.
يوضح هذا البروتوكول نظاما نموذجيا لدراسة التحول الناجم عن PAF ، باستخدام ثقافات ثلاثية الأبعاد للخلايا الظهارية للثدي ، كما وصفها سابقا Chakravarty et al.12. تميل الخلايا الظهارية للثدي التي تنمو على المصفوفة خارج الخلية (ثقافات 3D) إلى تشكيل كرويات مستقطبة توقف النمو. وتسمى هذه الأسيني وتشبه إلى حد كبير الأسيني من أنسجة الثدي ، أصغر وحدة وظيفية في الغدة الثديية ، في الجسم الحي15. تتكون هذه الكرويات (الشكل 1A ، B) من طبقة واحدة من الخلايا الظهارية المستقطبة المعبأة بشكل وثيق حول تجويف مجوف ومتصلة بالغشاء السفلي (الشكل 1C). تم وصف عملية التشكل هذه بشكل جيد في الأدب16. عند زرعها على lrECM ، تخضع الخلايا للانقسام والتمايز لتشكيل مجموعة من الخلايا ، والتي تستقطب بعد ذلك من اليوم 4 فصاعدا. بحلول اليوم 8 ، يتكون الأسيني من مجموعة من الخلايا المستقطبة التي تكون على اتصال مباشر مع المصفوفة خارج الخلية ومجموعة من الخلايا غير المستقطبة المغلقة داخل الخلايا المستقطبة الخارجية ، مع عدم وجود اتصال بالمصفوفة . من المعروف أن هذه الخلايا غير المستقطبة تخضع لموت الخلايا المبرمج بحلول اليوم 12 من الثقافة ، مما يشكل تجويفا مجوفا. بحلول اليوم 16 ، يتم تشكيل الهياكل المتوقفة عن النمو16.
الشكل 1: نوى الخلايا في الأسيني الملطخة ببقعة نووية . (A) بناء 3D من الأسيني. (ب) صورة تباين الطور ل MCF10A acini المزروعة في Matrigel لمدة 20 يوما. (ج) يظهر القسم الأوسط وجود تجويف مجوف. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
على عكس ثقافات 2D ، تساعد ثقافات acinar في تمييز الخلايا الطبيعية والمحولة من خلال التغيرات المورفولوجية الواضحة. تشكل الخلايا الظهارية غير المتحولة في الثدي الأسيني مع تجويف مجوف ، يحاكي أسيني الثدي البشري الطبيعي. تظهر هذه الكرويات ، عند التحول ، مورفولوجيا معطلة تتميز بفقدان كبير للقطبية (واحدة من السمات المميزة للسرطان) ، أو عدم وجود تجويف ، أو اضطراب في التجويف المجوف (بسبب التهرب من موت الخلايا المبرمج) الذي قد يحدث بسبب تحرير الجينات المختلفة17،18،19،20 . يمكن دراسة هذه التحولات باستخدام تقنيات شائعة الاستخدام مثل التألق المناعي. وبالتالي ، يمكن أن يعمل نموذج زراعة الخلايا 3D كطريقة بسيطة للتحقيق في عملية تكوين الثدي وسرطان الثدي. إن إنشاء نظام ثقافة 3D لفهم تأثير وسيط الدهون الفوسفاتية ، PAF ، سيساعد في فحص الأدوية قبل السريرية عالي الإنتاجية.
قام هذا العمل بتكييف بروتوكول الثقافة ثلاثية الأبعاد "على القمة"16,21 لدراسة التحول الناجم عن PAF 22. تمت دراسة التغيرات المظهرية الناجمة عن تعرض الأسيني لوسيط الدهون الفوسفاتية باستخدام التألق المناعي. تم استخدام العديد من علامات القطبية والظهارية إلى الانتقال الوسيط (EMT) 12,16 في الدراسة. ويذكر الجدول 1 توطينها الطبيعي ونمطها الظاهري المتوقع عند التحول.
الاجسام المضاده | علامات | التوطين العادي | النمط الظاهري المحول |
α6-إنتيغرين | القاعدية | القاعدية مع وصمة عار جانبية ضعيفة | وصمة عار جانبية / قمية قوية |
β كاتينين | تقاطع الخلية والخلية | القاعدية | توطين غير طبيعي / نووي أو سيتوبلازمي |
فيمنتين | EMT | غياب / ضعف الحضور | التنظيم المرتفع |
الجدول 1: العلامات المستخدمة في الدراسة. علامات مختلفة تستخدم مع توطينها في وجود وغياب علاج PAF.
يمكن استخدام هذه الطريقة بشكل أفضل لدراسة / فحص الأدوية المعقولة والجينات المستهدفة لمختلف الأنواع الفرعية لسرطان الثدي. وهذا يمكن أن يوفر بيانات استجابة للأدوية أقرب إلى سيناريو في الجسم الحي ، مما يساعد في تطوير الأدوية بشكل أسرع وأكثر موثوقية. أيضا ، يمكن استخدام هذا النظام لدراسة الإشارات الجزيئية المرتبطة بالاستجابة للأدوية ومقاومة الأدوية.
1. بذر خلايا MCF10A في lrECM
2. علاج PAF
3. إعادة التغذية بوسائط جديدة
4. دراسة التألق المناعي للكشف عن التغيرات المظهرية الناجمة عن التعرض المطول ل PAF
خلايا MCF10A ، عند التعرض لعلاج PAF ، تشكل هياكل أسينار ذات أنماط ظاهرية متميزة للغاية. تم العثور على α6-integrin ليكون موضعيا بشكل خاطئ مع تلطيخ أكثر قمي. كما أظهر عدد قليل من الأسيني تلطيخا متقطعا (الشكل 2 أ). يشير كل من هذين النوعين الظاهريين إلى فقدان القطبية القاعدية ، كما يتضح من الأدبيات24,25. تشير التقارير السابقة إلى الدور المثير للجدل ل α6-integrin في ورم خبيث سرطاني. α6-integrin موجود كخافت مع إما β1- أو β4-integrin. تم العثور على الوحدة الفرعية α6β4 للعب دورا هاما في تشكيل الهيمديسموسوسومات في الخلايا الظهارية26. تم العثور على انخفاض تنظيم هذا الإنتغرين في البروستاتا وبعض حالات سرطان الثدي ، حيث تم العثور على فقدان α6β4-integrin في سرطان القنوات في الثدي (الصف الثالث). وينظر إلى النمط الظاهري المفقود في الخلايا التي تنتقل إلى الحمة والتجويف الجنبي27،28،29. GM130 هو بروتين موضعي من CIS-Golgi. يتم توطين أجسام Golgi بشكل قمي في ثقافات MCF10A acinar16,30. أدى علاج PAF إلى سوء توطين GM130 ، مما يشير إلى اضطراب القطبية القمية (الشكل 2B). Vimentin هو خيوط وسيطة تشارك في هجرة الخلايا. يتم تنظيمه عندما تخضع الخلايا الظهارية للانتقال الظهاري إلى الوسيط (EMT)31. أدت معالجة PAF لمزارع الأسينار MCF10A إلى ارتفاع مستويات الفيمنتين كما لوحظ من شدة التلطيخ (الشكل 2C) ، مما يشير إلى EMT.
الشكل 2: يعطل PAF القطبية ويحفز التغيرات الشبيهة ب EMT في أسيني الثدي MCF10A. نمت خلايا MCF10A كثقافات ثلاثية الأبعاد "على القمة" في lrECM. تم التعامل مع الثقافات مع PAF في اليوم 0 و 4 و 8 و 12 و 16. تم الحفاظ على الثقافات لمدة 20 يوما ثم تم تلطيخ المناعة ل α6-integrin (الأخضر) والبقع النووية (الأزرق) (A) ، (B) GM130 (الأخضر) ، وهي علامة على القطبية القمية ، و (C) Vimentin (الأحمر) ، علامة EMT. تم عرض المكدس المركزي لل acini المعني. البيانات التمثيلية هي ل 40-50 acini من ثلاث تجارب مستقلة بيولوجيا. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تستخدم النماذج القائمة على خط الخلايا على نطاق واسع لدراسة عملية التسرطن. تستمر مزارع الخلايا أحادية الطبقة في تقديم رؤى ثاقبة حول مسارات الإشارات الجزيئية المختلفة التي تتوسط التغيرات المميزة في الخلايا السرطانية32. تم الإبلاغ لأول مرة عن دراسات حول دور الجينات السرطانية المعروفة مثل Ras و Myc و p53 المتحورة باستخدام ثقافات أحادية الطبقة كنظام نموذجي 33,34,35,36. ومع ذلك ، يفتقر نموذج ثقافة 2D إلى الكثير من المعلمات الهيكلية والوظيفية المهمة الموجودة في الجسم الحي. غالبا ما تظهر دراسات فحص الأدوية في ثقافات 2D استجابة كبيرة (موت الخلايا أو تثبيط الهدف) ، حتى عند تركيزات أقل ، بينما تفشل في إظهار أي تأثير كبير عند الإعجاب في الفئران37. أحد الأسباب الرئيسية لذلك هو تباين توافر الأدوية وامتصاصها في ثقافة أحادية الطبقة 2D مقابل. ثقافة 3D38.
وقد برز مفهوم الثقافات 3D كأداة قوية لدراسة تطور السرطان في العقد الماضي. تتضمن الثقافات ثلاثية الأبعاد خلايا متنامية على مصفوفة خارج الخلية ، مما يؤدي إلى تكوين هياكل تشبه الوحدات الوظيفية الموجودة في الأنسجة في الجسم الحي16. الثقافات 3D تحاكي البيئة الدقيقة في الجسم الحي إلى حد كبير ، وبالتالي التغلب على قيود الثقافات 2D39. علاوة على ذلك ، نظرا لأن الخلايا المزروعة في 3D هي من أصل بشري والنظام أكثر قابلية لدراسة الأحداث المبكرة ، فهو أبسط وأكثر أناقة من نماذج القوارض.
باستخدام هذه المنصة ، يتم عرض نموذج لدراسة عملية التحول بعد التعرض لوسيط الدهون الفوسفاتية مثل PAF. حددت الدراسات من مختبرنا أن علاج PAF يمكن أن يحول خط الخلايا الظهارية للثدي غير الورمي ، MCF10A12. تم تحسين هذه الطريقة لتعريض الخلايا باستمرار ل PAF ، على غرار سيناريو في الجسم الحي ، حيث يوجد PAF في البيئة الدقيقة.
يجب تمرير خلايا MCF10A ، عندما تنمو في 2D ، كل 4 أيام. إذا لم يتم الحفاظ عليها وفقا للبروتوكول ، فإنها تتصرف بشكل مختلف تماما ، وهو أمر مرئي فقط عند زراعتها على ECM16. يجب أن يبقى رقم مرور الخلايا منخفضا قدر الإمكان. هذه الطريقة لها أيضا قيود بسبب الاختلاف في تركيز البروتين في دفعات مختلفة من lrECM. يمكن التغلب على ذلك عن طريق اختبار الدفعات المختلفة ببساطة عن طريق طلاء الخلايا على سرير lrECM ومراقبة توزيع حجم الأسيني. إذا لم يكن هناك تباين كبير في الحجم ، يمكن اعتبار دفعة lrECM مناسبة للتجارب.
يتم تقييم التحول بشكل عام عن طريق التألق المناعي ، والذي يظهر في الفيديو. أثناء أداء التألق المناعي ، فإن الخطوات التي تنطوي على الحضانة عند 4 درجات مئوية أمر بالغ الأهمية. سحب المحلول عندما تكون طبقة lrECM في حالة سائلة يجعل الطبقة غير متساوية ، مما يؤدي إلى فقدان الهياكل الأسينارية. تتمثل إحدى طرق معالجة مشكلة التفاوت في تخزين الشرائح عند 4 درجات مئوية على منصة متساوية بين عشية وضحاها أو تغيير التكبير الذي يتم فيه التصوير. لتجنب سحب هياكل acinar ، قم بإزالة الغرفة بعناية من التخزين 4 درجات مئوية وإزالة ثلاثة أرباع الحجم المضاف في البداية ، ثم أخرج الباقي أثناء عمليات الغسيل اللاحقة.
مشكلة رئيسية أخرى تواجهها هي الخلفية العالية بسبب lrECM. للتغلب على هذه المشكلة ، يمكن للمرء استخدام 2٪ من الأجسام المضادة الثانوية المانعة بدلا من 1٪. ومع ذلك ، فإن زيادة الحجب الثانوي لا تخدم الغرض من تلطيخ العلامات القمية و E-cadherin. في مثل هذه الحالات ، ينصح بإخضاع زجاج غطاء الغرفة بعد اليوم 20 إلى PBS-EDTA لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، ثم إصلاح الأسيني باتباع نفس البروتوكول كما هو موضح في الفيديو. PBS-EDTA يذوب جزئيا lrECM ، وبالتالي تقليل الخلفية. ومع ذلك ، إذا تم تجاوز وقت الحضانة ، يمكن أن يؤدي هذا العلاج إلى فقدان الهياكل أثناء سحب المحلول. وبالتالي ، يجب توخي أقصى درجات الحذر أثناء تنفيذ هذا الإجراء. وقد لوحظ أيضا أن تخزين الشرائح لفترات أطول يمكن أن يؤدي إلى زيادة في إشارة الخلفية. لذلك ، يجب إجراء التصوير في أقرب وقت ممكن. من المستحسن تصوير ما لا يقل عن 15 أسيني لكل تجربة لتحديد تغيير في النمط الظاهري.
تحتوي ثقافات 3D acinar على قيود معينة ، مثل صعوبة تتبع الخلايا المفردة أثناء تصوير الخلايا الحية. يجب إجراء بعض الدراسات ، مثل التأثيرات على دورة الخلية ، باستخدام تصوير الخلايا الحية للحفاظ على المعلومات المكانية والزمانية. ومع ذلك ، بسبب التغيرات المستمرة في الهيكل ، من الصعب تتبع هذه المعلمات في ثقافات 3D acinar باستخدام المجاهر البؤرية العادية. وهذا يستدعي استخدام تقنيات مجهرية متقدمة مثل الفحص المجهري فائق الدقة أو الفحص المجهري Airyscan. كما سيتطلب إزاحة الهياكل الأسينارية لبعض مقايسات التحول مثل التئام الجروح ، والنمو المستقل عن المرساة ، وفحوصات الأورام في الجسم الحي . ومن شأن هذا الإزاحة أن يؤدي إلى فقدان معلومات مكانية وزمنية هامة. غالبا ما يتم تخفيف تحلل البروتين الذي تم جمعه من الثقافات بسبب وجود IrECM ، مما يطرح مشكلات في تحميل كمية كافية من الليزات. ومع ذلك ، يمكن التغلب على هذا إلى حد كبير عن طريق إزاحة هياكل الأسيني وجمعها قبل التحلل.
هنا ، تم إثبات نظام نموذجي لدراسة وسيط الدهون الفوسفاتية / التحول الناجم عن العوامل المرتبطة بالمناعة. يمكن لهذا النموذج توضيح المسار (المسارات) الجينية و / أو اللاجينية التي قد يتم إلغاء تنظيمها ، مما يؤدي إلى تغييرات جذرية في المورفولوجيا. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لفحص العلاجات المحتملة. ستوفر دراسات فحص الأدوية هذه نجاحا أفضل من الفحوصات التي أجريت في ثقافات 2D38. ومن أبرز ما يميز هذه الطريقة هو التكيف وفقا لمتطلبات الدراسة. يمكن تعديل نظام العلاج وطرق التحليل حسب الحاجة. علاوة على ذلك ، يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على الإشارات الجزيئية المتأثرة بالعلاج40. ستساعد هذه التقنية أيضا على التنبؤ باحتمال حدوث مقاومة الأدوية. وعلاوة على ذلك، سيساعد أيضا في توضيح الآلية التي تنطوي عليها مقاومة الأدوية وتحديد أهداف معقولة للتغلب عليها. وقد أثبتت الدراسات إمكانيات المشاركة في زراعة أنواع متعددة من الخلايا في 3D ، والتي يمكن تعديلها بشكل أكبر لاستيعاب نظام العلاج41. ستوفر هذه الفرص رؤى أكبر حول الخصائص والتغيرات الجزيئية التي تحدث في الجسم الحي أثناء بدء وتطور سرطان الثدي.
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب محتمل في المصالح.
ونشكر مرفق الفحص المجهري التابع للمعهد الدولي للدراسات الاستراتيجية في بيون على إمكانية الوصول إلى المعدات والبنية التحتية ودعم التجارب. تم دعم هذه الدراسة من خلال منحة من وزارة التكنولوجيا الحيوية (DBT) ، حكومة الهند (BT / PR8699 / MED/30/1018/2013) ، مجلس أبحاث العلوم والهندسة (SERB) ، حكومة الهند (EMR / 2016 / 001974) وجزئيا من قبل IISER، تمويل Pune Core. تم تمويل A. K. من قبل زمالة CSIR-SRF ، وتم تمويل لوس أنجلوس من خلال زمالة DST-INSPIRE ، وتم تمويل V.C بواسطة DBT (BT / PR8699 / MED/30/1018/2013).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
16% paraformaldehyde | Alfa Aesar | AA433689M | |
Anti Mouse Alexa Flour 488 | Invitrogen | A11029 | |
Anti Rabbit Alexa Flour 488 | Invitrogen | A-11008 | |
BSA | Sigma | A7030 | |
Chamber Coverglass | Nunc | 155409 | |
Cholera Toxin | Sigma | C8052-1MG | 1 mg/mL in dH2O |
Confocal Microscope | Leica | Leica SP8 | |
DMEM | Gibco | 11965126 | |
EDTA | Sigma | E6758 | |
EGF | Sigma | E9644-0.2MG | 100 mg/mL in dH2O |
F(ab’)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
GM130 antibody | Abcam | ab52649 | |
Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
Hoechst | Invitrogen | 33258 | |
Horse Serum | Gibco | 16050122 | |
Hydrocortisone | Sigma | H0888 | 1 mg/mL in ethanol |
Image Processing Software | ImageJ | ||
Insulin | Sigma | I1882 | 10 mg/mL stock dH2O |
lrECM (Matrigel) | Corning | 356231 | |
Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade) | Invitrogen | S36937 | |
Nuclear Stain (Hoechst) | Invitrogen | 33258 | |
PAF | Cayman Chemicals | 91575-58-5 | Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol |
Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
Tris Base | Sigma | B9754 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Tween 20 | Sigma | P9416 | |
Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
α6-integrin antibody | Millipore | MAB1378 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved