تحصين الزرد الكبار للفحص السريري للقاحات الحمض النووي القائم

هنا يمكننا وصف بروتوكول لتحصين الزرد الكبار (دانيو rerio) بلقاح على أساس الحمض النووي وإثبات التحقق من صحة الحدث التطعيم الناجحة. هذا الأسلوب مناسبة لفرز المرشحين اللقاح في نماذج مختلفة من العدوى الإكلينيكية.

تزايد الاهتمام في التلقيح على أساس الحمض النووي خلال العقدين الماضيين. تلقيح الحمض النووي يقوم على استنساخ تسلسل مستضد محدد أو مجموعة من مولدات المضادات في بلازميد، التي تمكن من تصميم مصممة خصيصا وآمنة. إدارة لقاحات الحمض النووي داخل الخلايا المضيفة يؤدي إلى التعبير عن المستضدات التي تحفز الاستجابات المناعية خلطيه وخلية بوساطة. ويصف هذا التقرير بروتوكول لاستنساخ التسلسلات مستضد في بلازميد بكمف-اجفب، تحصين الزرد الكبار مع المرشحين لقاح microinjection العضلي، وانهانسر اللاحقة لتحسين المدخول. يتم التعبير عن المستضدات اللقاح بالبروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل)-الانصهار والبروتينات، والذي يسمح لتأكيد التعبير مستضد تحت ضوء من الأسماك الحية والتحديد الكمي لمستويات التعبير من البروتين الانصهار مع أليسا، كذلك كالأشعة فوق البنفسجية الكشف عنها بتحليل لطخة غربية. يتم اختبار تأثير المرشحين اللقاحات الواقية من إصابة الأسماك بكتريا مارينوم بوستفاكسينيشن خمسة أسابيع، متبوعاً بالتحديد الكمي للبكتيريا مع قبكر بعد أربعة أسابيع. بالمقارنة مع نماذج الفحص السريري الثدييات، يوفر هذا الأسلوب طريقة فعالة من حيث التكلفة لفحص أولى للمرشحين رواية لقاح الحمض النووي القائم ضد مرض المتفطرات. يمكن تطبيق الأسلوب كذلك إلى فحص الحمض النووي القائم اللقاحات ضد الأمراض البكتيرية والفيروسية المختلفة.

وأجريت دراسات لقاحات الحمض النووي الأول في التسعينات¹، ومنذ ذلك الحين، تم اختبار لقاحات الحمض النووي ضد مختلف الأمراض المعدية، والسرطان، والمناعة الذاتية، والحساسية². في الثدييات، وقد تم ترخيصها بالحمض النووي لقاح ضد فيروس غرب النيل في الخيول ولقاح سرطان علاجية لسرطان الجلد عن طريق الفم الكلاب البوليسية، ولكن هذه ليست حاليا في الاستخدام السريري². بالإضافة إلى الاهتمام الذي أثارت من قبل دراسات الثدييات، تحولت تلقيح الحمض النووي لتكون وسيلة مريحة لتحصين الأسماك المستزرعة ضد الأمراض الفيروسية. لقاح ضد فيروس نخر المكونة للدم المعدية الأسماك (إيهنف) قد تم في الاستخدام التجاري منذ عام 2005، ولقاح ضد فيروس نخر البنكرياس المعدية (التنكرز) مؤخرا مرخصة³. وباﻹضافة إلى ذلك، يجري تطوير لقاحات الحمض النووي عدة ضد مسببات أمراض الأسماك.

غالباً ما تحتوي اللقاحات التقليدية على مسببات الأمراض الموهنة المعطل أو حية، أنها تشكل خطرا محتملاً لنقل المرض². لقاحات الحمض النووي، وفي المقابل، تجنب هذا الخطر، حيث أنها تقوم على إدارة بلازميد ترميز مولدات المضادات البكتيرية أو الفيروسية، بدلاً من مسببات المرض كله نفسها^2،4. ويتم إنتاج لقاحات الحمض النووي مع تقنيات جزئ الحمض النووي، الذي يتيح تصميم دقيق من مولدات المضادات اللقاحات وصياغة مرنة من تركيبات مستضد والمواد المساعدة في بناء لقاح واحد⁵. وعلاوة على ذلك، إنتاج لقاحات الحمض النووي أسرع وأسهل وأكثر فعالية من حيث التكلفة مقارنة باللقاحات المؤتلف القائم على البروتين، وميزة كبيرة لمرشح لقاح أغراض الفرز، ولكن أيضا، على سبيل المثال، في حالة تفشي الوباء ².

في الأسماك وطرق الإدارة الأكثر شيوعاً للقاحات الحمض النووي داخل والعضلي، وعن طريق الفم^3،6،،⁷بينما في الثدييات، تحت الجلد وطرق الأدمة هي خيارات إضافية². بعد حقنه عضليا، أدخل والبلازميدات الحمض النووي مقاتلا الخلايا في موقع الإدارة (مثلاً.، معظمهم myocytes، بل أيضا المقيمين تقديم مستضد خلايا [ناقلات الجنود المدرعة]). يمكن زيادة كبيرة في نسبة الخلايا transfected انهانسر^2،8. بعد دخول الخلية، يدخل بعض بلازميد الحمض النووي النواة، التي تكون فيها الجينات المشفرة بواسطة بلازميد يدون². في هذا البروتوكول، فنحن نستخدم بلازميد بكمف-اجفب يحتوي على أحد المروجين في كل مكان قوي الأمثل للتعبير التوكسينات⁹. في هذا البناء، تترجم مولدات المضادات بروتين انصهار مع بروتينات فلورية خضراء. التجارة والنقل يمكن تأكيد تطعيم ناجحة والمنتج الصحيح مستضد بالتصور البسيط للتعبير مستضد مع مجهر الأسفار في الأسماك الحية.

في الثدييات، أظهرت لقاحات الحمض النووي لتحفيز أنواع مختلفة من الاستجابات المناعية اعتماداً على أنواع الخلية transfected^2،5. Transfected myocytes تفرز مولدات المضادات في الفضاء خارج الخلية أو الإفراج عنهم عند موت الخلية، والمستضدات غارقة بناقلات الجنود المدرعة، فيما بعد، وتعرض على histocompatibility الرئيسية المعقدة ثانيا الجزيئات². هذا بتشغيل استجابات الخلايا CD4 وتي CD8، خاصة، بالإضافة إلى الخلية بالردود^2،،من⁵¹⁰. في الأسماك، اللمفاويات T و B، فضلا عن الخلايا الجذعية (DCs)، وقد حددت، حتى الآن على تقسيم العمل في مستضد العرض التقديمي هو أقل تفهماً جيدا¹¹. قد ثبت DCs الزرد، بيد أن حصة المصانة السمات المظهرية والوظيفية مع نظرائهم الثدييات على¹². وعلاوة على ذلك، قد تبين تلقيح الحمض النووي للحصول على الاستجابات المناعية مماثلة في الأسماك والثدييات، بما في ذلك تي وخلية بالردود^6،13،،من^1415،16 .

تستخدم على نطاق واسع كل من اليرقات والكبار الزرد إلى نموذج مختلف الأمراض المعدية، مثل M. marinum الأسماك نموذج عدوى السل المستخدمة في هذا البروتوكول^17،،من^{1819،20 ،،}من²¹²². بالمقارنة مع الكائنات نموذج الثدييات، ومزايا الزرد تشمل حجمها صغير، وإمكانية تكرار نتائج سريعة، وانخفاض الإسكان نفقات²³. تجعل هذه الجوانب الزرد نموذج حيوان مثالي لدراسات الفحص السريري واسعة النطاق للقاحات جديدة والمركبات الصيدلانية^23،،من²⁴²⁵.

في هذا البروتوكول، يصف لنا مستضد لقاح الرواية كيف يمكن تقييم المرشحين ضد ميكوباكتيريوسيس بتلقيح الحمض النووي القائم الزرد الكبار. أولاً، نحن تصف كيف يتم استنساخ المستضدات إلى بلازميد التعبير بكمف-اجفب، تليها بروتوكول مفصل للحقن العضلي والبلازميدات اللقاح وانهانسر اللاحقة في العضلات. التعبير عن كل مستضد ما تؤكده الأسفار مجهرية بوستيمونيزيشن مدة أسبوع واحد. ثم يتم اختبار كفاءة المرشحين مستضد من إصابة تطعيم الأسماك مع M. marinumتجريبيا.

التجارب بما في ذلك الزرد الكبار تتطلب إذن للتجارب الحيوانية التطعيم والدراسات اللاحقة مع نموذج العدوى. تتم الموافقة على جميع الأساليب والتجارب الموضحة هنا بالحيوان تجربة المجلس من فنلندا (اسافي) والدراسات التي تجري وفقا لتوجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63/الاتحاد.

1-استنساخ المستضدات لقاحات الحمض النووي

1. حدد بلازميد تعبير الأمثل للتعبير حقيقية النواة من antigen(s) الفائدة في ظل مروج قوية، التأسيسي، مثل المروج المبكر الفوري الفيروس المضخم للخلايا (CMV). لتمكين التحقق في فيفو التعبير مستضد، حدد بلازميد لقاح الذي يقوم بترميز علامة نيون، مثل بلازميد بكمف-اجفب⁹ المستخدمة في هذا البروتوكول.
2. استخدام الأدوات المستندة إلى ويب و bioinformatic المناسبة لتحديد تسلسل مستضد المناعية الواقية المحتملة (أو عدة سلاسل) حوالي 90-600 nt (30 – 200 ألف)²⁶ من gene(s)-من-الاهتمام بمسببات المرض التي سيتم استخدامها في نموذج العدوى اللاحقة.
3. استخدام البرمجيات المتاحة، أو تصميم كبسولة تفجير لتضخيم الجينات مستضد من الجينوم الممرض واستنساخ sequence(s) مستضد في موقع متعددة الاستنساخ بلازميد التعبير يدوياً. تأكد من الحفاظ على الإطار القراءة الصحيحة عند اختيار antigen.
4. وتشمل كوزاك تسلسل (ككاكك)²⁷ وكودون ابدأ (ATG) في التمهيدي 5 '. للحفاظ على العلامة اجفب ج-الطرفية، تجنب الفاصلة stop codons (العلامة، ﻷعمالهم، TGA) في تسلسل مستضد والتمهيدي 3 '. أيضا، تأكد من أن العلامة التجارة والنقل لا تزال في نفس الإطار القراءة مع مستضد الاهتمام.
5. استخدام الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي المستخرج من مسببات المرض كقالب لتوليد كمية كافية من المنتج بكر مع الإشعال الاستنساخ. ويفضل استخدام بوليميراز الدنا تصحيح التجارب المطبعية للحفاظ على التسلسل الصحيح مستضد.
6. تنقية المنتج بكر والتحقق من الحجم الصحيح للمنتج بالتفريد هلام. والخلاصة، اضطر المنتج بكر مع بلازميد لقاح هضمها.
7. تحويل المزيج ربط الخلايا البكتيرية المختصة وفقا لبروتوكول مناسب. استخدام مجموعة المضادات الحيوية مناسبة للمستعمرات الإيجابية والإنتاج بلازميد في كولاي؛ بلازميد بكمف-اجفب، على سبيل المثال، يحتوي على جينات مقاومة الأمبيسلّين لهذا.
8. استخدام سانغر التسلسل للتأكد من إدراج تسلسل مستضد الصحيح. كبسولة تفجير التالية يمكن أن تستخدم لتسلسل مولدات المضادات في بلازميد بكمف-اجفب: CMV إلى الأمام كجكااتججكجتاجكجتج 5 '-3' وعكس اجفب-N 5 'كجتكجككجتككاجكتكجاككاج-3'.
9. إنتاج وتنقية كمية كافية من تركيبة اللقاح. حل أو الوتي بلازميد في الماء المعقم. تأكد من أن الحمض النووي بلازميد المنتجة عالية الجودة والتركيز هو على الأقل 0.72 ميكرومتر أو 2,000 نانوغرام/ميليلتر.

2-سحب الإبر Microinjection

1. إعداد الإبر microinjection مقدما. استخدام ألومينوسيليكات 10 سم زجاج الشعيرات الدموية. لاحظ أن زجاج البورسليكات الشعيرات الدموية هشة جداً للحقن الأسماك الكبار.
2. سحب الإبر مع جهاز ميكروبيبيتي-إبرة-تلفيق.
   ملاحظة: ينبغي أن ننظر الإبر مماثلة لتلك المعروضة في الشكل 1. مع الجهاز المستخدم في هذا البروتوكول (جدول المواد)، تؤدي الإعدادات التالية في هذا النوع المطلوب من الإبر:
   1. تعيين الزجاج الشعرية في الخامس-الاخدود في شريط ساحبة وتشديد مقبض لقط طفيفة.
   2. نقل صاحب جوار الشعيرة وادفع برفق الشعرية من خلال الشعيرة في شريط ساحبة على الجانب الآخر من الشعيرة. تجنب لمس الشعيرة مع شعري.
   3. تشديد المقابض لقط وتعيين أسفل الزجاج السلامة، واضغط على زر سحب.
      تنبيه: الشعيرة حار.
3. مكان الإبر على قطعة من مادة لاصقة قابلة لإعادة الاستخدام داخل لوحة طبق بيتري 15 سم لحماية نصائح الإبرة. يبقى الطبق المشمولة بإبقاء الإبر النظيفة.

3-ملء الإبر ميكروبيبيتي

1. إعداد مزيج اللقاحات. استخدام 0.5 – 12 ميكروغرام من بلازميد كل جرعة. إذا كان الجمع بين والبلازميدات مختلفة عدة في مزيج التطعيم واحد، استخدم تركيز الحمض النووي مجموع الحد أقصى من 12 ميكروغرام كل الأسماك.
2. حساب حجم اللقاح "مزيج الرئيسي" وفقا لعدد الأسماك في كل مجموعة (انظر أدناه). أضف 1 ميليلتر من الفينول الأحمر العقيمة التي تمت تصفيتها لكل جرعة الحقن لتخفيف كل شغل الإبر الشعرية ومراقبة الحقن. أضف 1 العقيمة x برنامج تلفزيوني يصل إلى إجمالي الحد أقصى من 5 – 7 ميليلتر في حقنه واحدة الجرعة⁸.
   ملاحظة: يمكن أن يسفر عن تسرب عرضي للحل حقن حقن كميات أعلى من 7 ميليلتر وينبغي، لذلك، تجنب.
3. ضع قطعة من الشريط، الجانب الغراء، على صاحب مناسبة، على سبيل المثال، أن الجانب مربع تلميح فارغ. إرفاق الإبر الشعرية بلطف إلى الشريط.
4. بيبيت كحد أقصى 7 ميليلتر من مزيج اللقاحات على قطعة من الفيلم المختبر. استخدام تلميح تحميل، نقل اللقاح من الفيلم إلى الإبرة. بيبيت ببطء وبعناية، تجنب فقاعات الهواء بيبيتينج في الإبرة.
5. واسمحوا الإبر تسوية لمدة 15-30 دقيقة لإزالة فقاعات الهواء الصغيرة المتبقية الممكنة.

4-وضع ميكروينجيكتور واليكتروبوراتور للتحصين

1. تعيين ميكرومانيبولاتور ومصدر ضوء في الموضع الصحيح. قم بالتبديل الصنبور ضغط الهواء إلى الوضع المفتوح.
2. ضبط معلمات هوائي مضخة كما يلي (انظر الشكل 2).
   1. تعيين مقبض تنفيس على منفذ إخراج إجراء لمنع ردمها الماصة بعمل شعري. مجموعة أنابيب من منفذ الإخراج إلى ميكروبيبيتي. لا تستخدم المنفذ الفراغ في هذا البروتوكول.
   2. ضبط طول النبضة: استخدام وضع في الوقت المناسب، حيث يتحكم جهاز توقيت إلكتروني مدة الوقت ضغط الملف اللولبي يبقى مفتوحاً. تحقق من أن يضيء المصباح الأخضر إلى جانب قياس الضغط الإخراج عندما يتم فتح الملف اللولبي الضغط (تنشيط).
   3. تعيين نبض النطاق إلى 10 ق؛ باستخدام هذا الإعداد، النبضات قد يكون كذلك تعيين من 100 مللي ثانية إلى 10.1 استخدام س. في الفترة 10-بدوره الطلب للضبط الدقيق لطول النبضة – كل بدوره للاتصال الهاتفي هو 1.0 s. إذا لزم الأمر، وهذا يمكن تعديلها أيضا خلال حقنه.
   4. استخدام البادئ النبض ("زر التشغيل") على اللوحة الأمامية لمضخة تعمل بالهواء المضغوط، أو بعيد القدم التبديل (مستحسن). وهذا متصل باللوحة الأمامية لمضخة تعمل بالهواء المضغوط.
3. تعيين الإبرة على صاحب ميكروبيبيتي ميكرومانيبولاتور. قص غيض الإبرة مع الملقط حتى أن السائل يمكن أن يدفع، واستخدام المجهر لعرض الموقف الصحيح. اضغط القدم رمز التبديل مرة واحدة لترى أن نبض 1-s يدفع قطرات صغيرة من الإبرة.
4. استخدم الإعدادات التالية اليكتروبوراتور: الجهد = 40 الخامس؛ نبض طول = 50 مللي ثانية، عدد النبضات = 6. الاتصال الملاقط اليكتروبوراتور. نرى أن الجهد الفعلي وطول النبضة سيظهر على الشاشة لا تختلف كثيرا من الإعدادات.

5-حقن من لقاح الحمض النووي وانهانسر

1. للتحصين وفقا لهذا البروتوكول، الاستخدام السليم، 6 إلى 12 شهرا الزرد الكبار. الحفاظ على الأسماك في التدفق من خلال نظام مع دورة ضوء/الظلام ح 14/10، بحد أقصى سبعة الأسماك كل 1 لتر الماء.
2. إعداد 0.02% 3-امينوبنزويك إيثيل حمض إستر (تريكيني) حل (pH 7) في خزان المياه ل الأسماك²⁸أنيسثيتيزينج. استخدام طبق بيتري 10 سم أو شيئا من هذا القبيل.
3. إعداد خزان انتعاش عن طريق ملء كوب ل 5 مع 3 لتر مياه النظيفة النظام.
4. إعداد تطعيم حشوة للحفاظ على الأسماك في وضع ثابت أثناء التلقيح. تأخذ قطعة 5 × 7 سم² من 2 إلى 3 سم سميكة الأسفنج. يقتطع أخدود الأسفنج مع شفرة مشرط أو مقص حاد.
   ملاحظة: يمكن استخدام الحشو التطعيم نفسه في تجارب متعددة. تطهير الأسفنج بين التجارب التي نقع عليه في الكحول الاثيلي 70% والسماح لتجف.
5. دقة نقع الأسفنج في الماء النظام وتعيين الأسفنج على طبق بيتري.
6. سريع الأسماك 24 ساعة قبل التلقيح.
7. تخدير الزرد واحد بوضعه على طبق بتري يحتوي على تريكايني 0.02 في المائة. الانتظار حتى الأسماك لا يستجيب للمس التحفيز وحتى يكون هناك لا حركة الخياشيم. تخدير سمكة واحدة في وقت واحد.
8. باستخدام ملعقة بلاستيكية، نقل الزرد أنيسثيتيزيد على اسفنجة مبللة وتعيين الجانب البطني السمك إلى أسفل في الاخدود. في الموضع الصحيح، ضمان أن الرأس ومعظم جسم الأسماك داخل الاخدود وزعنفه ظهرية والذيل جاحظ الخروج من groove.
9. تحت المجهر، بعناية وضع الإبرة في حوالي 45 درجة زاوية قريبة من العضلات الظهرية الزرد، استخدام المحور س والمحور ص صقل العجلات في ميكرومانيبولاتور.
10. العثور على بقعة صغيرة دون جداول أمام الزعنفة الظهرية، حيث دفع الإبرة لا تتطلب القوة. إذا كان هناك شعور المقاومة، حاول بقعة المتاخمة. تجنب إصابة العمود الفقري أو زعنفة ظهرية أو الجداول.
    ملاحظة: إذا كانت الإبرة الانحناءات بينما يدفع، تقصير الإبرة قليلاً بقطع عليه.
11. استخدم رمز التبديل سيرا على الأقدام لحقن تدريجيا حل اللقاح في العضلات. مراقبة الحقن من خلال المجهر: الفينول الأحمر مرئياً لأنه يدخل في أنسجة العضلات. ضبط مدة النبض إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، استخدم زر البادئ نبض على اللوحة الأمامية من مضخة هوائية للحقن. ومع ذلك، يسمح استخدام مفتاح تبديل القدم البعيد استعمال اليد الأخرى لضبط طول النبضة بعجلة الطلب 10-دورة. تجنب الحقن في حل سريع جداً، إذ قد يؤدي ذلك إلى تلف الأنسجة المفرط. تأكد من عدم حقن أي الهواء.
12. اليكتروبوراتي الأسماك مباشرة بعد الحقن. تأكد من أن السمك لا تزال تحت التخدير. الحفاظ على الأسماك في الأسفنج والأسماك بين أقطاب الملاقط من نوع، حيث أن الأقطاب الموجودة على كل جانب من موقع الحقن. لا تضغط الملقط الكهربائي ضيقة جداً ولكن تبقى كل أقطاب على اتصال بالأسماك.
    1. اضغط على زر ابدأ في اليكتروبوراتور لإعطاء 40 ستة الخامس، البقول 50 مللي ثانية.
    2. بلطف بنقل الأسماك إلى خزان الانتعاش.
    3. تنظيف أقطاب كهربائية بعد كل انهانسر بالضرب لهم مع الإيثانول 70%.
       ملاحظة: بعناية رصد رفاه الأسماك بعد التلقيح. Euthanize الأسماك أي دلائل على عدم الراحة (انتعاشا بطيئا من التخدير، الشاذة السباحة، ويلهث) في تريكيني 0.04 في المائة. بعد الانتعاش، ونقل الأسماك إلى الوحدة من خلال تدفق وإطعام عادة.

6-التصور والتصوير للتعبير مستضد

1. تخدير الأسماك في تريكيني 0.02% 2-7 أيام بعد التطعيم، واستخدام الأشعة فوق البنفسجية-ضوء لمشاهدة التعبير اجفب قرب موقع الحقن.
   ملاحظة: الفحص البصري تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية هي عملية سهلة وغير الغازية التي مناسبة للتحقق الروتينية للتطعيم الناجحة، كما في تجارب على نطاق واسع. وإذا لزم أي صور من الأسماك، يمكن أيضا إجراء هذه الخطوة في أحواض الأسماك العادية دون الحاجة إلى تخدير أو نقل الأسماك.
2. لالتقاط الصور، استخدام مجهر الأسفار لتصور التعبير اجفب في موقع الحقن⁸. استخدام عدسة هدف X 2 وقم بتحديد عامل التصفية الصحيح لتصور الأسفار أو آراء الضوء المرئي.
3. الحفاظ على الأسماك أنيسثيتيزيد لا يزال بضغط ventral fin برفق مع ملاقط نحو قاع طبق بيتري. التقاط صور المجهر الضوء والأسفار من نفس المنطقة.
4. دمج الصور مجهر الضوء والأسفار باستخدام البرمجيات المناسبة²⁹. إضافة شريط مقياس.

7-التحديد الكمي لمستوى التعبير وحجم المستضدات

1. Euthanize الأسماك في تريكيني 0.04 في المائة. تشريح جزء الفلورسنت للعضلات الظهرية بدون مشرط وملاقط تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. استخراج البروتينات من عينات⁸.
2. تحقق من حجم الصحيح في فيفو-إنتاج البروتينات بتحليل لطخة غربية، استخدام الفجل البيروكسيديز (HRP)-مترافق بروتينات فلورية خضراء جسم (أو ما شابه)⁸. تضمين عنصر تحكم سلبية (المطعمين الأسماك) باستبعاد أي إشارات خلفية وملزمة غير محدد، جنبا إلى جنب مع عنصر تحكم الإعراب عن اجفب دون مستضد تنصهر فيها.
   ملاحظة: لتحليل لطخة غربية، الحجم المتوقع (في كاتشين) من البروتينات مستضد-الانصهار يمكن حساب، على سبيل المثال، بالمعادلة:
   الوزن الجزيئي (ميغاواط) دسدنا = (عدد النيوكليوتيدات x 607.4) + 157.9؛ أو باستخدام الأدوات المستندة إلى ويب.
3. التحديد الكمي للتعبير عن كل مستضد استخدام بروتينات فلورية خضراء-أليسا⁸ (اختياري).

8-الجمع بين "بروتوكول التطعيم" مع "نموذج العدوى" مارينوم م.

1. تحديد حجم المجموعة المطلوبة لتحديد فعالية مرشح لقاح الرواية في نموذج العدوى والمقايسة المستخدمة يمكن الاعتماد عليها (انظر، على سبيل المثال، ميليماكي et al. ²⁴ وتشاران وكانثاريا³⁰). القيام بحسابات الطاقة المناسبة أثناء التخطيط للتجارب.
2. لتقييم فعالية لقاح المرشحين، تصيب بوستيمونيزيشن 5 أسابيع الأسماك. استخدام عدوى داخل مع الوحدات المكونة للمستعمرة حوالي 30 (زيمبابوي) من M. marinum، الأمر الذي يؤدي إلى عدوى كامنة في معظم الأسماك^8،،من²⁰³¹.
   ملاحظة: عند استخدام M. marinum، اتباع بروتوكول سلامة BSL2. إعداد البكتيريا أو الفيروسات يعتمد على مسببات المرض.
3. التحديد الكمي للعدد من العوامل الممرضة في كل الأسماك. Euthanize بوستينفيكتيون 4 أسابيع الأسماك وتحديد عبء البكتيرية في كل الأسماك من الحمض النووي المستخرج مع قبكر باستخدام محدد كبسولة تفجير ل . م. مارينوم^20،24.
   ملاحظة: تأكد من تضمين مجموعة عنصر تحكم مناسب واستخدام الأساليب الإحصائية الصحيحة لتحليل النتائج. وبصفة عامة، مجموعة من الأسماك تحصين مع بلازميد فارغة بكمف-اجفب عنصر تحكم سلبية مناسبة.
4. وتؤكد النتائج الإيجابية مع المستضدات دون علامة التجارة والنقل. استنساخ المستضدات كما هو موضح في الخطوة 1 وكرر التجربة التطعيم.

الخطوات المتبعة في البروتوكول تلقيح الحمض النووي من الزرد الكبار موضحة في الشكل 3. في البداية، يتم استنساخ في تسلسل مستضد المحدد إلى بلازميد بكمف-اجفب وبلازميد الحمض النووي يتم إنتاجه وتنقيته²⁴ (الشكل 3). ثم يتم حقن اللقاحات المرشحين عضليا مع ميكروينجيكتور وهو موقع الحقن اليكتروبوراتيد لتحسين مدخول بلازميد داخل الخلايا (الشكل 3). وكان الأمثل جرعة تطعيم المستخدمة بكميات مختلفة من بلازميد بكمف-اجفب بالحقن وقياس التعبير بروتينات فلورية خضراء مع أليسا (الملحق الرقم 1). اثنين لمدة سبعة أيام بوستفاكسينيشن، التعبير عن البروتين الانصهار يتم الكشف عنها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية وتصور مع الأسفار مجهرية (رقم 3 و رقم 4). قد تختلف مستويات التعبير من مولدات مختلفة جداً مكثفة (مستضد 1) إلى تعبير خافت (الشكل 4). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن ملاحظة التعبير التجارة والنقل عبر العضلات الظهرية (مستضد 1)، أو في منطقة محدودة أكثر (مستضد 2) (الشكل 4). ومع ذلك، إذا تم الكشف عن لا الأسفار في غضون عشرة أيام، من المستحسن للتأكد من أنه لا توجد أية أخطاء في تصميم مستضد الاستنساخ أو التمهيدي. لتأكيد أن البروتين الانصهار المعرب عنها بالحجم الصحيح، يمكن استخراجه من الأنسجة العضلية حول مكان الحقن البروتينات وتستخدم لتحليل لطخة غربية.

يتم تقييم تأثير المرشحين اللقاح بتحدي السمك مع جرعة منخفضة من M. marinum بحقنه داخل (الشكل 5). بوستينفيكشن أربعة وخمسة أسابيع، التهم البكتيرية مصممون مع قبكر ومقارنة أحمال البكتيرية في السيطرة على المجموعة (الشكل 5). وعلاوة على ذلك، يمكن اختبار فعالية المرشحين اللقاحات الواعدة أكثر من غيرها بالرصد البقاء على قيد الحياة بعد جرعة عالية العدوى مارينوم م. (الرقم 5). ولكن بالإضافة إلى إعطاء نتيجة كمية في تطور العدوى، بدلاً من مجرد حالة حيا أو ميتا، التحديد الكمي على أساس qPCR زيمبابوي يتطلب وقتاً أقل وأصغر مجموعة أحجام وهو، لذلك، اتباع نهج أكثر أخلاقية للابتدائي الشاشة. وعموما، هذا البروتوكول يسهل فحص فعالية لقاح الرواية مولدات المضادات في غضون 12 أسبوعا (الشكل 5).

الشكل 1: عن قرب (12 س) ألومينوسيليكات الإبر المستخدمة في الحقن داخل العضلات الزرد الكبار- تلميح أدناه فقد تم خفض مع ملاقط وجاهزة للاستخدام ميكروينجيكتيونس. وهذا الرقم تم تكييف من أوكسانين³⁵. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: Microinjection المعدات والإنشاء- يتم تمييز المكونات الرئيسية للمعدات اللازمة لتلقيح الحمض النووي الزرد الكبار بخط غامق. وترد التعديلات الهامة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: إعداد والبلازميدات لقاح الحمض النووي وإجراءات التحصين. يتم استنساخ المستضدات (1) المحددة المتاخمة للعلامة التجارة والنقل في بلازميد بكمف-اجفب. بناء (2) اللقاح أنتج مجهريا، وتتركز، وتنقيته. ميكروغرام (3) 12 من بلازميد يحقن في العضلات الظهرية من الزرد الكبار أنيسثيتيزيد مع ميكروينجيكتور، والحقن في وقت لاحق اليكتروبوراتيد مع ستة 40-V، 50--مرض التصلب العصبي المتعدد البقول. (4) بوستفاكسينيشن يومين إلى سبعة أيام، تعبير بروتينات فلورية خضراء من البروتين الانصهار مستضد-التجارة والنقل هو تصور مع مجهر الأسفار. (5) فلوري جزء من العضلات الظهرية يمكن تشريح وتستخدم لاستخراج البروتين. ويؤكد حجم البروتين الانصهار مع إجراء تحليل لطخة غربية ومستوى التعبير مع بروتينات فلورية خضراء-أليسا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4: تصور التعبير عن البروتين الانصهار مستضد-اجفب- يتم تطعيم تخديره الزرد الكبار مع 12 ميكروغرام لقاحاً تجريبيا المستضدات (مستضد 1 – 3) والحقن هو اليكتروبوراتيد، وفي وقت لاحق، مع ستة 40 الخامس، البقول 50 مللي ثانية. اثنين لمدة سبعة أيام بوستفاكسينيشن، موقع الحقن يتم تصويرها مجهر. أولاً، يتم الكشف عن التعبير عن التجارة والنقل تحت مجهر الأسفار. ويتم تفتيش المنطقة استخدام هدفا حجم X 2 وتصويرها وحفظها في شكل.tiff. يتم دمج صورة مجهر الضوء بنفس المنطقة مع الصورة الفلورية باستخدام البرمجيات إيماجيج. قد تختلف كمية وموقف التعبير مستضد بين المستضدات والأسماك الفردية. على سبيل المثال، التعبير عن مستضد 1 الملاحظ عبر العضلات الظهرية والتعبير عن مستضد 2 يعتبر بقع صغيرة، في حين مستضد 3 بقوة بمنطقة محدودة أكثر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 5: اختبار فعالية المرشحين لقاح ضد مرض المتفطرات. (1) بالغ الزرد يلقح مع لقاحات الحمض النووي التجريبي ضد ميكوباكتيريوسيس. (2) خمسة أسابيع بوستفاكسينيشن، يصاب السمك مع جرعة منخفضة من بكتريا مارينوم (~ 30 زيمبابوي). تشريح الأجهزة (3) أربعة أسابيع في وقت لاحق، الداخلية وتستخدم لاستخراج الحمض النووي. (4) العد البكتيري في كل الأسماك هو كمياً باستخدام مارينوم م.قبكر--الإشعال محددة. وكان التحصين مع مستضد 1 أدت إلى انخفاض كبير في التهم البكتيرية (ف < 0.01، ANOVA ثنائي الاتجاه)، بينما المستضدات 2 و 3 أي تأثير. كذلك يتم تقييم تأثير (5) الحماية المرشح اللقاحات الواعدة (مستضد 1) في تجربة البقاء على قيد الحياة، حيث يصاب السمك بجرعة عالية (~ 10,000 زيمبابوي) من البكتيريا ويتم رصد البقاء على قيد الحياة لمدة 12 أسبوعا. لاحظ تمشيا مع الانخفاض في عبء البكتيرية في لوحة 4، التطعيم مع مستضد 1 أيضا تحسين بقاء الأسماك على عدوى M. marinum (ف < 0.01)، مما يوحي بهذا المستضد يمكن أن تكون مبشرة بالخير مرشح عن لقاح جديد ضد السل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

التكميلية الرقم 1: مقدار بلازميد الحمض النووي يؤثر على التعبير اجفب المستمدة من بلازميد في الزرد الكبار- مجموعات من الأسماك (n = 5 في كل مجموعة) تم حقن 0.5 – 20 ميكروغرام من بكمف-اجفب، وكان يستخدم انهانسر (ست نبضات من 50 الخامس) لتعزيز تعداء. تم حقن الأسماك التحكم (CTRL) مع 2 ميكروغرام من بلازميد بكمف فارغ لا يحتوي على الجينات اجفب. بروتينات فلورية خضراء-أليسا كان يؤديها 3 أيام بوستينجيكشن تعريف تعبير اجفب النسبية في هوموجيناتيس السمكية. فالقيم: *ف < 0.03، * *ف < 0.004. أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية. NS = ليس كبيرا. وهذا الرقم تم تكييف من أوكسانين³⁵. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الداخلي لتحصين الزرد الكبار مع لقاحات الحمض النووي القائم يتطلب بعض الخبرة التقنية. وحتى بالنسبة باحث ذوي خبرة، تطعيم سمكة واحدة يأخذ حوالي 3 دقيقة، باستثناء الأعمال التحضيرية. وهكذا، يمكن تحصين كحد أقصى أسماك ما يقرب من 100 خلال يوم واحد. إذا كانت الأسماك أكثر من 100 مطلوبة للتجربة، يمكن تقسيم التحصينات بين مدة تصل إلى 3 أيام. بالإضافة إلى نوعية التجربة، التدريب الكافي من researcher(s) لمناولة الأسماك والقيام التحصين أساسي لرفاه الأسماك. تأكد من اتباع قواعد الرعاية القانونية والحيوانات المحلية والمبادئ التوجيهية عندما يتعلق الأمر إلى السكن في الأسماك، والتخطيط التجارب، والمؤهلات المطلوبة للعاملين الذين يقومون بالتجارب.

وباختصار، هناك العديد من الخطوات الحاسمة لتجنب التعقيدات في البروتوكول التحصين. لتحصين ناجحة، التأكد من أن 1) الأسماك تحصين سليمة وكافية في العمر والحجم (يمكن أن تتطلب تحصين أكثر الأسماك أسفل تحجيم حجم اللقاحات وإعدادات انهانسر)؛ 2) الأسماك يتم تخديره بشكل صحيح مع عدم وجود أقوى من 0.02% 3-امينوبنزويك إيثيل حمض إستر، وأنها لا تزال أنيسثيتيزيد طوال الإجراءات بأكملها (التخدير ينبغي أن تظل قصيرة قدر الإمكان ضمان استرداد الأسماك)؛ 3) وسادة الأسفنج يتم استيعابه بشكل صحيح؛ 4) يتم حقن السائل في كل نبض من مضخة تعمل بالهواء المضغوط، وإذا لم يكن كذلك، يتم ضبط طول النبضة (سحب الإبرة إلى الوراء قليلاً على طول المحور الصادي يمكن أن تساعد)؛ 5) هناك لا فقاعات الهواء مع حل اللقاح؛ 6) الإعدادات انهانسر والجهد نبض الفعلية وطول الصحيحة؛ 7) الأقطاب لا تسبب تلف الجلد على الموقع انهانسر (خلال انهانسر، إبقاء أقطاب كهربائية في لطيف الاتصال مع السمك، والإفراج عن الأسماك فورا إلى الخزان الانتعاش بعد انهانسر).

من المهم رصد الأسماك بعد انهانسر في خزان الانتعاش وأن euthanize الأسماك أي دلائل على عدم الراحة. وعلاوة على ذلك، من الضروري لممارسة هذا الإجراء قبل بدء إجراء تجربة على نطاق واسع، لضمان سير عمل بطلاقة. إذا كان ذلك ممكناً، أطلب من زميل مدربين بما فيه الكفاية للمساعدة في ملء الإبر وانهانسر.

طريقة تلقيح الحمض النووي يتيح تصميم مصممة خصيصا لمولدات المضادات اللقاحات. من الممكن استنساخ مستضد كله، أو يفضل، تحديد أجزاء من مستضد استناداً إلى الترجمة والاستمناع الخلوية²⁴. وبالإضافة إلى ذلك، يتيح الأسلوب الجمع بين عدة مولدات المضادات أو المواد المساعدة في بناء لقاح واحد أو الحقن عدة والبلازميدات منفصلة في نفس الوقت². بما في ذلك كودون توقف بعد تسلسل مستضد أو نسق الجين اجفب من بلازميد، أنه من الممكن استخدام ناقلات بلازميد نفسه أيضا التعبير عن المستضد دون علامة التجارة والنقل الطرفي ن اللاحقة. وهذا قد يكون من المعقول في تأكيد نتائج الفحص إيجابية، الحجم الكبير نسبيا للتجارة والنقل يمكن أن تؤثر على طي antigen، وهكذا، تقييد استجابات خلطيه يحتمل أن أثارت قبل التلقيح.

ارتبط تعبير مستضد أعلى للحمض النووي لقاح الاستمناع². انهانسر بعد الحقن، وبالتالي، قد أدرج في هذا البروتوكول، كما أنه ثبت لزيادة التعبير عن المستضدات أو الجينات مراسل من أربعة إضعاف إلى عشرة إضعاف في الزرد³². وعلاوة على ذلك، انهانسر كأسلوب يسبب إصابة نسيج معتدلة، مما حمل التهاب المحلية التي تشجع زيادة الاستجابات المناعية الناجمة عن اللقاحات². من ناحية أخرى، انهانسر عموما جيد التحمل. عمليا مع المعدات المستخدمة هنا، سوف استرداد 100% الزرد الكبار جيدا من البقول ست من 40 الخامس المستخدمة في هذا البروتوكول³⁵.

بالإضافة إلى استخدام انهانسر لتعزيز دخول بلازميد اللقاح في الخلايا، نستخدم مروج في كل مكان قوي في بلازميد اللقاح وذيل بوليا في نهاية 3 ' antigen لتحسين التعبير مستضد في خلايا الأسماك ترانسفيكتيد. وفي بعض الحالات، إذا كان استخدام كودون الممرض الهدف يختلف إلى حد كبير الأنواع الملقحين، التحسين كودون قد وجد مفيدة في زيادة التعبير الجيني الهدف². في هذا الزرد-النموذجM. marinum ، بيد كودون الأمثل ليس أثر كبير على مستويات التعبير من اثنين من الجينات نموذج المتفطرات، ESAT-6 و 10-الحراجية المعتمدة، و، وبالتالي، كانت تعتبر غير ضرورية في هذا النموذج³⁵ .

التشكيلات الجانبية لتعبير الجينات المستهدفة لديها بعض التغير الزمني بين مولدات المضادات، تبعاً، على سبيل المثال، الحجم وهيكل مولدات المضادات في السؤال. ومع ذلك، التعبير مستضد يشبه عادة ضمن مجموعة من الأسماك تحصينهم باللقاح نفسه. بشكل عام، يلاحظ التعبير اجفب ألمع أربعة أيام إلى أسبوع واحد بوستفاكسينيشن، ولكن مقياس من 2 – 10 أيام ممكن. من المستحسن التحقق من صحة التعبير عن كل البروتين الانصهار مستضد اجفب في مجموعة صغيرة من الأسماك (2-3) قبل بما في ذلك antigen في تجربة واسعة النطاق. إذا لوحظ أي تعبير بروتينات فلورية خضراء في أي نقطة 2 – 10 أيام بعد التطعيم، تأكد من أن 1) البروتوكول التحصين وأعقب بعناية. دائماً مجموعة من الأسماك تحصين مع بلازميد اجفب بكمف الفارغة كعنصر إيجابي وتأكد من أن 2) تصميم مستضد والاستنساخ الجزيئي وقد نفذت بشكل صحيح (التصميم التمهيدي الملائم؛ والمستضد والعلامة اجفب على حد سواء في نفس إطار القراءة ولا codons وقف التدخل مدرجة). وفي بعض الحالات، على الرغم من تصميم مستضد الصحيحة، لا يمكن الكشف عن التجارة والنقل. قد يكون هذا نتيجة غير صحيحة قابلة للطي أو انهيار سريع للبروتين الانصهار. وفي هذه الظروف، قد يكون من الضروري على إعادة تصميم antigen.

في اللقاحات المستخدمة في تحصين الأسماك المستزرعة، هو بلازميد الجرعة المستخدمة عادة 1 ميكروغرام أو أقل^7،،من³³³⁴. في الزرد، يمكن أيضا اكتشاف الجينات مراسل بعد حقن بلازميد 0.5 ميكروغرام على الأقل عقب انهانسر؛ ومع ذلك، التعبير الجيني الهدف النسبي زيادة كبيرة بكمية أعلى من بلازميد كل الأسماك (تكميلية الشكل 1). في الأسماك حقن مع بلازميد مراسل بكمف-اجفب، أدى حقنه مع 5-20 ميكروغرام من بلازميد أربعة إلى ثمانية إضعاف اجفب أعلى المستويات مقارنة بالأسماك حقن 0.5 ميكروغرام. ولذلك، ضمان تعبير جين المستهدف عالية بما يكفي، ولكن لديها وحدات الحقن التي هي صغيرة بما يكفي (دي سيفن ميليلتر) لمنع أي ضرر الأنسجة الزائدة أو تسرب اللقاح، اخترنا لاستخدام 5 إلى 12 ميكروغرام كل الأسماك لأغراض الفرز الأولى. بالإضافة إلى لقاح الاستمناع، عالية ما يكفي التعبير الجيني المستهدف مطلوب للكشف عن الجينات مراسل مع مجهر الأسفار ولطخة غربية، وهو ضروري لأغراض تأكيد الصحيحة في فيفو الفرز ترجمة مستضد المستهدفة. ولكن بلازميد أقل جرعات (0.5 – 1 ميكروغرام) يمكن أن تكون مفيدة لأنواع أخرى من الاستخدامات التجريبية.

وفي الختام، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحصين الزرد الكبار مع بلازميد الحمض النووي في الاختبار السريري المرشحين رواية لقاح ضد الالتهابات البكتيرية أو الفيروسية المختلفة. يتيح التعبير عن مستضد لقاح بروتين بروتينات فلورية خضراء-انصهار التصور من تعبير الحدث ومستضد التحصين الناجح. نقوم بتطبيق هذا الأسلوب للفحص السريري للمرشحين مستضد لقاح جديد ضد السل. لهذا، نحن تصيب بوستفاكسينيشن خمسة أسابيع الزرد وتحديد التهم البكتيريا في كل الأسماك مع قبكر^،من²⁰²⁴.

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

الكتاب ممتنون لأعضاء الفريق المعني ببحوث تجريبية في علم المناعة، وخاصة إلى ماكينن لينا وبيبو هانالينا، لكل عمل قاموا به في تطوير وتحسين بروتوكول التطعيم، ومساعدتهم في التجارب الفعلية استخدام البروتوكول.

هذا العمل وأيده جا جين آتوس أركون Säätiö (مؤسسة أركو آتوس؛ وجين لمحمد)، سيغريد Juséliuksen Säätiö (سيغريد جوسيليوس مؤسسة؛ لمحمد)، "تمويل البحوث الدولة التنافسية" لمنطقة "مسؤولية الخبراء" من جامعة تامبيري مستشفى (لمحمد)، Tuberkuloosisäätiö تامبيرين (مؤسسة السل تامبيري؛ وإلى محمد، صاحب الجلالة، ورائد)، كولتووريراهاستو سومن (المؤسسة الثقافية الفنلندية؛ لصاحب الجلالة)، سومن توبيركولوسين فاستوستاميسيهديستيكسين Säätiö (المضادة للسل الفنلندية مؤسسة؛ لصاحب الجلالة)، جا فاينو كيفين لاينا säätiö (فاينو ولاينا مفعوله مؤسسة؛ لرائد) و "مؤسسة العلوم مدينة تامبير" (لرائد).