طريقه لأعاده البناء 3D وتحليل الواقع الافتراضي للخلايا العصبية والخلايا الددالي

تم تصميم خط الأنابيب الموصوف لتقسيم مجموعات البيانات المجهرية الكترون أكبر من غيغابايت ، لاستخراج مورفولوجيس الخلية الكاملة. وبمجرد أعاده بناء الخلايا في 3D ، يمكن استخدام البرمجيات المخصصة المصممة حول الاحتياجات الفردية لاجراء تحليل نوعي وكمي مباشره في 3D ، وأيضا باستخدام الواقع الافتراضي للتغلب علي انسداد العرض.

التسلسل التسلسلي والتصوير اللاحق عاليه الدقة من الانسجه البيولوجية باستخدام المجهر الكتروني (EM) تسمح للتجزئة وأعاده بناء مكدسات العمر عاليه الدقة للكشف عن الأنماط الهيكلية التي لا يمكن حلها باستخدام 2D الصور. في الواقع ، قد يؤدي هذا الأخير إلى سوء تفسير التحويرات ، كما هو الحال في الميتوكوندريا ؛ استخدام النماذج ثلاثية الابعاد هو ، لذلك ، أكثر وأكثر شيوعا وتطبيقها علي صياغة الفرضيات الوظيفية القائمة علي المورفولوجية. وحتى الآن ، فان استخدام النماذج الثلاثية الابعاد المتولدة من أكوام الصور الضوئية أو الكترونيه يجعل التقييمات النوعية والبصرية ، فضلا عن القياس الكمي ، أكثر ملاءمة لتنفيذها مباشره في الابعاد الثلاثية. وبما ان هذه النماذج غالبا ما تكون معقده للغاية ، فان بيئة الواقع الافتراضي مهمة أيضا لوضعها للتغلب علي الانسداد والاستفادة الكاملة من البنية ثلاثية الابعاد. هنا ، يتم وصف دليل خطوه بخطوه من تجزئه الصورة إلى أعاده البناء والتحليل بالتفصيل.

النموذج الأول المقترح لاعداد المجهر الكترون السماح القسم التسلسلي الألى والتصوير يعود إلى 1981¹; نشر مثل هذه الاجهزه اليه ، وتحسين لصوره عينات كبيره باستخدام EM زادت في السنوات العشر الاخيره^2،3، ويعمل عرض الإنشاءات الكثيفة مثيره للإعجاب أو مورفولوجيس^{كامله فورا يتبع 4 ، 5،6،7،8،9،10}.

وجاء إنتاج مجموعات البيانات الكبيرة مع الحاجة إلى خطوط أنابيب محسنه لتجزئه الصور. تم تصميم أدوات البرمجيات للتقسيم اليدوي للأقسام التسلسلية ، مثل أعاده البناء و TrakEM2^11،12، لنقل المجهر الكتروني (TEM). وبما ان العملية برمتها يمكن ان تستغرق وقتا طويلا للغاية ، فان هذه الاداات ليست مناسبه عند التعامل مع آلاف الرسوم البيانية التسلسلية التي يمكن إنشاؤها تلقائيا باستخدام تقنيات القسم التسلسلي (3DEM) لأحدث التقنيات ، مثل [بلوك-فيس] مسح الكترون مجهر ([سبم])³ أو يركز أيون [شعاع-سكنينغ] الكترون مجهريه ([فل-سم])². ولهذا السبب ، يبذل العلماء جهودا لتطوير أدوات شبه مؤتمتة ، فضلا عن أدوات مؤتمتة بالبالكامل ، لتحسين كفاءه التجزئة. ويجري تحسين الاداات المؤتمتة بالبالكامل ، استنادا إلى التعلم الألى¹³ أو الدولة من بين الفن ، خوارزميات تصنيف بكسل غير مدربه¹⁴، لاستخدامها من قبل مجتمع أكبر ؛ ومع ذلك ، لا تزال التجزئة بعيده عن ان تكون موثوقه تماما ، والعديد من الاعمال لا تزال قائمه علي العمل اليدوي ، وهو غير فعال من حيث الوقت التجزئة ولكن لا يزال يوفر الموثوقيه الكاملة. وتمثل الاداات شبه المؤتمتة ، مثل ilastik¹⁵، حلا توفيقيا أفضل ، لأنها توفر قراءات فورية للتقسيم الذي يمكن تصحيحه إلى حد ما ، علي الرغم من انه لا يوفر اطارا حقيقيا للتصحيح اللغوي ، ويمكن دمجه باستخدام TrakEM2 بالتوازي¹⁶.

والتجزئة الواسعة النطاق ، حتى الآن ، تقتصر في معظمها علي الكونيكميات ؛ ولذلك ، فان علماء الكمبيوتر هم الأكثر اهتماما في توفير أطر لمرئيات متكاملة من مجموعات البيانات الكبيرة والمشروحة وتحليل أنماط الاتصال التي يستدل عليها من وجود اتصالات متشابك^17،18. ومع ذلك ، يمكن استخدام عمليات أعاده البناء الدقيقة ثلاثية الابعاد للتحليلات الكمية ، بدلا من التقييمات النوعية للهياكل ثلاثية الابعاد. وقد وضعت أدوات مثل نيورومورف^19،20 وتحليل الجليكوجين¹⁰ لاتخاذ القياسات علي أعاده البناء 3d لأطوال والمناطق السطحية والاحجام ، وعلي توزيع نقاط السحابة ، تماما تجاهل المكدس EM الأصلي^8,10. Astrocytes تمثل دراسة حاله مثيره للاهتمام ، لان نقص القرائن البصرية أو الأنماط الهيكلية المتكررة تعطي المحققين تلميحا حول وظيفة الوحدات الهيكلية الفردية وما يترتب علي ذلك من عدم وجود الأخلاقيات الكافية من العمليات استروسيتيك ²¹، وجعلها صعبه لتصميم الاداات التحليلية. وكانت أحدي المحاولات الاخيره هي المستخرجة²²، والتي تسمح بالاستكشاف البصري للعمليات الفلكية والاستدلال علي العلاقات النوعية بين العمليات الفلكية والعصبية.

ومع ذلك ، فان الراحة من الانسجه التصويرية تحت EM ياتي من حقيقة ان كميه المعلومات المخباه في عينات الدماغ سليمه هائله وتفسير الصور قسم واحد يمكن التغلب علي هذه المسالة. كثافة الهياكل في الدماغ عاليه جدا ان أعاده البناء 3D حتى من الكائنات القليلة مرئية في وقت واحد من شانه ان يجعل من المستحيل تمييزها بصريا. لهذا السبب ، اقترحنا مؤخرا استخدام الواقع الافتراضي (VR) كطريقه محسنه لمراقبه الهياكل المعقدة. ونحن نركز علي استروسيتيس²³ للتغلب علي انسداد (وهو حجب رؤية كائن من الفائدة مع الثانية ، في الفضاء 3d) وسهوله التقييمات النوعية لأعاده البناء ، بما في ذلك التدقيق اللغوي ، وكذلك كميات من الميزات باستخدام عدد النقاط في الفضاء. جمعنا مؤخرا الاستكشاف البصري VR مع استخدام جلام (الجليكوجين المستمدة من اللاكتات امتصاص نموذج) ، وهي تقنيه لتصور خريطة لاحتمال مكوك اللاكتات من العصب ، من خلال النظر في حبيبات الجليكوجين والهيئات التي ينبعث منها الضوء²³؛ علي وجه الخصوص ، استخدمنا VR لقياس القمم الضوئية التي تنتجها جلام.

1. معالجه الصور باستخدام فيجي

1. فتح مكدس الصور عن طريق سحب وإسقاط الملف الأصلي من المجهر الذي يحتوي علي المكدس ، أو عن طريق سحب وإسقاط المجلد الذي يحتوي علي كومه الصورة بأكملها في اطار البرنامج.
   ملاحظه: فيجي قادره علي التعرف تلقائيا علي جميع صيغ الصور القياسية ، مثل jpg ، .tif ، و .png ، فضلا عن تنسيقات الملفات الملكية من مقدمي المجهر. بينما تم تحسين البروتوكول التالي للحصول علي مكدسات الصور من 3DEM ، قد يتم استخدام هذه الخطوات لبيانات المجهرية الضوئية أيضا.
2. بمجرد فتح المكدس ، انتقل إلى الصورة > خصائص للتاكد من ان حجم فوكسل قد تمت قراءته من بيانات التعريف. إذا لم يكن كذلك ، يمكن إدخاله يدويا.
3. تاكد من تحويل الصورة إلى 8 بت. انقر علي الصورة ≫ اكتب وحدد 8 بت.
4. إذا كان المكدس الأصلي في ملفات/مجلدات متسلسلة مختلفه ، استخدم سلسله لدمجها في مكدس واحد عن طريق تحديد صوره > مكدسات > أدوات > سلسله.
5. حفظ المكدس عن طريق تحديد ملف ≫ حفظ باسم. سيتم حفظه كملف .tif واحد ويمكن استخدامه كنسخه احتياطيه ولمزيد من المعالجة.
6. إذا تم الحصول علي المكدس الأصلي كما البلاط مختلفه ، وتطبيق خياطه داخل TrakEM2.
   1. إنشاء مشروع TrakEM2 جديد باستخدام جديد ≫ TrakEM2 (فارغ).
   2. ضمن واجهه المستخدم الرسوميه العرض (GUI) ، استيراد مكدسات بالنقر فوق زر الماوس الأيمن > استيراد > المكدس الاستيراد، واستيراد جميع البلاط فتحت في الواجهة الجوية الرئيسية فيجي. تاكد من تغيير حجم لوحه الرسم القماشية لتلائم المكدس بالبالكامل بالنقر بزر الأيمن فوق > عرض > تغيير حجم اللوحة القماشية/مجموعه الطبقات، واختيار حجم y/x بكسل اعتمادا علي الحجم النهائي لمونتاج.
      ملاحظه: علي سبيل المثال ، إذا كان ينبغي الانتهاء من المونتاج باستخدام أربعه البلاط من 4,096 x 4,096 بكسل ، يجب ان يكون حجم قماش علي الأقل 8,192 x 8,192 بكسل. النظر في جعله أكبر قليلا ، والمحاصيل في وقت لاحق.
   3. فرض الأجزاء المشتركة من البلاط الفردية عن طريق سحب وإسقاط لهم علي مجموعه طبقه. استخدم شريط التمرير العلوي الأيسر لتعديل الشفافية للمساعدة في الفرض الفائق.
   4. المونتاج وأعاده محاذاة المكدسات بالنقر فوق زر الماوس الأيمن ≫ محاذاة، ثم حدد أحد الخيارات (انظر الملاحظة أدناه).
      ملاحظه: SBEM أو الاكذوبه-SEM عاده بالفعل محاذاة بشكل جيد ، ولكن قد تحدث المحاذاة طفيفه. محاذاة الطبقات هي خط الأنابيب الألى لمحاذاة z ; المونتاج طبقات متعددة هو خط الأنابيب الألى لمحاذاة البلاط علي كل كومه z ، لوحده التخزين بأكملها ؛ محاذاة فسيفساء متعدد الطبقات يجمع بين الخيارين السابقين. تستغرق هذه العملية وقتا طويلا وتخضع لذاكره الوصول العشوائي (RAM) الخاصة بالجهاز. النظر في استخدام كمبيوتر الراقية والسماح لها بتشغيل لساعات/أيام ، اعتمادا علي حجم المكدس.
   5. وأخيرا ، تصدير مكدسات الصور وحفظها باستخدام الماوس الأيمن فوق ≫ جعل صوره مسطحه، ومن ثم تاكد من تحديد الأول إلى الصورة الاخيره في القوائم المنسدلة بدء ونهاية.
   6. باستخدام الدالات المضمنة TrakEM2 ، تقسيم الهياكل الفائدة إذا لزم الأمر.
      1. في TrakEM2's GUI ، انقر بزر الماوس الأيمن علي اي شيء تحت اطار القالب وحدد أضافه طفل جديد ≫ Area_list.
      2. سحب وإسقاط اي شيء علي راس المجلد تحت كائنات المشروع، وسوف تظهر اي شيء واحد هناك.
      3. اسحب وأسقط قائمه المنطقة من القالب إلى اي شيء موجود ضمن كائنات Project.
      4. علي منفذ عرض مكدس الصورة ، حدد المساحة Z مع المؤشر. ستظهر قائمه المناطق مع رقم معرف فريد. حدد أداه فرشاه علي اعلي (أسفل اليمين) واستخدام الماوس لتقسيم هيكل عن طريق ملء cytosol لها ، علي كومه z كله.
      5. قم بتصدير القناع المجزا ليتم استخدامه في ilastik كبذره للنحت بالنقر بزر الأيمن علي كائن قائمه المساحة علي قائمه المساحة Z ، أو علي القناع في منفذ العرض ، وحدد تصدير قوائم > منطقه كتسميات (tif).
7. اعتمادا علي القرار اللازم لمزيد من أعاده البناء ، إذا كان ذلك ممكنا ، والحد من حجم بكسل من كومه الصورة عن طريق اختزال ، مع الأخذ في الاعتبار متطلبات الذاكرة من البرنامج الذي سيتم استخدامه للتجزئة وأعاده الاعمار. استخدام الصورة ≫ ضبط > الحجم.
   ملاحظه: ilastik يعالج أكوام تصل إلى 500 بكسل علي xy جيدا. أيضا ، تقليل الاختزال سيقلل من دقه المكدس; لذلك ، تاخذ في الاعتبار الحد الأدنى للحجم الذي لا يزال يظهر الكائن يمكن التعرف عليها ، التالي ، يمكن ان تكون مجزاه.
8. ولتعزيز التباين والمساعدة في التجزئة ، يمكن تطبيق فلتر القناع غير الحاد لجعل الاغشيه هشه. استخدام > العملية تصفيه > قناع اونشارب.
9. تصدير مكدس الصور كصور واحده لمزيد من المعالجة في البرامج التجزئة ، (علي سبيل المثال ، ilastik) ، وذلك باستخدام ملف ≫ حفظ باسم... > تسلسل الصورة واختر تنسيق .tif.

2. التقسيم (شبه الألى) وأعاده الاعمار باستخدام ilastik 1-3-2

1. في واجهه المستخدم الرسوميه ilastik الرئيسية ، حدد وحده نحت .
2. تحميل مكدس الصور باستخدام أضافه ≫ جديده أضافه وحده تخزين ثلاثية الابعاد/4d واحده من التسلسل.
3. حدد الدليل بالبالكامل واختر المجلد الذي يحتوي علي مكدس الصور المحفوظ كملفات مفرده. في الجزء السفلي من النافذة الجديدة ، حيث تتوفر خيارات لتحميل الصور ، تاكد من إبقاء Z المحددة.
4. للخطوات التالية ، يمكن العثور علي جميع العمليات والأزرار علي الجانب الأيسر من واجهه المستخدم الرسوميه الرئيسية للبرنامج. ضمن علامة التبويب المعالجة المسبقة ، استخدم الخيارات القياسية المحددة بالفعل. استخدام خطوط مشرق (مرشحات ريدج) والحفاظ علي مقياس التصفية في 1.600. يمكن تعديل هذه المعلمة بعد ذلك.
5. بمجرد الانتهاء من المعالجة المسبقة ، حدد الصفحة التالية في القائمة المنسدلة لوحده الوسم . كائن واحد وخلفيه واحده موجودة بشكل افتراضي.
6. حدد الكائن البذور عن طريق النقر عليه ، ورسم خط علي راس هيكل الفائدة ؛ ثم حدد بذره الخلفية وارسم سطرا واحدا أو عده أسطر خارج الكائن الذي سيتم أعاده بنائه. ثم ، انقر علي قطعه ، وانتظر.
   ملاحظه: اعتمادا علي قوه الكمبيوتر وحجم المكدس ، قد تستغرق التجزئة من بضع ثوان إلى ساعات. وبمجرد الانتهاء من ذلك ، يجب ان يظهر قناع شبه شفاف الذي يسلط الضوء علي التقسيم علي اعلي الهيكل المجزا.
   1. مرر خلال المكدس للتحقق من التجزئة. قد لا تكون التجزئة دقيقه ولا تتبع بنيه الاهتمام بدقه أو تسرب منها. صحح اي امتداد عن طريق وضع بذره خلفيه علي التجزئة المسكوبة ، وأضافه بذره كائن فوق الجزء غير المعاد بناؤه من الكائن الذي يهم.
   2. إذا كانت التجزئة لا تزال غير صحيحه ، فحاول تعديلها باستخدام معلمه الانحياز ، التي ستزيد أو تخفض كميه البيكسلات المصنفة غير المؤكدة كما تم قبولها. قيمته 0.95 بشكل افتراضي; إنقاصه للحد من اي امتداد (عاده ما لا يقل عن 0.9) أو زيادة إذا كانت التجزئة متحفظة جدا (تصل إلى 1).
   3. احتمال آخر هو العودة إلى الخطوة 2.4 (بالنقر فوق المعالجة المسبقة) وتعديل حجم عامل التصفية; زيادة القيمة (علي سبيل المثال ، إلى 2) سيقلل من الآثار الشبيهة بالضوضاء الملح والفلفل ولكن سوف تجعل أيضا الاغشيه أكثر وضوحا وأصغر تفاصيل أصعب للكشف. وهذا قد يحد من انتشار العدوى.
7. أعاده التاكيد بقدر الحاجة ، طالما تم تقسيم جميع الكائنات المطلوبة. بمجرد الانتهاء من كائن ، انقر فوق حفظ الكائن الحالي، أسفل قطعه. سوف تظهر اثنين من البذور الجديدة ، لبدء تجزئه كائن جديد.
8. استخراج تنسجم السطح علي الفور كملفات obj بالنقر علي تصدير جميع تنسجم.
9. إذا لزم الأمر المزيد من التدقيق اللغوي ، يمكن استخراج التجزئة كاقنعه ثنائيه. حدد القناع لتصديره بالنقر فوق استعراض الكائنات; ثم انقر بزر الماوس الأيمن علي تقسيم ≫ تصدير ثم ، ضمن معلومات ملف الإخراج، حدد تسلسل tif كتنسيق.

3. التدقيق اللغوي/التجزئة (دليل) في TrakEM2 (فيجي)

1. تحميل مكدس الصور وإنشاء مشروع TrekEM2 جديده وفقا ل1.6.1 الخطوة.
2. استيراد الاقنعه التي تحتاج إلى التدقيق اللغوي باستخدام الخيارات استيراد التسميات كعلماء، المتاحة في نفس القائمة الاستيراد المستخدمة لاستيراد مكدس الصورة.
3. حدد الفيلسوف الذي تم استيراده في المساحة Z واستخدم أداه الفرشاة لمراجعه التجزئة.
4. تصور النموذج في 3D عن طريق النقر بزر الأيمن علي قائمه المنطقة ≫ إظهار في 3d. في الإطار التالي يسال عن عدد وافر ، سيتم إنشاء قيمه اعلي شبكه دقه اقل.
   ملاحظه: اعتمادا علي حجم الكائن ، خذ بالاعتبار استخدام قيمه بين 4 و 6 ، والتي عاده ما تعطي أفضل حل وسط بين الدقة والتفاصيل المورفولوجية.
5. تصدير شبكه 3D كما الموجي. obj عن طريق اختيار من ملف القائمة ≫ تصدير الأسطح ≫ جبهة الموجي.

4. تحليل ثلاثي الابعاد

1. افتح الخلاط. للخطوات التالية ، تاكد من تثبيت مجموعه أدوات نيورومورف (متوفرة في https://neuromorph.epfl.ch/index.html) ومجموعه أدوات تحليل الجليكوجين (متوفرة في https://github.com/daniJb/glyco-analysis).
   1. استيراد الكائنات باستخدام الاستيراد الدفعي نيورومورف بالنقر فوق استيراد كائنات ضمن قائمه المشهد ، لاستيراد كائنات متعددة في وقت واحد. تاكد من تنشيط استخدام رمش والتظليل السلس.
      ملاحظه: لا ينصح بالنقر علي إنهاء رمش إذا كان هناك عدم يقين حول الحجم الاولي للكائن. استيراد عمق شجره في القيمة 7 (الافتراضي) عاده جيده للحفاظ علي دقه مقبوله والمورفولوجية للكائن.
   2. حدد الكائن من الفائدة من البطانة وتعديل عمق octree الدالة رمش تحت القائمة معدلات تكراري لتقليل عدد القمم وتجنب فقدان التفاصيل في الدقة وتصحيح الشكل. عند تغيير عمق الشجرة الثمانية ، ستتغير الشبكة علي واجهه المستخدم الرسوميه الرئيسية وفقا لذلك. بمجرد الانتهاء ، انقر علي تطبيق لإنهاء العملية.
      ملاحظه: القيم حول 4 عاده ما تكون جيده للكائنات الصغيرة (مثل كثافات ما بعد التشابك) ، والقيم حول 7 لأكبر منها (مثل محاور طويلة أو dendrites) ، والقيم حول 8 أو 9 لمورفولوجيس الخلوية الكاملة حيث تفاصيل القرارات المختلفة يجب ان تكون حفاظ علي.
   3. استخدام صوره أداه استعلاء التفاعلات مكدس الصورة علي اللوحة اليمني ، تحت القائمة نيورومورف ، لتحميل مكدس الصورة. تاكد من إدخال الحجم الفعلي لمكدس الصور ل xو yو x (في ميكرون أو نانومتر ، اعتمادا علي وحدات الشبكة) وحدد مسار المكدس بالنقر فوق Source_Z. X و Y هي الطائرات المتعامدة. فهي اختياريه سيتم تحميلها فقط إذا قام المستخدم بادراج مسار صالح.
   4. ثم ، حدد شبكه علي منفذ العرض عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن عليه ، ادخل وضع التحرير عن طريق الضغط علي علامة التبويب، حدد واحد (أو أكثر) القمم باستخدام الفاره الأيمن فوق ، وأخيرا ، انقر علي إظهار الصورة في القمه. واحد (أو أكثر) قطع الطائرة (ق) مع الرسم المجهري سوف تظهر متراكبه علي راس الشبكة.
   5. حدد الطائرة المقطوعة بالنقر بزر الماوس الأيمن عليها ، واضغط علي Ctrl + Y، ومرر فوق النموذج الثلاثي الابعاد باستخدام تمرير الفاره. ويمكن أيضا ان تستخدم هذه الطريقة لتصحيح الطرق المطبعية.
   6. استخدم أدوات القياس لتكميم المساحات والاحجام والأطوال. وقد وثقت هذه العمليات في مزيد من التفاصيل من قبل Jorstad وآخرون¹⁹ وعلي موقع نيورومورف²⁴.
   7. استخدام أداه تحليل الجليكوجين لقياس قرب الجليكوجين نحو الأشواك والبوتون. يتم توثيق العمليات بمزيد من التفاصيل في منشور سابق¹⁰ وفي مستودع تحليل الجليكوجين²⁵.
2. تشغيل جلام²³. التعليمات البرمجية ، القابل للتنفيذ ، وبعض ملفات الاختبار متوفرة في مستودع جلام²⁶.
   1. اعداد ملفين الهندسة في تنسيق. ply: ملف مصدر واحد يحتوي علي حبيبات الجليكوجين وملف هدف واحد يحتوي علي أسطح المورفولوجية.
   2. جهز ثلاثه ملفات خرائط ascii (كل سطر يحتوي علي t_norm (0.. 1) R (0.. 255) G (0.255) B (0.255)) لتمثيل قيم الاستيعاب المحلية ، قيم الذروة ، ومتوسط قيم الامتصاص.
   3. تنفيذ البرنامج النصي c + + جلام ، مع ملفات الهندسة (الخطوة 4-2-1) وملفات colormap (الخطوة 4.2.2) ، عن طريق تعيين نصف قطر التاثير (في ميكرون) ، والحد الأقصى لقيمه الاستيعاب المتوقعة ، وعتبه تطبيع لتجميع قمم الامتصاص. للحصول علي معلومات حول معلمات أخرى تنفيذ البرنامج النصي مع الخيار-تعليمات.
   4. تصدير النتائج كملفات. ply أو obj: الكائنات الهدف التي تم تعيينها بقيم جلام ، وعلامات ذروه الامتصاص الممثلة كمجالات مرمزه بألوان ، والكائنات المستهدفة مرمزه بألوان فيما يتعلق بقيمه الامتصاص المتوسطة.
3. فتح التفاعل البيانات VR. VR Data تتفاعل-التعليمات البرمجية القابلة للتنفيذ متوفرة في مستودع عام²⁷.
   1. استيراد شبكات ليتم تصورها ، واتباع الإرشادات الواردة في قائمه VR. تاكد من استيراد ملفات obj المحسوبة في الخطوة 4-2-1 ، في حاله الحاجة إلى تحليل جلام.

باستخدام الاجراء المعروض أعلاه ، ونحن تظهر النتائج علي اثنين من أكوام الصورة من احجام مختلفه ، لتوضيح كيف ان مرونة الاداات يجعل من الممكن لتوسيع نطاق الاجراء إلى مجموعات البيانات أكبر. في هذه الحالة ، واثنين من مجموعات البيانات 3DEM هي (ط) P14 الفئران ، القشرة الجسدية ، الطبقة السادسة ، 100 μm س 100 μm س 76.4 μm⁴ و (2) P60 الفئران ، الحصين CA1 ، 7.07 μm x 6.75 μm x 4.73 μm¹⁰.

يمكن تنفيذ خطوات المعالجة المسبقة (الشكل 1) بنفس الطريقة لكل من مجموعات البيانات ، مع الأخذ بعين الاعتبار ان مجموعه بيانات أكبر مثل المكدس الأول ، وهو 25 غيغابايت ، تتطلب المزيد من الاجهزه المنفذة لمعالجه البيانات الكبيرة والمرئيات والمعالجة . المكدس الثاني هو فقط 1 غيغابايت ، مع حجم فوكسل الانسيابية تماما.

قد لا يكون حجم البيانات متصلا مباشره بمجال العرض (فوف) ، بدلا من حل المكدس نفسه ، والذي يعتمد علي الحد الأقصى لحجم البكسل لمستشعر المجهر ، وتكبير المكدس. وعلي اي حال ، فمن المرجح ان تحتل الصور الأكبر حجما المساحة المادية بالمقارنة مع الصور الأصغر حجما ، إذا تم الحصول عليها في نفس القرار.

بمجرد استيراد مكدس الصور ، كما هو مبين في القسم 1 من البروتوكول ، في برنامج فيجي (الشكل 1A) ، وهو إصدار علمي من imagej¹²، نقطه مهمة واحده هي التاكد من ان تنسيق الصورة هو 8 بت (الشكل 1a). هذا لان العديد من البرمجيات الاستحواذ المختلفة الشركات المجهرية المنتجين توليد تنسيق الملفات الخاصة بهم في 16 بت لتخزين البيانات الوصفية ذات الصلة لمعلومات حول عمليه الاستحواذ (اي ، حجم بكسل ، سمك ، الحالي/الجهد من شعاع الكترون ، ضغط الغرفة) مع كومه الصورة. تسمح هذه التعديلات للعلماء بحفظ الذاكرة ، حيث ان البيانات الوصفية الاضافيه التي تحتوي علي 8 بت لا تؤثر علي الصور. المعلمة الهامه الثانية للتحقق هو حجم فوكسل ، والذي يسمح بعد ذلك أعاده البناء بعد التجزئة التي يتعين أداؤها علي المقياس الصحيح (ميكرومتر أو نانومتر ؛ الشكل 1 (ب).

قد تحتاج المكدسات إلى أعاده المحاذاة و/أو الخياطة إذا تم الحصول عليها باستخدام التجانب. ويمكن اجراء هذه العمليات داخل TrakEM2 (الشكل 2A) ، علي الرغم من ان فيما يتعلق باعاده التنظيم ، وتقنيات 3dem الألى مثل الاكذوبه-SEM أو 3dem وعاده ما تتم أعاده تنظيمها بشكل جيد.

تتطلب أحدي الخطوات الاخيره التصفية ، وربما ، اختزال المكدس ، اعتمادا علي الكائنات التي تحتاج إلى أعاده بنائها وما إذا كانت الاختزالات تؤثر علي التعرف علي الميزات القابلة للإنشاء. علي سبيل المثال ، لكومه أكبر (من القشرة الحسية الجسدية من الفئران P14) ، لم يكن من الممكن لتسويه القرار لصالح كفاءه أعاده البناء ، في حين لكومه أصغر (من الحصين CA1 من P60 الفئران) ، كان من الممكن القيام بذلك لان القرار كان اعلي بكثير مما كان مطلوبا لأصغر الكائنات التي سيعاد بناؤها. وأخيرا ، فان استخدام قناع غير حاد يعزز الفرق بين الاغشيه والخلفية ، مما يجعلها مواتيه لأعاده الإنشاءات من البرمجيات مثل ilastik الذي يستخدم التدرجات لتقييم ما قبل الحدود.

بعد معالجه الصور ، يمكن اجراء أعاده البناء اما يدويا باستخدام TrakEM2 ، أو شبه تلقائي باستخدام ilastik (الشكل 2C). مجموعه البيانات مثل أصغر واحد المدرجة هنا (2) ، التي يمكن اختزالها لتناسب الذاكرة ، يمكن ان تكون مجزاه تماما باستخدام ilastik (الشكل 2B) لإنتاج أعاده بناء كثيفه. في حاله من مجموعه البيانات الاولي المدرجة هنا (ط) ، تمكنا من تحميل والتجهيز المسبق لمجموعه البيانات بأكملها مع محطه عمل لينكس مع 500 غيغابايت من ذاكره الوصول العشوائي. تم الحصول علي تجزئه متفرقة من 16 مورفولوجيس كامله مع خط أنابيب هجين ، عن طريق استخراج التجزئة الخام التي تم تدقيقها يدويا باستخدام TrakEM2.

تحليل 3D من الميزات مثل المناطق السطحية ، وحجم ، أو توزيع الجليكوجين داخل الخلايا يمكن ان يؤديها في بيئة خلاط (الشكل 3) باستخدام رموز مخصصه ، مثل نيورومورف¹⁹ أو تحليل الجليكوجين¹⁰.

في حاله مجموعات البيانات التي تحتوي علي حبيبات الجليكوجين كذلك ، يمكن الاستدلال علي التحليل علي توزيعها باستخدام جلام ، وهو رمز c + + التي من شانها ان تولد الخرائط مع منطقه تاثير مباشره علي شبكه.

وأخيرا ، يمكن تصور وتحليل مجموعات البيانات المعقدة هذه باستخدام الواقع الافتراضي ، الذي ثبت انه مفيد لتحليل مجموعات البيانات مع عرض مسدود معين (الشكل 4). فعلي سبيل المثال ، كانت القمم التي يستدل عليها من خرائط جلام قد استنتجت بسهوله بصريا من المنكرات في مجموعه البيانات الثانية التي نوقشت هنا.

الشكل 1: معالجه الصور واعدادها لتجزئه الصور. (ا) واجهه المستخدم الرئيسية في فيجي. (ب) مثال للصور المكدسة من مجموعه البيانات ' 1 ' التي نوقشت في النتائج التمثيلية. لوحه علي اليمين يظهر خصائص السماح للمستخدم لتعيين حجم فوكسل. (ج) مثال علي عمليه الوضع وتغيير الحجم المطبقة علي صوره واحده. اللوحات علي اليمين إظهار التكبير من مركز الصورة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: التجزئة وأعاده البناء باستخدام TrakEM2 و ilastik. (ا) TrakEM2 GUI مع كائنات مقسمه يدويا (باللون الأحمر). (ب) يمكن استخدام القناع المصدر من اللوحة ( ا ) كمدخل (بذره) من أجل (ج) التجزئة شبه المؤتمتة (النحت). من ilastik ، يمكن ان يتم تصدير الاقنعه (الأحمر) إلى TrakEM2 لتصحيح التدقيق اليدوي. (د) يمكن بعد ذلك تصدير الاقنعه باعتبارها شبكات ثلاثية الابعاد للكشف عن الهياكل التي أعيد بناؤها. وفي هذا المثال ، أعيد بناء أربعه خلايا عصبيه ، وأسطرلابات ، والخلايا الصغيرة ، والعجانات من مجموعه البيانات (i) (التي نوقشت في النتائج التمثيلية) باستخدام هذه العملية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: تحليل ثلاثي الابعاد للموولوجيات المعاد بناؤها باستخدام أدوات مخصصه. (ا) الحجم غير الانسيابي للحجم منمجموعهبيانات المعهد المؤسسي لشؤون المسنين (2) (كما نوقش في النتائج التمثيلية). (ب) التعمير الكثيف من الفريق الف. رمادي = axons; الأخضر = عمليه استروسيتيك ؛ الأزرق = dendrites. (ج) الرسم البياني المصغر الذي يعرض أمثله للأهداف المتعلقة بالكميات مثل الوصلات العصبية (مجموعه البيانات ' 1 ') وحبيبات الجليكوجين الفلكية (مجموعه البيانات ' 2 ') في التكبير الصحيح. (د) قناع من الفريق ج تبين توزيع حبيبات الجليكوجين حول المشابك العصبية. (ه) القياس الكمي لتوزيع الجليكوجين من مجموعه البيانات من اللوحة c، وذلك باستخدام أدوات تحليل الجليكوجين من الخلاط. تشير أشرطه الخطا إلى الأخطاء القياسية. N = 4,145 حبيبات الجليكوجين. (و) رسم إيضاحي لمرئيات المدخلات والمخرجات الخاصة ب جلام. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: التحليل في الواقع الافتراضي. (ا) مستخدم يرتدي سماعه الواقع الافتراضي اثناء عمله علي (ب) أعاده البناء الكثيفة من مجموعه البيانات (ii) (كما نوقشت في النتائج التمثيلية). (ج) مشهد الواقع الافتراضي غامره من مجموعه فرعيه من العصب من لوحه b. الليزر الأخضر يشير إلى ذروه جلام. (د) مثال علي تحليل لذروه جلام في الواقع الافتراضي. N = 3 الفئران في كل شريط. تحليل الاكذوبه-SEM من منشور سابق²⁸. تشير أشرطه الخطا إلى الأخطاء القياسية; *p < 0.1 ، في اتجاه واحد ANOVA. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الطريقة المعروضة هنا هي دليل خطوه بخطوه مفيده لتقسيم وأعاده بناء 3D من مجموعه البيانات EM متعددة المقاييس ، سواء كانت تاتي من تقنيات التصوير عاليه الدقة ، مثل التقنية المؤسسية-SEM ، أو غيرها من العمليات المتسلسلة الألى والتصوير تقنيات. الاكذوبه-SEM لديه ميزه الوصول المحتملة الكمال في حجم فوكسل بقطع مقاطع رقيقه مثل 5 نانومتر باستخدام شعاع أيون مركزه ، فوف قد تكون محدوده ل 15-20 μm بسبب التحف الجانبية ، والتي ربما بسبب ترسب الانسجه قطع إذا كان FO V يتجاوز هذه القيمة. ويمكن تجنب مثل هذه القطع الاثريه باستخدام تقنيات أخرى ، مثل SBEM ، الذي يستخدم سكين الماس لقطع المقاطع التسلسلية داخل غرفه المجهر. في هذه الحالة الاخيره ، يمكن ان يكون القرار z حول 20 نانومتر في أحسن الأحوال (عاده ، 50 نانومتر) ، ولكن فوف قد يكون أكبر ، علي الرغم من ان القرار بكسل يجب ان يكون عرضه للخطر لمنطقه شاسعه من الاهتمام. حل واحد للتغلب علي هذه القيود (التكبير مقابل فوف) هو تقسيم المنطقة من الاهتمام في البلاط والحصول علي كل واحد منهم في قرار اعلي. لقد أظهرنا هنا النتائج من كل من المكدس SBEM-مجموعه البيانات (ط) في النتائج التمثيلية-والاكذوبه-SEM كومه-البيانات (2) في النتائج التمثيلية.

ومع تزايد شيوع توليد مجموعات البيانات الأكبر حجما والأكبر حجما ، تتزايد الجهود المبذولة لإيجاد أدوات لتصنيف البيكسل والتجزئة المؤتمتة للصور. ومع ذلك ، حتى الآن ، لم يثبت اي برنامج موثوقيه مماثله لتلك التي من التدقيق اللغوي البشري ، ولذلك لا يزال من الضروري ، بغض النظر عن مدي مضيعه للوقت. وبشكل عام ، يمكن أعاده تشكيل مجموعات البيانات الصغيرة التي يمكن اختزالها ، كما في حاله مجموعه البيانات ' 2 ' ، بشكل كثيف من قبل مستخدم واحد خبير في الأسبوع ، بما في ذلك وقت التدقيق اللغوي.

البروتوكول المعروض هنا ينطوي علي استخدام ثلاثه برامج البرمجيات علي وجه الخصوص: فيجي (الإصدار 2.0.0/1.65 b) ، ilastik (الإصدار 1-3-2 rc2) ، وخلاط (2.79) ، والتي هي جميع البرامج مفتوحة المصدر ومتعددة منصة وتحميلها مجانا. فيجي هو الإفراج عن ImageJ ، مدعوم من الإضافات لتحليل الصور البيولوجية. لديها بنيه البرمجيات قويه ويقترح كما هو منصة مشتركه للعلماء الحياة ويشمل TrakEM2 ، واحده من الإضافات الاولي والأكثر استخداما علي نطاق واسع لتقسيم الصورة. مشكله واحده من قبل العديد من المستخدمين في الاونه الاولي هو الانتقال من جافا 6 إلى Java 8 ، الذي يقوم بإنشاء مشاكل التوافق. لذلك ، نقترح الامتناع عن التحديث إلى Java 8 ، ان أمكن ، للسماح لفيجي بالعمل بشكل صحيح. ilastik هو برنامج قوي يوفر عددا من الأطر لتصنيف بكسل ، كل واحد موثق وشرح علي موقعه علي الإنترنت. وحده نحت المستخدمة لتقسيم شبه الألى من مكدسات EM مريحه لأنه يوفر الكثير من الوقت ، مما يسمح للعلماء للحد من الوقت المستغرق في العمل اليدوي من أشهر إلى أيام لمستخدم من ذوي الخبرة ، كما هو الأمر مع بنقره واحده يمكن ان يكون العصب بأكمله مجزاه في ثوان. خطوه المعالجة المسبقة مكثفه جدا من وجهه نظر الاجهزه ، ومجموعات البيانات الكبيرة جدا ، مثل كومه SBEM قدمت هنا ، والتي كانت 26 غيغابايت ، تتطلب استراتيجيات غريبه لتناسب الذاكرة ، معتبرا ان واحدا من شانه ان يكتسب مجموعه بيانات كبيره لأنه لا يمكن تسويه مجال الرؤية والحل. ولذلك ، قد لا يكون الاختزال حلا مناسبا في هذه الحالة. أحدث إصدار من البرنامج يمكن ان تفعل المعالجة المسبقة في بضع ساعات مع محطه عمل لينكس قويه ، ولكن تقسيم سيستغرق دقائق ، والتمرير من خلال المكدس سيكون لا يزال بطيئا نسبيا. لا نزال نستخدم هذه الطريقة لأول ، والتجزئة الخام ، وتدقيقها باستخدام TrakEM2. وأخيرا ، خلاط هو برنامج 3D النمذجة ، مع محرك العرض 3D قويه ، والتي يمكن تخصيصها مع البرامج النصية بيثون التي يمكن ان تكون جزءا لا يتجزا في واجهه المستخدم الرسوميه الرئيسية كوظائف اضافيه ، مثل نيورومورف وتحليل الجليكوجين. مرونة هذا البرنامج ياتي مع العيب الذي ، علي النقيض من فيجي ، علي سبيل المثال ، لم يتم تصميمه لتصور علي الإنترنت من مجموعات البيانات الكبيرة ؛ لذلك ، قد يكون التصور والتنقل من خلال شبكات كبيره (تتجاوز 1 غيغابايت) بطيئه وغير فعاله. وبسبب هذا ، فانه من المستحسن دائما لاختيار التقنيات التي تقلل من تعقيد شبكه ولكن حريصون علي عدم تعطيل المورفولوجية الأصلي للهيكل الفائدة. وتاتي وظيفة رمش في متناول اليدين وهي ميزه مضمنه في أداه استيراد نيورومورف الدفعي. مشكله مع هذه الدالة هو انه ، اعتمادا علي عدد القمم من الشبكة الاصليه ، يجب تعديل قيمه عمق octree ، والتي ترتبط بالدقة النهائية ، وفقا لذلك. يمكن أعاده الكائنات الصغيرة مع عمق ثماني شجره صغيره (علي سبيل المثال 4) ، ولكن نفس القيمة قد يعطل تشكل الأجسام الكبيرة ، والتي تحتاج إلى قيم أكبر (6 في أحسن الحال ، إلى 8 أو حتى 9 لشبكه كبيره جدا ، مثل خليه كامله). فانه من المستحسن لجعل هذه العملية تكراريه واختبار أعماق octree مختلفه إذا كان حجم الكائن غير واضح.

وكما ذكر سابقا ، فان أحد الجوانب التي ينبغي مراعاتها هو القدرة الحسابية التي ستكرس لأعاده البناء والتحليل ، المتصلة بالبرمجيات المستخدمة. تم الحصول علي جميع العمليات المبينة في النتائج التمثيلية لهذه المخطوطة باستخدام MacPro ، مجهزه ببطاقة جرافيكس AMD FirePro كاميرا d500 ، 64 غيغابايت من ذاكره الوصول العشوائي ، ووحده المعالجة المركزية Intel Xeon E5 مع 8 النوى. فيجي لديها بنيه برمجيات جيده للتعامل مع مجموعات البيانات الكبيرة; ولذلك ، فمن المستحسن استخدام جهاز كمبيوتر محمول مع أداء الاجهزه جيده ، مثل ماك بوك برو مع 2.5 غيغاهرتز انتل i7 وحده المعالجة المركزية و 16 غيغابايت من ذاكره الوصول العشوائي. ilastik البرمجيات هو أكثر تطلبا من حيث الموارد الاجهزه ، ولا سيما اثناء مرحله ما قبل المعالجة. علي الرغم من ان اختزال الصورة المكدس هو خدعه جيده للحد من طلبات الاجهزه من البرنامج ويسمح للمستخدم لمعالجه كومه مع جهاز كمبيوتر محمول (عاده إذا كان اقل من 500 بكسل في x,y,z), نقترح استخدام الراقية كمبيوتر لتشغيل هذا البرنامج بسلاسة. نحن نستخدم محطه عمل مجهزه انتل زيون الذهب 6150 وحده المعالجة المركزية مع 16 النوى و 500 غيغابايت من ذاكره الوصول العشوائي.

عندما تقدم مع أعاده الاعمار 3D دقيقه ، يمكن للعلماء تجاهل الرسوم البيانية الاصليه والعمل مباشره علي نماذج 3D لاستخراج البيانات المفيدة مورفمتري لمقارنه الخلايا من نفس النوع ، فضلا عن أنواع مختلفه من الخلايا ، والاستفادة من الواقع الافتراضي التقييمات النوعية والكمية للموولوجيات. وعلي وجه الخصوص ، اثبت استخدام هذه الاخيره فائدته في حاله تحليلات التحويرات الكثيفة أو المعقدة التي تمثل انسدادا بصريا (اي عرقله الرؤية لموضوع الفائدة في الحيز الثلاثي الابعاد بواسطة ثانيه واحده توضع بين المراقب والغير الكائن الواحد) ، مما يجعل من الصعب تمثيلها وتحليلها في 3D. في المثال المقدم ، استغرق المستخدم المتمرس حوالي 4 ساعات غير متتابعة لمراقبه مجموعات البيانات وحساب الكائنات. قد يختلف الوقت المستغرق في تحليل الواقع الافتراضي لان جوانب مثل مرض الواقع الافتراضي (والتي يمكن ، إلى حد ما ، ان تكون ذات صله بمرض السيارة) يمكن ان يكون لها تاثير سلبي علي تجربه المستخدم. في هذه الحالة ، قد يفضل المستخدم أدوات التحليل الأخرى ويحد من وقته المخصص للواقع الافتراضي.

وأخيرا ، يمكن تطبيق كل هذه الخطوات علي المجهرية الأخرى والتقنيات غير EM التي تولد مكدسات الصور. EM يولد الصور التي هي ، بشكل عام ، تحديا للتعامل مع والقطاع ، مقارنه مع ، علي سبيل المثال ، المجهر الفلوري ، حيث شيء مماثل لقناع ثنائي (اشاره مقابل خلفيه سوداء) ، والتي يمكن في المبدا يمكن تقديمها بسهوله في 3D مزيد من المعالجة ، وغالبا ما يحتاج إلى التعامل معها.

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

وقد دعم هذا العمل من قبل جامعه الملك عبد الله للعلوم والتكنولوجيا (KAUST) منح البحوث التنافسية (CRG) منحه "تحالف KAUST-BBP لنمذجة تكامليه لاستقلاب طاقة الدماغ" إلى P.J.M.