الأجسام المضادة ملزم خصوصية لكابا (Vκ) ضوء الإنسان (الغلوبولين المناعي) الأجسام المضادة التي تحتوي على سلسلة: Polysialic حمض (PSA) المرفقة لNCAM كدراسة حالة

We present a protocol to identify protein moieties containing antigens for human and mouse IgM antibodies with specific kappa (Vκ) light chains. This protocol is not limited to IgM class antibodies but applies to all immunoglobulin isotypes that target their antigen with sufficiently high affinity during immunoprecipitations.

Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents in standard laboratory techniques. In contrast, several human IgMs demonstrated proof of efficacy in cancer models and models of CNS disorders including multiple sclerosis (MS) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Reasons for their lack of consideration include difficulties to express, purify and stabilize IgM antibodies, challenge to identify (non-protein) antigens, low affinity binding and fundamental knowledge gaps in carbohydrate and lipid research.

This manuscript uses HIgM12 as an example to provide a detailed protocol to detect antigens by Western blotting, immunoprecipitations and immunocytochemistry. HIgM12 targets polysialic acid (PSA) attached to the neural cell adhesion molecule (NCAM). Early postnatal mouse brain tissue from wild type (WT) and NCAM knockout (KO) mice lacking the three major central nervous system (CNS) splice variants NCAM180, 140 and 120 was used to evaluate the importance of NCAM for binding to HIgM12. Further enzymatic digestion of CNS tissue and cultured CNS cells using endoneuraminidases led us to identify PSA as the specific binding epitope for HIgM12.

الأجسام المضادة للنمط إسوي الغلوبولين المناعي تظهر إمكانات علاجية كبيرة لعلاج الأمراض المختلفة ومنها السرطان واضطرابات الجهاز العصبي المركزي ^1-7. وحددت المجموعة Vollmers "العديد من الأجسام المضادة في مرضى السرطان لاستخدامها المحتمل والمؤشرات الحيوية للورم معين أو العلاجات الفعالة التي هي قادرة على قتل الخلايا السرطانية عن طريق حفز مسارات أفكارك ^4،8،9. ومن المثير للاهتمام، كل الأجسام المضادة التي تم تحديدها مع الإمكانات العلاجية هي من نمط إسوي الغلوبولين المناعي وتنتمي إلى مجموعة "الأجسام المضادة الطبيعية" (يعتقل).

وبالمثل، حددت مجموعة رودريجيز الماوس والأجسام المضادة البشرية التي تحفز عودة الميالين في آفات الحبل الشوكي عديمة الميلين مزمن في نماذج من التصلب المتعدد (MS). متطابقة إلى الأجسام المضادة مع تأثيرات مضادة للسرطان، عن الأجسام المضادة تشجيع عودة الميالين ويعتقل ومن نمط إسوي الغلوبولين المناعي ^1،6،7،10. المستضدات دقيقة لIgMs الأكثر تحديدها لا تزال undetermineد-بما في ذلك تشجيع عودة الميالين الأجسام المضادة البشرية rHIgM22، حاليا في المرحلة الأولى من التجارب السريرية لمرضى التصلب المتعدد ^11. وعلى الرغم من الجهود المتكررة من قبل خبراء في مجال الدهن والكربوهيدرات البحوث سواء في الأوساط الأكاديمية وبالشراكة مع الصناعة ^11، يحاول التعرف لم تكن مستضد rHIgM22 الناجح. فشل التقنيات القياسية المستخدمة لتحديد المستضدات من الأجسام المضادة للعمل مع الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي يحدد حاجة ماسة لتحسين أساليب محددة لهذه الأجسام المضادة التي على الأرجح الكربوهيدرات الهدف أو الدهون المستضدات.

ويركز هذا المخطوط هو الإنسان الأجسام المضادة التجديدي HIgM12 والإجراءات التجريبية المستخدمة لتحديد المستضد لها. وقد تم تحديد الأجسام المضادة HIgM12 من المرضى الذين يعانون من مرض فالدنشتروم، ويحفز محوار ثمرة في المختبر ^12-14 ويستهدف حمض polysialic (PSA) تعلق على العصبية جزيء التصاق الخلية (PSA-NCAM) ^15،16. HIgM12 يمتد عمرا في نموذج الفأر من المرض ¹⁷ ويحسن نتائج وظيفية في فيروس التهاب الدماغ والنخاع الفئران تايلر (TMEV) الفئران -infected. على وجه التحديد، HIgM12 يحفز النشاط الحركي الأفقي والرأسي التلقائي في الفئران ويزيد عديمة الميلين مزمنة أعداد قطر الصغيرة والمتوسطة محاور الحبل الشوكي ثمانية أسابيع بعد واحد، وجرعة منخفضة من داخل الصفاق حقن الأجسام المضادة ^18.

والعصبي جزيء التصاق الخلية (NCAM) هو بروتين سكري من الغلوبولين المناعي (IG) أعرب الفصيلة على سطح الخلايا العصبية، الدبقية، الهيكل العظمي والعضلات، وخلايا القاتل الطبيعي ^19-25. والإسوية NCAM الرئيسية الثلاثة يسمى NCAM180، NCAM140، وNCAM120، هي المتغيرات لصق بديلة للنسخة الأولية التي تختلف فقط في المجال الخاص بها حشوية. داخل الجهاز العصبي المركزي، NCAM هو جزيء رئيسي polysialylated (> 95٪) مع طويلة، homopolymers حمض اللعابي سالبة الشحنة. Polysialic لويطلق إدارة البحث الجنائي مع ن> 10 PSA ولكن الهياكل بلازميدة قليلة القسيمات أقصر موجودة والتي هي أيضا ذات الصلة بيولوجيا. البروتينات polysialylated أخرى أعرب في الجهاز العصبي المركزي هي SynCAM1 ^26، Neuropilin-2 (المفدال-2) ^27،28 وحدة فرعية قناة الصوديوم ²⁵ (للمراجعة يرى ^29).

الأساليب المذكورة هنا تسمح تحديد المستضد لالمناعية الإنسان والفأر التي تحتوي على كابا (Vκ) سلاسل ضوء (VκI، VκIII أو VκIV سلاسل الضوء عن الأجسام المضادة البشرية وسلاسل ضوء VκI عن الأجسام المضادة الماوس) محددة بغض النظر عن نمط إسوي الأجسام المضادة (على سبيل المثال، مفتش، الغلوبولين المناعي و IgA، الجمعية الإسلامية أو إيج). ويستند هذا القيد على استخدام البروتين L الاغاروز لimmunoprecipitations مع الأجسام المضادة للنمط إسوي الغلوبولين المناعي. ويمكن أن تشمل الاستراتيجيات البديلة يكتينس ملزم المانوز والأجسام المضادة لمكافحة الغلوبولين المناعي الثانوية مرتبطة تساهميا إلى الاغاروز الخرز، والتي قد توسيع تطبيق هذا الأسلوب لمزيد من الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي المؤتمر الوطني العراقيluding تلك مع سلاسل ضوء امدا (λ) (انظر المناقشة). نسب سلاسل ضوء المصل الغلوبولين المناعي Vκ مقارنة سلاسل الغلوبولين المناعي λ الخفيفة المستمدة من الأفراد الأصحاء هي 1.5: 1 ^30.

واستنادا إلى المنهجية الكروماتوغرافي المستخدمة هنا لفصل، وإثراء، ومناعيا الكشف عن بعض الجزيئات ^31، يطلب من جميع المضادات ليشمل مجال واحد على الأقل بروتين صغير. حاتمة ملزمة محددة الأجسام المضادة يمكن أن يكون داخل أو خارج نطاق البروتين (على سبيل المثال، في البروتينات السكرية، البروتينات الدهنية). الخطوات البيوكيميائية الأولية المستخدمة لتحديد المستضد محددة لHIgM12، المعنية لتضييق قائمة المرشحين المحتملين، هي أهم الخطوات في هذا الأسلوب. يتم وصف نوع من الخلايا الاستعدادات محددة وخلية الأوصاف القائمة على مورفولوجيا الخلايا الدبقية لكن هذه المنهجية يمكن استقراء لاستيعاب أنواع الخلايا الأخرى داخل أو خارج الجهاز العصبي المركزي.

هناك إلحاحاتحتاج إلى تطوير تقنيات جديدة أو تعديل المعمول بها في عدد متزايد من الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي مع الإمكانات العلاجية لاضطرابات الإنسان المختلفة خاصة في تلك الحالات (الأغلبية من المستضدات الغلوبولين المناعي) حيث الأهداف الأجسام المضادة هي هياكل الكربوهيدرات أو الدهون.

أجريت البروتوكولات والإجراءات الحيوانية وفقا لالمعاهد الوطنية للصحة المبادئ التوجيهية التي وافقت عليها لجان مايو كلينيك المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (مايو IACUC البروتوكول رقم # A51912).

تحضير الأنسجة 1. الجهاز العصبي المركزي عامة

1. توليد NCAM ناقصة (KO) الفئران على C57 / BL6 الخلفية (تفضلت التي تقدمها الدكتور لين Landmesser، جامعة كيس ويسترن ريزيرف في كليفلاند، أوهايو)، الفئران NCAM متخالف والنوع البري (WT) تتزاحم (C57 / BL6) عن طريق عبور الزيجوت. وقد وصفت التنميط الجيني لNCAM KO الفئران سابقا ^32-34 وسوف لا يمكن تفسيره في مزيد من التفاصيل.

ملاحظة: خطوات 1،2-1،6 اختيارية.

2. قبل الجراحة، ويدير حل بنتوباربيتال (المخزون: 25 ملغ / مل، 50/100 ميكرولتر من بنتوباربيتال في أوائل مراحل الكبار بعد الولادة منهما) عن طريق الحقن داخل الصفاق (إبرة قياس 27 و 1 ملمحقنة).
3. الانتظار لمدة 2 دقيقة أو حتى الحيوان وصلت طائرة من التخدير الجراحي. إدارة مخدر إضافية عند الضرورة أثناء كل عملية للحفاظ على الطائرة من التخدير الجراحي. استخدام إصبع طريقة قرصة استجابة لتحديد عمق التخدير. يجب أن تكون الحيوانات لا تستجيب قبل المتابعة.
4. جعل 0،5-1 سم شق الجانبي من خلال إهاب وجدار البطن فقط تحت القفص الصدري. بعناية فصل الكبد من الحجاب الحاجز. إجراء شق صغير في الحجاب الحاجز باستخدام منحنية، مقص حادة. مواصلة شق الحجاب الحاجز على طول القفص الصدري لفضح تجويف الجنبي.
5. وضع منحنية، مقص حادة على طول جانب واحد من القفص الصدري، وتشريد بعناية الرئتين، واجراء خفض خلال القفص الصدري حتى الترقوة. اجراء خفض مماثل على الجانب المقابل. رفع القص بعيدا، وتقليم بعناية أي نوع من الأنسجة توصيله إلى القلب.
6. إجراء شق للحيوانالصورة الأذين الأيمن باستخدام مقص القزحية لخلق كبير كمتنفس وقت ممكن. ببطء ضخ 10 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى البطين الأيسر للحيوان (الضوء الأحمر، معدل التدفق: 1 مل / دقيقة) باستخدام حقنة 10 مل مزودة إبرة 27 عيار. لا زيادة تدفق / PBS الضغط خلال نضح لتجنب تدمير الأنسجة.
7. قطع رأس الفئران حديثي الولادة باستخدام مقص جراحي.
8. إزالة الدماغ عن طريق الاستيلاء على تجويف العين مع ملقط وعن طريق إدراج مقص صغير في العمود الفقري. قطع الجمجمة نحو الأمام على مستوى الأذن. قم بتقشير الجمجمة ووضع بلطف الدماغ في طبق بيتري 60 ملم مليئة 10 مل من الجليد الباردة تشريح المتوسطة على الجليد (الجدول 1). وضع كل الدماغ في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل وتخزينها مباشرة على الثلج الجاف (-79 درجة مئوية).
9. شق المخيخ والمخ الجذعية من العقول المجمدة باستخدام شفرة حلاقة نظيفة على الجليد. العمل بسرعة لتجنب ذوبان الأنسجة.
10. يزنمخ المجمدة، وضعت في أنبوب 15 مل على الجليد وإضافة العازلة تحلل الجليد الباردة (انظر الجدول 1) إلى التركيز النهائي من 150 ميكروغرام أنسجة المخ في ميكرولتر العازلة تحلل. تكرار لما تبقى من الشلل. تبقي العقول على الجليد في جميع الأوقات لاتخاذ خطوات 1،9-1،11.
11. التجانس العقول في تحلل العازلة التي كتبها سحن من خلال ماصة 1 مل (10 مرات)، يليه سحن من خلال حقنة 5 مل مزودة إبرة 27 عيار (10 مرات). احتضان لست] الدماغ لمدة 30 دقيقة إضافية على الجليد للسماح للتحلل الأنسجة كاملة.
12. إزالة المواد والدماغ الدهون المنظفات غير قابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي التسلسلي (أربع جولات في 19000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية). تجاهل (أبيض) المايلين والحطام الخلية التي تحتوي بيليه ولكن الاحتفاظ طاف بعد كل خطوة الطرد المركزي. لست] الدماغ قسامة ومخزن في -80 درجة مئوية.

2. Immunoprecipitations عن طريق IgMs الإنسان (HIgM12 ونمط إسوي تحكم الغلوبولين المناعي) بأنه "سحب لأسفل" وكيل من الشللل لست] من WT وNCAM KO الفئران

1. البروتين L الاغاروز حبة إعداد ^9،35،36
   1. إعداد 200 مل من العازلة الملكية الفكرية بما في ذلك BSA (انظر الجدول 1). إعداد آخر 200 مل من المخزن المؤقت IP نفسه من دون جيش صرب البوسنة.
   2. لكل مناعي نقل رد فعل 100 ميكرولتر من البروتين L الاغاروز الطين باستخدام ماصة 200 ميكرولتر في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. لا البروتين دوامة حبات L الاغاروز! إضافة 1 مل من العازلة IP (انظر الجدول 1) إلى كل أنبوب. خلط البروتين L الاغاروز وعازلة IP يدويا من خلال انعكاس (خمس مرات).
   3. غسل البروتين L الخرز الاغاروز أربع مرات من قبل الطرد المركزي في جهاز للطرد المركزي الفوق (1000 x ج، 2 دقيقة، 25 درجة مئوية). خلع طاف باستخدام ماصة 200 ميكرولتر من دون إزعاج بيليه الاغاروز. تكرار الغسيل الخطوات 2.1.2 إلى 2.1.3 ثلاث مرات إضافية.
   4. تتوازن البروتين L الاغاروز في 1 مل من العازلة IP أضاف حديثا على الأسطوانة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
2. الضد مستضد-الاغاروز L تشكيل مجمع وكشف مستضد في البقع الغربية
   1. احتضان 30 ملغ من أنسجة المخ هي lysed (~ 200 ميكرولتر المحللة) في 1 مل من العازلة IP المثلج مع 20 ميكروغرام من الغلوبولين المناعي (HIgM12) في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل بين عشية وضحاها على الأسطوانة عند 4 درجات مئوية.
   2. تدور باستمرار حبات الاغاروز البروتين L (من الخطوة 2.1.4) في جهاز للطرد المركزي الفوق لمدة 2 دقيقة في 1000 x ج، 4 درجة مئوية. تجاهل طاف باستخدام ماصة 200 ميكرولتر من دون إزعاج بيليه الاغاروز. إضافة محلول مبرد الأجسام المضادة في الدماغ المحللة (من الخطوة 2.2.1) إلى الاغاروز البروتين L باستخدام ماصة 1 مل.
   3. احتضان الضد مستضد البروتين تعليق L الاغاروز لمدة 2 ساعة على الأسطوانة عند 4 درجات مئوية. غسل مجمع الضد مستضد تعلق على الاغاروز L من خلال الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 2 دقيقة، 4 درجات مئوية. بعناية تجاهل طاف دون الإخلال بيليه وإضافة 1 مل من العازلة الجليد الباردة IP تحتوي على 0.2٪ BSA.
   4. كرر الخطوة غسل واحد لمزيد من الوقت باستخدام عازلة IP الجليد الباردة التي تحتوي على 0.2٪ BSA ومرتين إضافية باستخدام عازلة IP الجليد الباردة من دون جيش صرب البوسنة.
   5. تدور باستمرار مجمع الضد مستضد تعلق على الاغاروز L في 1000 x ج لمدة 2 دقيقة، 4 درجات مئوية. تجاهل طاف تماما لأول مرة باستخدام ماصة 200 ميكرولتر حتى ~ تركت 50 ميكرولتر من حل على رأس بيليه الاغاروز البروتين L تليها ماصة 10 ميكرولتر. الاحتفاظ بعينات على الجليد.
   6. إضافة 40 ميكرولتر من العازلة شطف IP (انظر الجدول 1) في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge، إصبع أنابيب نفض الغبار 6 مرات والحرارة لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية. وضع العينات على الجليد لمدة 2 دقيقة وتدور باستمرار لمدة 30 ثانية في 13000 x ج، 4 درجة مئوية.
   7. نقل طاف باستخدام ماصة 10 ميكرولتر (~ 35 مجموع ميكرولتر) في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل الطازج من دون إزعاج بيليه. تأكيد غياب الخرز البروتين L الاغاروز من قبل الشطف أسفل كمية صغيرة من عينة مزال في جدار الأنبوب الداخلي.
      ملاحظة: "حبيبي"حبات الاغاروز البروتين L واضحة للعيان إذا كان موجودا.
   8. إذا حبات البروتين L الاغاروز موجودة، وتدور باستمرار عينة لمدة 30 ثانية أخرى في 13000 x ج ونقل طاف لتنظيف الأنبوب. كرر الخطوة حتى لا الخرز الاغاروز قابلة للكشف.
   9. الحمل 10-20 ميكرولتر من عينات مزال لكل بئر على هلام SDS-بولكرلميد في نظام المخزن تريس / جليكاين / SDS (انظر الجدول 1).
      ملاحظة: استخدام 7.5٪ أو 4-20٪ والمواد الهلامية التدرج مع 50 ميكرولتر حجم التحميل لكل بئر للكشف عن PSA-NCAM أو الإسوية NCAM (أبعاد هلام (العرض × الطول × سمك: 8.6 X 6.7 X 0.1 سم).
   10. المواد الهلامية الترشح ل~ 1 ساعة على 100 ​​فولت (1.74 V / سم ²⁾ على الفوق. ليس مطلوبا تبريد إضافي لهذه الخطوة ^37،38.
   11. البروتينات نقل إلى PVDF (فلوريد البولي فينيل) غشاء (حجم المسام 0.45 ميكرون) لمدة 2.5 ساعة في غرفة باردة في 100 فولت (1.74 V / سم ²⁾ باستخدام نقل عازلة البارد (5-10 درجة مئوية) (انظر الجدول 1).
   12. الأغشية كتلة ثإيث 10٪ (ث / ت) مسحوق الحليب الجاف في برنامج تلفزيوني-T لمدة 1 ساعة على 25 درجة مئوية على شاكر المداري الفوق، وغسل الأغشية مرتين لمدة 10 دقيقة مع برنامج تلفزيوني-T والتحقيق بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة الأولية في 5٪ BSA في PBS- تي على شاكر المداري في غرفة باردة.
   13. في صباح اليوم التالي الأغشية غسل مرة واحدة لفترة وجيزة مع فائض في برنامج تلفزيوني-T في 25 درجة مئوية (بما في ذلك غطاء وعاء) تليها 3 يغسل مع برنامج تلفزيوني-T لمدة 10 دقيقة كل يوم شاكر المداري (80 دورة في الدقيقة) (يتم تنفيذ كافة خطوات الغسيل في 25 درجة مئوية).
   14. إضافة الضد الثانوية (الفجل البيروكسيداز (HRP) -conjugated مكافحة الإنسان لمكافحة الغلوبولين المناعي الأجسام المضادة (لHIgM12) (تخفيف 1: 30،000) في 5٪ مسحوق الحليب الجاف في برنامج تلفزيوني-T ل1HR في 25 درجة مئوية على شاكر المداري (70 دورة في الدقيقة ).
   15. غسل الأغشية على نطاق واسع مرة واحدة لفترة وجيزة مع فائض في برنامج تلفزيوني-T في 25 درجة مئوية (بما في ذلك غطاء وعاء) تليها 3 يغسل مع برنامج تلفزيوني-T لمدة 10 دقيقة كل يوم شاكر المداري (80 دورة في الدقيقة) (يتم تنفيذ كافة الخطوات غسل عند 25 درجة مئوية) .
   16. خلط 1 مل من chemiluminescen تعزيز مبردةم HRP عنصر الركيزة ألف (تعزيز مينول الكاشف) مع 1 مل من مكون B (مؤكسدة الكاشف) (لكل لطخة صغيرة) في 25 درجة مئوية.
   17. استخدام ملقط البلاستيك لنقل الأغشية على منشفة ورقية لإزالة السائل الزائد (تحميلهم على حواف جدا). حاويات الجافة مع المناشف الورقية والأغشية إعادتها إلى الحاويات (واحد لكل الغشاء). على الفور إضافة 2 مل من قبل مختلطة تعزيز التوهج HRP الركيزة (مركب A + B) (الخطوة 2.2.16.) لكل الغشاء واحتضان لمدة 2 دقيقة عند 25 درجة مئوية على شاكر المداري (90 دورة في الدقيقة). وترطيبها تأكد من الأغشية بشكل موحد من قبل كاشف التوهج.
   18. نقل الأغشية في كم من البلاستيك الشفاف وإزالة الزائدة السائل وفقاعات الهواء مع المناشف الورقية. وضع الأغشية في الغلاف البلاستيكي في شريط فيلم وفي نهاية المطاف الشريط الغلاف البلاستيكي في الكاسيت. إغلاق الكاسيت.
   19. خذ كاسيت، فيلم، وتوقيت ومقص في غرفة مظلمة. قطع الزاوية اليمنى العليا من كل فايLM للأغراض التوجه، تعرض (مختلفة) الأفلام لفترات مختلفة من الزمن (10 ثانية، 1 دقيقة، 10 دقيقة)، وتطوير الأفلام في مطور الفيلم.

3. Endoneuraminidase-NF هضم PSA المرفقة لNCAM ³⁹

1. هضم أنسجة الدماغ هي lysed من يوم ما بعد الولادة (P) 7 الفئران WT والفئران P7 NCAM KO (أعدت من الخطوة 1.12) لمدة 2 ساعة على الجليد باستخدام endoneuraminidase-NF (ENDO-NF) كما هو موضح في الجدول رقم 2 ^39.
2. إضافة 5 ميكرولتر من عينة العازلة 4X Laemmli إلى كل أنبوب (1-6) من الخطوة 3.1 (الجدول 2).
3. عينات الحمل على 4 - التدرج هلام 20٪ SDS-بولكرلميد وكرر الخطوات من 2.2.10 إلى 2.2.19. الأغشية التحقيق مع HIgM12 (1 ميكروغرام / مل)، وهي متاحة تجاريا مكافحة PSA ماب (استنساخ 2-2B) (1 ميكروغرام / مل)، والأجسام المضادة (مراقبة التحميل)، β الأكتين (1 ميكروغرام / مل) في 5٪ BSA في برنامج تلفزيوني -ت.

4. إعداد الجرذ والفأر الثقافات الجهاز العصبي المركزي

1. إعداد coverslips الزجاج
   1. حمض غسل coverslips الزجاج 25 ملم في 1 M حمض الهيدروكلوريك في 50 - 60 درجة مئوية ل4-16 ساعة في غطاء الدخان باستخدام وعاء زجاجي. تستنهض الهمم coverslips في بعض الأحيان من خلال يحوم طيف.
   2. غسيل الزجاج coverslips على نطاق واسع في الماء المقطر (3X). تأكد من أن تغسل حمض بين coverslips مكدسة.
   3. شطف coverslips في الإيثانول بنسبة 100٪ وتجفيفها على بارافيلم في غطاء ثقافة الخلية. قبل يوم واحد من الاستخدام، وتسخين الزجاج coverslips لمدة 24 ساعة في وعاء زجاجي مع غطاء على 100 درجة مئوية في الفرن.
   4. وضع coverslips الزجاج في صحن 6 جيدا ومعطف مع 3 مل من 40 ميكروغرام / مل بولي-D-يسين في الماء المعقم لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية.
   5. يغسل مرتين مع الماء المعقم، يجف تماما تحت غطاء محرك السيارة خلية ثقافة وتطبيق ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة.
2. إعداد زراعة الأنسجة من البلاستيك لخلايا الجهاز العصبي المركزي
   1. معطف 60 ملم أطباق زراعة الخلايا أو 75 سم قوارير ثقافة ² الأنسجة مع 3مل أو 10 مل، على التوالي، من 40 ميكروغرام / مل بولي-D-يسين في الماء المعقم لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية.
   2. يغسل مرتين مع الماء، ويجف تماما تحت غطاء محرك السيارة خلية ثقافة وتطبيق ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة.
3. الفئران مختلطة الدبقية عزل ⁴⁰
   1. تخدير الفئران حديثي الولادة في افق IACUC القوارض غرفة القتل الرحيم مع CO ₂ امدادات الغاز (المؤتمتة بالكامل). استخدام إصبع طريقة قرصة استجابة لتحديد تجاوب الحيوان. قطع رأس الأطفال حديثي الولادة سبراغ داولي الفئران (P0P1) (6-10 الجراء في وقت واحد).
   2. إزالة الدماغ عن طريق الاستيلاء على تجويف العين مع ملقط وعن طريق إدراج مقص صغير في العمود الفقري. قطع الجمجمة نحو الأمام على مستوى الأذن. قم بتقشير الجمجمة ووضع بلطف الدماغ في طبق بيتري 60 ملم مليئة 10 مل من الجليد الباردة المتوسطة تشريح على الجليد (انظر الجدول 1).
   3. كرر الفئران الوليدة المتبقية (6-10 الجراء). إبقاء الأنسجة على الجليد لخطوات 4.3.2 - 4.3.7.
   4. تقسيم المخ على طول خط الوسط الى قسمين نصفي الكرة المخية، وبعد ذلك قطع بصيلات الشم، العقد القاعدية تحت قشرة الدماغ والحصين مع ملقط دومون. وضع القشرة الدماغية المعزولة في طبق بيتري نظيفة تحتوي على تشريح المتوسطة على الجليد.
   5. خذ قشرة واحدة. إزالة السحايا مع ملقط مع نصائح غرامة تحت المجهر تشريح.
   6. كرر مع القشور المتبقية. ضع كل القشور خالية من السحايا في واحدة طبق بيتري نظيفة على الجليد.
   7. الجمع بين نصفي الكرة الأرضية القشرية من جميع الجراء في 60 مم طبق بيتري واستخدام شفرة حلاقة معقمة لالزهر وأنسجة المخ إلى 1 مم مفروم قطعة.
   8. نقل أنسجة المخ المفروم باستخدام ماصة 10 مل إلى العقيمة، غير المصقول 500 مل قارورة زجاج وإضافة 10 مل من الجليد الباردة المتوسطة تشريح في دماغ الفئران. دوامة بلطف القارورة مع إضافة 1 مل من محلول التربسين في HBSS (هانك المتوازن محلول الملح) (5 ملغ / مل التربسين) إلى 9 مل من HBSS في دماغ الفئران. إضافة 2٪ من حجم التداول الكلي في حل الدناز الأول (1 ملغ / مل) و 2٪ من حجم التداول الكلي في MgSO ₄ الحل (3.82٪ MgSO ₄ في HBSS (ث / ت)) إلى تعليق أنسجة المخ ودوامة بلطف.
   9. يعرض للتريبسين النسيج تحت لطيف تهتز على شاكر التناوب لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تأكد من قطعة نسيج تطفو خلال هذه الخطوة ولا الرواسب إلى أسفل. زيادة سرعة الدوران إذا لزم الأمر.
   10. إضافة مصل بقري جنيني (FBS) إلى تركيز النهائي من 10٪ (ت / ت) ومزيج من قبل يحوم القارورة 10 مرات لمدة 10 ثانية. تهدئة تعليق الأنسجة في الماء المثلج لمدة 15 دقيقة. دوامة قارورة بلطف خمس مرات كل دقيقة الثاني.
   11. نقل بلطف تعليق الأنسجة في العقيمة 50 مل أنابيب باستخدام 25 مل أو 50 مل الماصات وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 x ج، 4 درجة مئوية.
   12. تجاهل طاف وبلطف و resuspend هضم أنسجة الجهاز العصبي المركزي في 15 مل من المتوسط ​​تشريح المثلج تستكمل مع 5 مل من مصل بقري جنيني، 0.4 مل MgSO ₄ الحل (3.82٪MgSO ₄ في HBSS) و 1.6 مل من الدناز الأول (1 ملغ / مل).
   13. تعليق الأنسجة تقسيم بالتساوي إلى مجموعتين العقيمة 15 مل أنابيب (~ 10 مل لكل منهما) وببطء يسحن باستخدام ماصة 10 مل (10 مرات) حتى يصبح تعليق عكر / حليبي. حفاظ على الخلايا علقت على الجليد أثناء معالجة أنبوب المقبل. الانتظار لمدة 3 دقائق حتى هضمها الجهاز العصبي المركزي المتبقية الأنسجة الرواسب في قاع الأنبوب. نقل طاف لتنظيف أنبوب 50 مل من دون إزعاج جزء بيليه.
   14. اختياريا، وتمرير supernatants العكرة من خلال 40 ميكرون خلية مصفاة والجمع بين تعليق خلية واحدة مما أدى إلى العقيمة 50 مل أنابيب على الجليد.
   15. تدور الطين خلية لمدة 5 دقائق في 200 x ج، 4 درجة مئوية.
   16. إزالة بلطف طاف باستخدام ماصة 10 مل حتى يتم ترك ~ 2 مل من تشريح المتوسطة على رأس بيليه الخلية.
   17. إصبع الكريات خلية نفض الغبار في 50 مل أنابيب (~ 10 مرات). ببطء إضافة 5 مل من متوسط ​​النمو الدافئ (انظر الجدول 1) إلى تعليق خلية في حين بلطفومن ناحية تحوم الأنبوب.
   18. اختياريا، كرر الدناز خطوة 4.3.12 لمدة 10 دقيقة إضافية على الجليد مع الطازجة حل الدناز الأول وMgSO ₄ -solution في حالة مجموعات الأنسجة مرئية أو كتل الحمض النووي. أنبوب دوامة يدويا 5 مرات كل دقيقة الثاني.
   19. لوحة 50،000 خلية لكل 25 مم ساترة الزجاج في بركة من 400 متوسطة النمو ميكرولتر في صحن 6 جيدا وترك الخلايا نعلق لمدة 30 دقيقة في حاضنة الثقافة الخلية (5٪ CO _2، 37 درجة مئوية).
   20. لمتموجة (ضمن 24-48 ساعة بعد الطلاء) أطباق زراعة الخلايا 60 مم و 75 سم قوارير ثقافة ² الأنسجة، لوحة 500،000 الخلايا (60 ملم صحن) أو 2 مليون خلية (75 سم ² قوارير).
   21. إضافة بلطف 2 مل (لكل بئر، coverslips الزجاج 25 ملم في صحن 6 جيدا)، 3 مل (أطباق 60 ملم) أو 10 مل (75 سم ² قوارير) من متوسط ​​النمو الحار إلى كل بئر. احتضان خلايا بين عشية وضحاها وتغيير المتوسطة تماما في صباح اليوم التالي. ثم تغيير المتوسط ​​كل يوم (يوم 3، ويوم 5، ويوم 7، الخ).
       لاالشركة المصرية للاتصالات: الجرذ الثقافات الدبقية المختلطة هي جاهزة للاستخدام للمناعية أو الكيمياء الحيوية 24 - 48 ساعة بعد الطلاء.
4. الثقافات الماوس المختلطة الدبقية
   1. مطابقة لتشريح أدمغة الفئران حديثي الولادة هو مبين في الأقسام 4.3.1 إلى 4.3.6، قطع رأس P0 حديثي الولادة WT وNCAM KO الفئران مع C57 / BL6 الخلفية، إزالة العقول ووضعها في الجليد الباردة تشريح المتوسطة (انظر الجدول 1). إبقاء الأنسجة على الجليد في جميع الأوقات.
   2. تقسيم المخ على طول خط الوسط الى قسمين نصفي الكرة المخية، وبعد ذلك قطع بصيلات الشم، العقد القاعدية تحت قشرة الدماغ والحصين مع ملقط دومون. وضع القشرة الدماغية المعزولة في طبق بيتري نظيفة تحتوي على HBSS على الجليد.
   3. خذ قشرة واحدة. إزالة السحايا مع ملقط مع نصائح غرامة تحت المجهر تشريح. كرر مع القشور المتبقية. ضع كل القشور خالية من السحايا في واحدة طبق بيتري نظيفة على الجليد.
   4. نقل hemisphe القشريةالدقة مع 1 مل ماصة من كل فأر إلى منفصلة، ​​معقمة 15 مل أنابيب. إضافة 1.2 مل الجليد الباردة تشريح المتوسطة إلى كل الدماغ وتعطيل آلية أنسجة المخ من قبل pipetting النتيجة 2 مرات صعودا وهبوطا باستخدام 1 مل ماصة.
   5. إضافة 150 ميكرولتر غراء حل (10 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني)، و 100 ميكرولتر الدناز أنا الحل (1 ملغ / مل في HBSS) و 50 ميكرولتر MgSO ₄ (3.82٪ في HBSS) إلى كل الدماغ ومزيج من قبل عبها الإصبع.
   6. احتضان تعليق الدماغ لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي وتخلط تعليق الدماغ كل دقيقة الثانية عبها الإصبع. إضافة 1 مل من FBS في أنبوب، ومزيج تهدئة تعليق الأنسجة لمدة 10 دقيقة على الجليد.
   7. تدور باستمرار أنسجة المخ لمدة 4 دقائق في 200 x ج، 4 درجة مئوية و resuspend بيليه الأنسجة في 1 مل من العازلة تشريح المثلج تستكمل مع 70 ميكرولتر من الدناز أنا الحل (1 ملغ / مل في HBSS) و 30 ميكرولتر MgSO ₄ الحل (3.82٪ في HBSS).
   8. يسحن أنسجة المخ باستخدام FBS المغلفة 1 مل ماصة(~ 5 مرات) حتى يصبح طاف العكرة. تمرير طاف من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرون ونقل في أنبوب نظيفة على الجليد.
   9. بيليه الخلايا الدبقية المختلطة من خلال الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 x ج، 4 درجة مئوية. يتم ترك نضح طاف حتى ~ 100 ميكرولتر من المتوسطة على رأس بيليه الخلية. و resuspend الخلية بيليه بواسطة الإصبع عبها (~ 5 مرات) وإضافة 1 مل من الحارة متوسط ​​النمو الماوس (انظر الجدول 1).
   10. اختياريا، ويحل مجموعات الخلايا مرئية والخلايا هي lysed / عجلت الحمض النووي من قبل pipetting بلطف صعودا تعليق خلية وهبوطا (خمس مرات).
   11. لوحة الماوس الخلايا الدبقية مختلطة coverslips على الزجاج المطلي PDL أو أطباق 60 ملم كما هو موضح في الخطوات 4.3.19 - 4.3.21. غسل الخلايا في صباح اليوم التالي مع دافئ متوسط ​​النمو الماوس وبعد ذلك كل يوم. الماوس الدبقية المختلطة جاهزة للاستخدام للمناعية 48-72 ساعة بعد الطلاء.
5. الفئران الخلايا الدبقية الصغيرة عزل
   1. ثقافة الفئران مختلطةالدبقية في 75 سم قوارير ثقافة ² الأنسجة في وسط النمو (انظر الجدول 1) لمدة 10 يوما. التخلص من مجموعات الخلايا الدبقية من الثقافات الدبقية مختلطة على شاكر التناوب داخل حاضنة الثقافة الخلية (5٪ CO _2، 37 درجة مئوية) في 140 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة.
   2. خلع طاف التي تحتوي على الخلايا الدبقية الصغيرة من الثقافات الدبقية مختلطة، تمر من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرون والحفاظ على تعليق خلية في العقيمة 50 مل أنابيب.
      ملاحظة: الثقافات الدبقية هي عادة> 95٪ نقية بعد هذه الخطوة مع قليل من يجد OPCs تلويث وعدد قليل جدا من الخلايا النجمية.
   3. اختياريا، استبدال المتوسطة النمو على الثقافات الدبقية مختلطة لهزة العرضية دبقية في المستقبل. أداء عادة متعددة دبقية هزة العرضية (مرة واحدة في الأسبوع) من الثقافات الدبقية مختلطة.
   4. اختياريا، للحصول على أعلى درجات نقاء 95٪ لوحة 10 مل من طاف التي تحتوي على الخلايا الدبقية الصغيرة (الخطوة 4.5.2) لكل 100 ملم أطباق بتري واحتضان في حاضنة الثقافة خلية لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. فقط microglوالجيش العراقي نعلق على أطباق بتري، في حين تبقى الخلايا النجمية ويجد OPCs في طاف.
   5. يهز بلطف أطباق بتري في اتجاه عقارب الساعة وعكس عقارب الساعة (خمس مرات لكل منهما) في الخلية هود الثقافة. نضح زراعة الخلايا المتوسطة تماما واستبدالها مع 10 مل من متوسط ​​النمو. مما أدى الثقافات الخلايا الدبقية الصغيرة هي> 98٪ نقية.
   6. ثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة لمدة تصل إلى 7 أيام في DMEM تستكمل مع 1٪ FBS و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين.
6. الفئران OPC / دبقية قليلة التغصن عزل
   1. للحصول على الثقافات OPC عالية التخصيب التخلص من الخلايا الدبقية الأول من 10 يوما القديمة الثقافات الدبقية المختلطة التي تزرع في 75 سم ² قوارير على شاكر التناوب ضمن حاضنة الثقافة الخلية (5٪ CO _2، 37 درجة مئوية) في 140 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة. تجاهل الخلايا الدبقية الصغيرة التي تحتوي فقط، طاف أو استخدام لتجارب الخلايا الدبقية الصغيرة المحددة (راجع الخطوة 5.5).
   2. استبدال طاف التي تحتوي على دبيقي مع 10 مل متوسطة النمو والتخلص من الثقافات الدبقية مختلطة لل18 ساعة أخرى على شاكر التناوب في 200 دورة في الدقيقة (5٪ CO _2، 37 درجة مئوية).
   3. جمع microglia- وطاف التي تحتوي على مكتب أمين المظالم من الثقافات الدبقية مختلطة ويمر عبر مصفاة الخلية 40 ميكرون. جمع تعليق خلية في العقيمة 50 مل أنابيب.
   4. اختياريا، استبدال المتوسطة النمو على الثقافات الدبقية مختلطة للOPC هزة العرضية القادمة.
      ملاحظة: تواصل يجد OPCs في الانتشار على طبقات المغذية نجمي، ويمكن أن اهتزت مرة ومرة ​​ثانية وثالثة (مرة واحدة في الأسبوع)، ولكن مع انخفاض العوائد.
   5. لوحة 10 مل من microglia- وOPC التي تحتوي على طاف في 100 ملم أطباق بتري واحتضان في الخلية الثقافة الحاضنة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. والخلايا الدبقية الصغيرة نعلق على أطباق بتري، في حين لا تزال يجد OPCs والخلايا النجمية في طاف.
   6. يهز بلطف أطباق بتري في اتجاه عقارب الساعة وعكس عقارب الساعة (5 مرات لكل منهما) في غطاء ثقافة الخلية. تأخذ بها سوى عدد قليل من أطباق بتري في كل مرة من حاضنة الثقافة الخلية (الخلايا الدبقية الصغيرة سوف تبدأ طرد من الحيوانات الأليفةأطباق ري عندما اهتزت بقوة في وسط برودة).
   7. جمع والجمع بين طاف التي تحتوي على مكتب أمين المظالم في 50 مل أنابيب. اختياريا، إضافة مستنبت لأطباق بتري لاستخدامها في تجارب الخلايا الدبقية الصغيرة محددة.
   8. اختياريا، لزيادة نقاء الثقافات OPC تكرار الخطوات 5.6.5 و5.6.6 مرة واحدة مع أطباق بتري جديدة لخفض حجم الخلايا الدبقية الصغيرة في الأعمال التحضيرية OPC.
   9. تدور باستمرار المخصب طاف التي تحتوي على مكتب أمين المظالم في أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 250 x ج، 4 درجة مئوية. نضح بلطف وطاف دون الإخلال بيليه الخلية. ترك 3 مل من طاف على رأس بيليه والبدء في إعادة التعليق يجد OPCs من قبل عبها الاصبع (10 مرات).
   10. يسحن بلطف مجموعات الخلايا OPC باستخدام ماصة 10 مل (5-10 مرات).
   11. عدد الخلايا ولوحة 50،000 يجد OPCs لكل 25 ملم ساترة الزجاج (PDL المغلفة) في بركة من 400 ميكرولتر متوسط ​​النمو في صحن 6 جيدا وترك الخلايا نعلق لمدة 30 دقيقة في حاضنة الثقافة الخلية (5٪ CO _2، 376؛ C). إضافة بلطف 2 مل من المتوسط ​​انتشار الدافئ (انظر الجدول 1) إلى كل بئر. لPDL المغلفة أطباق زراعة الخلايا 60 ملم، لوحة 1-1٬500٬000 يجد OPCs في 3 مل من المتوسط ​​الانتشار.
   12. بعناية استبدال FBS التي تحتوي على المتوسطة الانتشار مع انتشار جديدة متوسطة 3 ساعة بعد الطلاء ويجد OPCs (تأكد من يجد OPCs المرفقة بشكل صحيح وليس طرد خلال تغيير المتوسطة). المتوسطة صرف كل يوم الثاني على التوالي.
       ملاحظة: ثقافات الجرذ OPC أعدت باستخدام هذا البروتوكول وعادة ما تكون 90٪ نقية مع الخلايا الدبقية الصغيرة كأكبر نوع من الخلايا الملوثة، تليها الخلايا النجمية.

5. سيتولوجية مناعية عن طريق HIgM12 في الخلايا الدبقية الابتدائية

1. ثلاثية التسمية المناعي باستخدام HIgM12، ومكافحة PSA ماب، ونوع من الخلايا علامات محددة في الخلايا الدبقية الأولية من WT وNCAM KO الفئران
   1. في ظل ظروف الخلية الحية، والتسمية 60٪ متموجة الماوس مختلطة الثقافات الدبقية من WT وNCAM KO الفئران نمت على PDL المغلفة25 coverslips ملم الزجاج مع HIgM12 (10 ميكروغرام / مل)، ومكافحة PSA ماب (استنساخ 2-2B) (10 ميكروغرام / مل) في برنامج تلفزيوني تستكمل مع FBS 10٪ في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   2. غسل الخلايا ثلاث مرات لمدة 20 ثانية مع كل الجليد الباردة PBS تستكمل مع 10٪ FBS وإصلاح مع بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4 لمدة 15 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
   3. غسل الخلايا الثابتة مرتين لمدة 1 دقيقة مع كل برنامج تلفزيوني تستكمل مع 10٪ FBS وpermeabilize الخلايا مع 0.1٪ تريتون-X100 في برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4 لمدة 2 دقيقة عند 25 درجة مئوية. غسل الخلايا مرتين لمدة 1 دقيقة والتسمية مع علامات الدبقية GFAP (النجمية) أو IBA-1 (الخلايا الدبقية الصغيرة) (1 ميكروغرام / مل) في برنامج تلفزيوني تستكمل مع FBS 10٪ بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في غرفة باردة.
   4. المضي قدما في الظروف المناعي القياسية بما في ذلك دابي تحتوي على المتوسط ^​​31 في تصاعد مستمر.
      ملاحظة: استخدام المسمى من fluorescently فاب ₂ شظايا كما الأجسام المضادة الثانوية للإنسان (HIgM12) والفأرة (مكافحة PSA ماب، استنساخ 2 - 2B) يوصى IgMs بقوة.
   5. خذ فلوريداصور uorescent في 60X أو 100X التكبير. استخدام إعدادات أداة نفس لجميع الصور والصور العملية مماثل.
2. وصفها المناعي للخلايا الدبقية WT تعامل ENDO-NF-باستخدام HIgM12 بمثابة الأجسام المضادة الأولية
   1. ثقافة WT الماوس الدبقية مختلطة نمت لمدة 3 أيام في Neurobasal وتستكمل مع 10٪ FBS وملحق B27 (01:50) على PDL المغلفة coverslips ملم الزجاج 25. إضافة ENDO-NF (30 ميكروغرام / مل) إلى مستنبت 1 مل واحتضان بين عشية وضحاها في حاضنة الثقافة الخلية (37 درجة مئوية، و 5٪ CO _2).
   2. تعيش خلايا التسمية في البرد مع HIgM12 والداخلية نجمي الخلايا GFAP علامة بعد تثبيت وpermeabilization كما هو موضح في الخطوات 5.1.1 إلى 5.1.5. التقاط صور الفلورسنت على 60X أو 100X التكبير. استخدام إعدادات أداة نفس لجميع الصور ومعالجة مماثل.

يوضح هذا القسم أمثلة من النتائج التي يمكن الحصول عليها من خلال دراسة PSA-المستضدات الغلوبولين المناعي محددة الإنسان في الجهاز العصبي المركزي. يظهر استخدام الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي الإنسان تحتوي على سلاسل ضوء Vκ محددة في إعدادات البيوكيميائية ومناعية الفلورسنت.

HIgM12 immunoprecipitates مستضد لها من لست] الدماغ الدماغية ويعمل كعامل كشف (الأجسام المضادة الأولية) في البقع الغربية. لا isotype السيطرة الضد ولا الخرز L الأغاروس immunoprecipitate مستضد مماثل، مما يدل على خصوصية هدم (الشكل 1). البقع الغربية باستخدام لست] الجهاز العصبي المركزي من WT وNCAM KO الفئران تثبت خصوصية HIgM12 ملزم لNCAM التي تحتوي على دعم البرامج والإدارة (الشكل 2A). الهضم الأنزيمي من الأنسجة الجهاز العصبي المركزي من الفئران WT باستخدام ENDO-NF يحدد دعم البرامج والإدارة تعلق على NCAM كما حاتمة ملزمة محددة لHIgM12 (الشكل 2B). باستخدام طريقة الواردة في هذه الوثيقة، ويتم الحصول على الفئران بفيروس IBA-1 الثقافات الدبقية عالية النقاء (الشكل 3). متوفرة تجاريا الأجسام المضادة لمكافحة PSA (استنساخ 2-2B) لا تسمية سطح الخلية أو حمامات دعم البرامج والإدارة الداخلية في الثابت وpermeabilized الخلايا الدبقية إيجابية IBA-1 بواسطة المجهر الفلورسنت. وتمشيا مع الكتابات المنشورة سابقا، التي لم تسجل اى التعبير على سطح الخلية من PSA-NCAM في الخلايا الدبقية الصغيرة ^16،41 HIgM12 لا تسمية مستضدات سطح الخلية في الخلايا الدبقية الصغيرة الفئران النقاء. ومن المثير للاهتمام، HIgM12 وسم النتائج الخلايا الدبقية الصغيرة الثابتة وpermeabilized في داخل الخلايا، ونمط حول النواة التي لا تقتصر على عضيات معينة (الشكل 3). النتائج على النقيض من تلك التي تم الحصول عليها باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة PSA مفتش (استنساخ 735) ^26، والذي يستهدف دعم البرامج والإدارة SynCAM في الخلايا الدبقية الصغيرة في مستوى جولجي ^41.

وعلى النقيض من الخلايا الدبقية الصغيرة، HIgM12ومستضدات سطح الخلية A2B5 الهدف في عالي التخصيب الثقافات الفئران OPC في ظل ظروف الخلية الحية (الشكل 4). الثقافات OPC تحتوي ~ 5٪ تلويث الخلايا الدبقية الشكل 5 يوضح سطح الخلية نمط مماثل تقريبا تلطيخ بين HIgM12 ومكافحة PSA ماب (استنساخ 2-2B) في GFAP إيجابية الخلايا النجمية (الشكل 5A). مناعي وسم الخلايا النجمية WT هضمها ENDO-NF-مقارنة العازلة النجمية WT المعالجة للسيطرة على استخدام HIgM12 يدل على وجود دعم البرامج والإدارة نجمي الخلايا (الشكل 5B). وجود الخلايا النجمية-PSA إيجابي في الجسم الحي ما زالت تحتاج الى تأكيد.

الشكل 1: HIgM12 بمثابة "المنسدلة" وكيل في Immunoprecipitations Immunoprecipitations من إجمالي المحللة دماغ الفئران منذ ثلاثة أشهر باستخدام HIgM12، isotype السيطرة الإنسان HIgM.حبات 126 أو الاغاروز L فقط وكلاء "هدم". تم تشغيل البروتينات مزال في البقع الغربية مع الأغشية سبر ضد HIgM12. وكانت الأوزان الجزيئية للبروتينات مزال من حبات مغلفة HIgM12 في نطاق 160-200 كيلو دالتون بالإضافة إلى IgMs السلسلة الثقيلة (~ 65-73 كيلو دالتون). تم تعديل هذا الرقم من J. نوروتشيم. ^15. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: HIgM12 أهداف حمض Polysialic (PSA) شاردة على NCAM. ألف الخليط الدماغ من P7، P13، P16 P27 وNCAM مجموع تم تشغيل الفئران KO والضوابط littermate متخالف في البقع الغربية مع الأغشية سبر ضد HIgM12، PSA وβ الأكتين كما تحكم التحميل. B 10 ميكروغرام من الكبار WT المحللة مخ الفأر في 1٪ NP40 في برنامج تلفزيوني، كان يعالج الحموضة 6.5 مع endoneuraminidase N (ENDO-N) (إكسو) النورامينيداز مع α2-3 حمض polysialic البوليمر خصوصية (سياليداز) أو برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، ترشيح نفسه الحلل في البقع الغربية وبحث ضد HIgM12، PSA وβ-الأكتين كما تحكم التحميل. تم تعديل هذا الرقم من J. نوروتشيم. ^15. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

وينعكس غياب دعم البرامج والإدارة على الجرذ الخلايا الدبقية الصغيرة بسبب عدم وجود HIgM12 وصفها كانت الخلايا الدبقية الصغيرة الجرذ تربيتها لمدة 48 ساعة على بولي-D-يسين المغلفة coverslips الزجاج وإما المسمى مباشرة على الجليد مع HIgM12 أو بعد التثبيت مع HIgM12 أو المضادة: الرقم 3. -PSA ماب (استنساخ 2-2B). كانت خلايا تيوصفت riple مع الخلايا الدبقية الصغيرة علامة IBA-1 (الأخضر)، HIgM12 / PSA (أحمر) ودابي (الأزرق). تظهر الصور عدم وجود سطح الخلية دبقية ملزمة باستخدام HIgM12 (الصف العلوي) وعدم وجود مضاد للدعم البرامج والإدارة ملزمة (استنساخ 2-2B) إلى سطح الخلية ومخازن الداخلية في الابتدائية الفئران الخلايا الدبقية الصغيرة (الصف السفلي). وبناء على التشكل الثنائي القطب وغياب IBA-1 تلطيخ، واقترح الخلية-PSA إيجابي صغيرة (أقل صف) ليكون OPC. في الخلايا الثابتة، أدى HIgM12 تلطيخ في ذلك، نمط حول النواة punctated الذي لا يقتصر على العضيات محددة، واعتبر غير محددة ملزمة (الصف الأوسط). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: HIgM12 يستهدف الخلايا السطحية PSA-NCAM على الجرذ يجد OPCs كانت يجد OPCs الفئران والخلايا الدبقية الصغيرة cultu.الأحمر لمدة 4 أيام في المتوسط ​​انتشار coverslips على الزجاج المطلي بولي-D-ليسين والثلاثي المسمى مباشرة على الجليد مع HIgM12 أو A2B5 (الأخضر)، والداخلية البلاعم / الوحيدات علامة CD68 (استنساخ ED-1) (أحمر) ودابي (الأزرق) . الصور تظهر سكان الخلية إيجابية مجورلي لA2B5 OPC علامة (الصف العلوي) وHIgM12 (أقل صف) مع قليل من الخلايا الدبقية الصغيرة-CD68 إيجابي (~ 5٪). وأضاف تباين مرحلة والصور دابي للكشف عن سلامة الخلية وأرقام الهواتف المحمولة لكل السكان. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5: HIgM12 وماب مكافحة PSA شارك في تسمية وحيوانية نجمي في ماوس مختلط الدبقية. A. ماوس الخلايا الدبقية مختلطة من WT وNCAM مجموع الحيوانات KO التي تحتوي على الخلايا النجمية، خلايا دبقية قليلة التغصن-النسب وميكروغرامكان ليا مثقف لمدة 3 أيام وصفت مباشرة على الجليد مع HIgM12 (الأخضر)، ومكافحة PSA ماب (استنساخ 2-2B) (الحمراء)، وبعد ذلك لنجمي الخلايا علامة GFAP (البنفسجية) ودابي (الأزرق). HIgM12 ومكافحة PSA تكشف عن نمط تلطيخ متطابقة الظاهري على الخلايا النجمية WT GFAP إيجابية ولكنها تفتقر إلى الربط النجمية مثقف من الفئران NCAM KO. تم تعديل هذا الرقم من J. كان المثقف نوروتشيم. ^15. ب. الدبقية المختلطة مماثل كما هو موضح تحت A. وعلاجها بين عشية وضحاها مع endoneuraminidase-NF (تفضلت التي تقدمها الدكتورة مارتينا Muehlenhoff) أو التحكم في برنامج تلفزيوني. وصفت خلايا حية على الجليد مع HIgM12 (الخضراء) والملون في وقت لاحق لGFAP الداخلي علامات (أحمر) ودابي (الأزرق). يستهدف HIgM12 مستضدات سطح الخلية في برنامج تلفزيوني السيطرة تعامل الثقافات الدبقية مختلطة ولكن ليس endoneuraminidase-NF تعامل الدبقية مختلطة. تم تعديل هذا الرقم من JNSCI ^16. ررتخفيف انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وقد اتخذت جميع الصور في 60X التكبير باستخدام إعدادات الأداة نفسها ومعالجتها مماثل.

الجدول 1: الواق والحل وصفات الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 2: ENDO-NF هضم أنسجة الجهاز العصبي المركزي من P7 WT وNCAM KO الفئران.

أضداد الغلوبولين المناعي الطبيعي الإنسان جذابة المرشحين لالمناعية، وبينت الإمكانات العلاجية لعلاج الأمراض المختلفة ومنها السرطان واضطرابات الجهاز العصبي المركزي ^1-7. مفيد، فإن هذه الأجسام المضادة لا يثير استجابة مناعية في أي جيل من تحييد الأجسام المضادة يقلل كثيرا من الجرعة العلاجية الفعالة وفعالية. الأهم من ذلك، كانت جميع الأجسام المضادة مع الإمكانات العلاجية من نمط إسوي IgM و تنتمي إلى مرجع NAB ^{3-5،8،9،37،40،42-45.} وهناك عقبة رئيسية لتطبيق السريرية المحتملة من الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي هي التعرف على مولدات المضادات، والتي هي غير محددة في كثير من الحالات. التقنيات القياسية المستخدمة لالأجسام المضادة مفتش غالبا ما تكون غير قابلة للتطبيق لتحديد المستضد على الغلوبولين المناعي ل.

يصف هذا البروتوكول تحديد PSA-NCAM كما مستضد لالتجديدي البشري الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي HIgM12 وفعال في النماذج الحيوانيةمرض التصلب العصبي المتعدد وALS ^15-18. المنهجية المستخدمة قابلة للتطبيق أساسا لجميع الأجسام المضادة البشرية مع سلاسل Vκ ضوء محددة VκI، VκIII وVκIV والأجسام المضادة الفأر مع سلاسل ضوء VκI، بغض النظر عن نمط إسوي الأجسام المضادة ل.

الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو استخدام الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي في تطبيقات اللوني التقارب. وبشكل أكثر تحديدا، يطلب من الأجسام المضادة ناجحة للعمل كوكلاء المنسدلة في immunoprecipitations لعزل أو لاثراء مستضد من نسيجيا أو خلية ثقافة لست] معقدة. ويمكن مقارنة الكسور مستضد المخصب immunoprecipitations من الأجسام المضادة isotype السيطرة وتحليلها في وقت لاحق عن الخلافات مطياف الكتلة. واحد شرط أساسي أو الحد من هذه الخطوة هو وجود الأجسام المضادة الصحيح Vκ سلسلة ضوء والمضيف (البشرية والماوس) لتمكين الأجسام المضادة ملزمة لبروتين L الاغاروز. استخدام بروتين ملزمة المنان بد أن الاغاروز (كالي أيضاكتين د المانوز ملزم) بدلا من البروتين L الاغاروز هو بديل محتمل لimmunoprecipitate IgMs بلا قيود محددة ضوء Vκ. ومع ذلك، كما قال ارنولد وآخرون. ^35، والأجسام المضادة الغلوبولين المناعي محددة مستضد لا ربط بروتين ملزمة المنان، كما تظهر غليكان الهدف لتصبح غير قابلة للوصول مرة واحدة صر الغلوبولين المناعي للمستضد لها. وبناء على هذه النتائج المنان بروتين ملزمة لا يمكن أن تستخدم مصفوفة ملزمة لimmunoprecipitate الغلوبولين المناعي محملة مستضد الجزيئات ^35. قد تكون بدائل محتملة أخرى استخدام محددة الاغاروز الثانوية أضداد الغلوبولين المناعي مفتش ^46،47 أو استخدام الخرز المغناطيسي تنشيط سطح ^48. الأجسام المضادة الموجهة ضد IgMs يمكن أن يكون crosslinked كيميائيا لالاغاروز A أو G الاغاروز من أجل الحد من مدى الأجسام المضادة مزال مع مستضد من الفائدة. مقارنة سليمة بين أنواع مختلفة من الغلوبولين المناعي مناعي فيما يتعلق المستضدات التي تم تحديدها بنجاح طالصعب بسبب أجريت معظم immunoprecipitations لعزل أو تستنفد IgMs دون مزيد من الفائدة في المستضدات الخاصة بهم. وبالإضافة إلى ذلك، تم immunoprecipitations باستخدام IgMs تستخدم أساسا لتأكيد مستضد واحد يعرف بالفعل أو متوقع مع التعرض الأجسام المضادة لمستضدات النقاء ^49. والعيب الجماعات الحكومية الدولية، إلى جانب الاغاروز الموجهة ضد IgMs الإنسان هو العائد المنخفض جدا (10-15٪) من المصل immunoprecipitated جزيئات الغلوبولين المناعي بالمقارنة مع المواد انطلاق ^50. في المقابل، تم تطبيق حبات مغناطيسية تنشيط سطح بنجاح إلى الأجسام المضادة من isotypes مختلفة بما في ذلك الغلوبولين المناعي لimmunoprecipitate الألياف المرتبطة سكرابي ^48. لا يقتصر هذا الأسلوب لكابا محددة (Vκ) أو امدا (λ) سلاسل أو مجموعة معينة، ويمكن توسيع كبير الطيف من الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي المستخدمة في immunoprecipitations.

خطوة هامة أخرى في البروتوكول هو قدرة الأجسام المضادة لتكون بمثابة ديتecting الأجسام المضادة (الأجسام المضادة الأولية) في البقع الغربية أو منصات فحص أخرى. يجب أن الأجسام المضادة ناجحة تستهدف المستضد مع تقارب عالية بما فيه الكفاية للسماح للمستضد ملزمة في وجود المنظفات غير الأيونية أو ربما الأيونية. الأجسام المضادة تقارب عالية شائعة بين الأجسام المضادة-maturated تقارب، ولكن أقل شيوعا بين الأجسام المضادة للنمط إسوي الغلوبولين المناعي، الذي هو واحد من الأسباب التي تجعل هناك نسبيا قليل المتاحة تجاريا الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي كما كشف عن وكلاء في إعدادات البيوكيميائية. عالية تقارب ملزم من الأجسام المضادة هو شرط لimmunoprecipitations المستضدات الجزيئية والنشاف الغربية. خفض تركيزات المنظفات أو الغياب الكامل للمنظفات في المخازن الملكية الفكرية ومخازن تحلل يسمح مستضد استهداف الأجسام المضادة تقارب منخفضة عبر نطاق فاب لها. في المقابل، قدرة الأجسام المضادة لاستهداف البروتين L الاغاروز عبر جزء التيسير لها لا يتأثر إلى حد كبير بين الضوابط نمط إسوي على مجموعة من تركيزات مختلفة المنظفاتtrations. ومع ذلك، وانخفاض تركيز المنظفات في المخزن تحلل وعازلة IP يمنع اضطراب غشاء الخلية وعزل جزيئات محددة. وبالمثل، فإن انخفاض تركيز المنظفات في مخازن وصمة عار غسل الغربية (على سبيل المثال، في برنامج تلفزيوني-T) يسمح مستضد ملزم من الأجسام المضادة تقارب منخفض، ولكن في نفس الوقت يزيد ملزم غير محددة وبالتالي فهو ليس خيارا.

وجود الأساسية بروتين المستضد هو شرط آخر لهذا الأسلوب. البروتينات مع التعديلات posttranslational (على سبيل المثال، البروتينات السكرية، البروتينات الدهنية) وبروتينات معدلة، ولكن ليس الدهون وحيدة أو الكربوهيدرات، وكشف في البقع الغربية. وليس من الممكن أن immunoprecipitate الدهون (على سبيل المثال، الإسفنجية) من الأنسجة أو الخلايا لست] في وجود أو عدم وجود المنظفات. الخصائص الفيزيائية والكيميائية المنظفات والدهون هي مشابهة جدا للسماح التفاعلات الدهون الأجسام المضادة انتقائية، بينما في نفس الوقت المنظفات ضرورية لتعطيلالأغشية من أجل السماح العزلة انتقائية من جزيئات محددة. لمعرفة أفضل لنا، immunoprecipitations تتألف فقط من الكربوهيدرات، في ظل عدم وجود جوهر البروتين، لم يتم ذكر سابقا. يصبح هذا أهمية خاصة لأن الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي كثيرا ما يستهدف الكربوهيدرات والسكرية، التي لا ترتبط بالضرورة إلى وحدة البروتين. مطلوبة الطريقتين أخرى لتحديد الفصل والمناعية من الدهون والكربوهيدرات في حالة عدم وجود نواة البروتين. على سبيل المثال، طبقة رقيقة اللوني (TLC) من الدهون الخلوية مع الكشف عن الأجسام المضادة لاحق على لوحة TLC (المناعية TLC) يمكن تنفيذها ^51،52.

وقد وصفت أضداد PSA أخرى في الدراسات والنتائج السابقة مقارنة مع HIgM12 وكذلك متاح تجاريا مكافحة PSA الغلوبولين المناعي (استنساخ 2-2B). الأجسام المضادة الأكثر استخداما في مجال دعم البرامج والإدارة هو الأجسام المضادة مفتش (استنساخ 735) متوفرة كما monoc الماوسlonal أو بولكلونل الأرنب الأجسام المضادة ^53. هذه الأجسام المضادة لمكافحة PSA مفتش بالكشف عن دعم البرامج والإدارة على SynCAM وNCAM على أنواع الخلايا الجهاز العصبي المركزي المختلفة بما في ذلك الخلايا دبيقي ^41. وعلى النقيض من الأجسام المضادة لمكافحة PSA مفتش، والأجسام المضادة الغلوبولين المناعي الإنسان HIgM12، HIgM42 ومكافحة PSA الماوس الغلوبولين المناعي (استنساخ 2-2B) غير قادرين على استهداف دعم البرامج والإدارة على SynCAM (ولكن على NCAM) في مختلف مراحل ما بعد الولادة الجنينية وأوائل في الفئران ، في حين SynCAM غير polysialylated هو كشفها بسهولة ^(15). الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي المستخدمة هي أيضا ليست قادرة على كشف PSA على الخلايا الدبقية (الشكلان 3 + 4). وثمة تفسير محتمل لاختلافات يتم ملاحظتها بين isotypes الأجسام المضادة قد يكون انخفاض مستويات PSA-SynCAM بالمقارنة مع مستويات PSA-NCAM جنبا إلى جنب مع تقارب يحتمل أن تكون أقل ملزمة من الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي بالمقارنة مع مكافحة PSA مفتش. لاختبار هذه الفرضية، أجرينا immunoprecipitations في الحيوانات NCAM KO في المرحلة الجنينية E17 مع كميات هائلة من SynCAM الحاضر وتستخدم HIgM12 ك "وكيل المنسدلة" <سوب> 15. في E17 WT littermate الضوابط HIgM12 immunoprecipitated PSA-NCAM إلى حد أن أظهر شدة مماثلة من "انزلوا" PSA-NCAM مقارنة IgMs سلسلة الثقيلة والكشف عنها بواسطة كثافة في طخة غربية اللاحقة باستخدام المضادات مزال. وتشير هذه النتيجة على الأقل تقارب كاف من HIgM12 لدعم البرامج والإدارة هدفها. وعلى النقيض من WT littermate يسيطر لم HIgM12 لم يكشف PSA تعلق على SynCAM في الحيوانات NCAM KO. وقد تم الحصول على نتائج متطابقة في immunoprecipitations باستخدام البشرية مكافحة PSA الغلوبولين المناعي HIgM42. لم يتمكنوا من استهداف دعم البرامج والإدارة على SynCAM في البقع الغربية من WT وNCAM KO الحيوانات في مراحل النمو الجنيني وبعد الولادة HIgM12 وHIgM42، فضلا عن الماوس لمكافحة PSA الغلوبولين المناعي (استنساخ 2-2B). ونظرا لكمية قليلة من HIgM12 المطلوبة (0.1 ميكروغرام / مل) للكشف على وجه التحديد دعم البرامج والإدارة تعلق على NCAM في البقع الغربية باستخدام كميات صغيرة من أنسجة الجهاز العصبي المركزي (0.1 ميكروغرام الجهاز العصبي المركزي الأنسجة لكل بئر) ¹⁵ يبدو من غير المحتمل أن الانتماءات المنخفضة وحدهامسؤولة عن انعدام تام للكشف PSA-SynCAM التي كتبها HIgM12 في ثلاث طرق مختلفة.

نخلص إلى أن هناك اختلافات كبيرة بين الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي-PSA المضادة والتي نشرت في كثير من الأحيان الأجسام المضادة لمكافحة PSA مفتش (استنساخ 735). وليس من الواضح لماذا لم تستخدم المتاحة تجاريا أضداد الغلوبولين المناعي PSA أكثر في كثير من الأحيان في الماضي لتأكيد النتائج التي تم الحصول عليها مع antiPSA مفتش الأضداد 735. وهذا هو اهتمام بوجه خاص لHIgM12 وقد ثبت بالفعل فعالية في نماذج مرضية مختلفة. في حين أن غيرها الأجسام المضادة-PSA الغلوبولين المناعي قد يكون لها آثار علاجية مماثلة يبقى من غير الواضح ما إذا كانت الأجسام المضادة لمكافحة PSA مفتش (استنساخ 735) له نتائج علاجية مماثلة في نماذج من مرض التصلب العصبي المتعدد والمرض.

وباختصار، استخدمت الأساليب المذكورة هنا في المقام الأول لتحديد المستضد من HIgM12 الأجسام المضادة البشرية التجدد لدعم التجارب السريرية المحتملة لمرض التصلب العصبي المتعدد وربما غيرها من الأمراض العصبية. تحديد نملةigens عن الأجسام المضادة مع النشاط البيولوجي هو الخطوة بأنها ضرورية لفهم آلية عملها. يصبح هذا أهمية خاصة في سياق العديد من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التي يجري اختبارها حاليا للسلامة وفعالية في التجارب على الانسان. في حين أن عدد الأجسام المضادة الغلوبولين المناعي اختبارها سريريا حتى الآن هو صغير، التطورات الحديثة في تكنولوجيا هجين جنبا إلى جنب مع عدد متزايد من الدراسات تسليط الضوء على الإمكانات العلاجية لهذه الفئة الأجسام المضادة ^{1-10،37،40،42-45} تحث تطوير جديدة أو أساليب تعديل تنطبق على تحديد غير البروتينية مستضدات الغلوبولين المناعي.

Patents for antibodies that promote remyelination and CNS repair are issued and owned by Mayo Clinic. Authors have a potential conflict of interest.

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (R01 GM092993، R01 NS048357 وR21 NS073684)، المؤسسة الوطنية للعلوم (جائزة التوظيف)، وجائزة مينيسوتا الشراكة للتكنولوجيا الحيوية وعلم الجينوم الطبية، وجمعية التصلب المتعدد الوطنية (CA1060A) ، ومركز مايو كلينيك للعلوم السريرية وبالحركة (CCATS). الكتاب يعترف بدعم من المؤسسات أبلباوم، هيلتون، بيترسون وسانفورد والقمر ومارلين صندوق لمدير حديقة والأسرة McNeilus.