Method Article
This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.
الحويصلات متشابك الافراج عن الناقلات العصبية في المشابك الكيميائية من خلال دورة ديناميكية من الانصهار واسترجاعها. رصد نشاط متشابك في الوقت الحقيقي، وتشريح الخطوات مختلفة من إكسو-الإلتقام على مستوى واحد حويصلة حاسمة لفهم وظائف متشابك في الصحة والمرض.
وراثيا ترميز تحقيقات حساسة للدرجة الحموضة المستهدفة مباشرة إلى الحويصلات متشابك وانعكاس إجمالي الداخلية المجهر مضان (TIRFM) تقديم القرار المكانية والزمانية اللازمة لمتابعة ديناميات الحويصلة. مجال زائل الناتجة عن الانعكاس الكلي الداخلي يمكن أن تثير فقط fluorophores وضعها في طبقة رقيقة (<150 نانومتر) فوق غطاء زجاجي على الخلايا التي تلتزم، بالضبط حيث عمليات إكسو-الإلتقام تحدث. هي مناسبة الناتجة صور عالية التباين مثالي لالحويصلات التتبع والتحليل الكمي من الأحداث الانصهار.
في هذا البروتوكول، SH-SY5Y ن البشريويقترح خلايا euroblastoma باعتباره نموذجا قيما لدراسة إطلاق سراح العصبي في مستوى واحد-الحويصلة التي كتبها TIRFM، بسبب سطحها مستو وجود حويصلات تفرقوا. يتم توفير الطرق لزراعة SH-SY5Y كما الخلايا الملتصقة وtransfecting لهم synapto-pHluorin، فضلا عن تقنية لأداء TIRFM والتصوير. وأخيرا، قدم استراتيجية تهدف إلى تحديد، عد، وتحليل الأحداث الانصهار عند مستويات كلها خلية واحدة حويصلة.
للتحقق من صحة نهج التحليل إجراء التصوير والبيانات، ويتم تحليل ديناميات حويصلات pHluorin الموسومة تحت يستريح وحفز (إزالة إستقطاب تركيزات البوتاسيوم) الظروف. الاستقطاب غشاء يزيد من وتيرة الأحداث الانصهار ويؤدي إلى زيادة موازية من صافي إشارة مضان سجلت في خلية كاملة. تحليل احدة حويصلة يكشف تعديلات للسلوك الانصهار الحدث (الارتفاع المتزايد الذروة والعرض). وتشير هذه البيانات عشرفي الاستقطاب البوتاسيوم ليس فقط يؤدي الى الافراج عن ناقل عصبي هائل ولكن يغير أيضا آلية الانصهار الحويصلة وإعادة التدوير.
مع التحقيق الفلورسنت المناسب، وهذا الأسلوب يمكن أن تستخدم في الأنظمة الخلوية المختلفة لتشريح آليات إفراز التأسيسي وحفز.
انتقال متشابك الكيميائية بين الخلايا العصبية هو آلية رئيسية للاتصال في الجهاز العصبي. وهي تعتمد على إطلاق النواقل العصبية من خلال دورة ديناميكية من الانصهار الحويصلة واسترجاعها في الموقع قبل المشبكي. وقد تم تحديد العديد من البروتينات المشاركة في ديناميات الحويصلة. ومع ذلك، لا تزال المساهمة المحددة لهذه الظاهرة إلى توضيح 1.
فهمنا يقتصر جزئيا بحقيقة أن المقايسات الأكثر استخداما لإكسو / الإلتقام ليست دائما الأنسب. العديد من الدراسات المتعلقة الانصهار الحويصلة وديناميكية تعتمد على تقنيات الكهربية. توفر هذه التقنية على قرار الزمني الأمثل وممتازة للتحقيق الانصهار الأولي من الحويصلات إلى غشاء البلازما ولكن غير قادرة على الكشف عن العديد من الأحداث الجزيئية الكامنة التي تدعم وظيفة قبل المشبكي. الإلكترون المجهري، على الجانب الآخر، يوفر أرقى morphologicaل وصف لكل خطوة واحدة، ولكن الجانب الديناميكي لهذا الحدث لا يمكن القبض، لأن العينات يجب أن تكون ثابتة لكي يتم تحليلها.
ظهور تقنيات التسجيل البصري الجديدة 2،3، في تركيبة مع التقدم في الفلورسنت تطوير تحقيقات الجزيئية 4-6، وتمكن التصور من العمليات exocytic في الخلايا الحية، وبالتالي توفير مستويات جديدة من المعلومات حول بنية متشابك وظيفة.
الدراسات الأولية استغلال الأصباغ التي تعتمد على النشاط styryl (FM1-43 والأصباغ العضوية ذات الصلة) 7،8. دولة من بين الفن وتقنيات التصوير توظف المتغيرات الحساسة الرقم الهيدروجيني للالبروتين الأخضر نيون (GFP) (pHluorin) المربوطة إلى الحويصلات اللمعية البروتينات 9. يتم تبديل هذه التحقيقات عادة قبالة عندما تكون موجودة في الحويصلات بسبب انخفاض درجة الحموضة اللمعية. بعد الاندماج مع غشاء البلازما، يتعرض الداخلية الحويصلة إلى الفضاء خارج الخلية محايد، ودرجة الحموضة يزيد فجأة، ويخفف من وتبريد تعتمد على بروتون من pHluorin ويظهر إشارة الفلورسنت بسرعة. كما تغير في pHluorin أسرع من الحدث الانصهار، من خلال رصد زيادات مضان، الانصهار الحويصلة مع غشاء يمكن قياسها وتحليلها. لأن endocytosed سطح جزيئات الموسومة pHluorin، إشارة مضان يعود بعد ذلك إلى المستوى القاعدي، وبالتالي فإن نفس التركيبة يمكن أن تستخدم أيضا لمراقبة الحويصلة إعادة تدوير 9.
في حين أن الموسومة حويصلة درجة الحموضة استشعار يضمن التصور فقط من تلك الحويصلات التي تلتحم حقا مع غشاء البلازما، مطلوب التصوير في القرار المكانية والزمانية عالية لوصف بالتفصيل الخطوات المتبعة في إكسو / العمليات التقامي. هذه التقنية البصرية التي توفر الدقة المكانية والزمانية الضروري هو مجموع المجهري التأمل الداخلي مضان (TIRFM)، وهو تطبيق مضان المجهري 10.
"> يحدث الانعكاس الكلي الداخلي في واجهة بين الزجاج غطاء الانزلاق والعينة. عندما يصل مسار الضوء الزجاج غطاء للانزلاق مع زاوية الحادث أكبر من الزاوية الحرجة، لا ينتقل ضوء الإثارة في العينة ولكن تنعكس تماما الظهر. وفي ظل هذه الظروف، وهو زائل أشكال موجة الضوء في واجهة ويكاثر على المدى المتوسط مع أقل كثافة ضوئية (العينة). وبما أن شدة المجال زائل يضمحل بشكل كبير، مع البعد عن واجهة (مع عمق تغلغل حوالي 100 نانومتر) فقط fluorophores في أقرب القرب من غطاء الانزلاق يمكن أن يكون سعيدا في حين أن أولئك بعيدا عن الحدود ليست كذلك. في الخلايا transfected مع GFP-يبني، هذا العمق يتوافق مع البروتينات وأعرب على غشاء البلازما أو في هياكل حويصلي الاقتراب منه. كما fluorophores في داخل الخلية لا يمكن متحمس، والتقليل من مضان الخلفية، وصورة مع إشارة / الفئران خلفية عالية جداويتكون الإعلام والتوعية 11.العديد من الخصائص تجعل TIRFM أسلوب الاختيار لرصد الحويصلات ديناميات. على النقيض من ذلك الكمال وإشارة إلى الضوضاء نسبة عالية تسمح للكشف عن الإشارات منخفضة جدا مستمدة من الحويصلات واحدة. الحصول على الصور يعتمد على الشرائح الالكترونية في كل إطار يوفر القرار الزماني اللازم لاكتشاف عمليات ديناميكية للغاية. وأخيرا، فإن التعرض الحد الأدنى من الخلايا لضوء في أي طائرة أخرى في العينة يقلل بشدة الضيائية وتمكن تسجيل طويل دائم الوقت الفاصل 12.
يبقى تحليل البيانات الجانب الأكثر تحديا وحاسم من هذه التقنية. إن أبسط طريقة لمراقبة الانصهار الحويصلة هي لقياس تراكم البروتينات مراسل فلوري على سطح الخلية، على مر الزمن 13. كما يزيد من الانصهار، صافي الزيادة إشارة مضان كذلك. ومع ذلك، وهذه الطريقة قد يقلل من شأن هذه العملية، لا سيما في الخلايا الكبيرة وفي ظروف الراحة،لأن العمليات الإلتقام وphotobleaching من تعويض الزيادة في كثافة مضان بسبب حويصلة إيماس. طريقة بديلة هو اتباع كل الانصهار حدث واحد 14. هذا الأسلوب الأخير هو حساس جدا ويمكن أن تكشف عن تفاصيل مهمة حول آليات الاندماج. ومع ذلك، فإنه يتطلب اختيار اليدوية الأحداث واحدة، لأن إجراءات مؤتمتة بالكامل لمتابعة الحويصلات وللتسجيل تذبذب إشاراتها الفلورسنت لا تتوفر دائما. مراقبة ديناميات الحويصلة تتطلب خلايا أخذ العينات في وتيرة عالية. وهذا يولد كمية كبيرة من البيانات التي بالكاد يمكن تحليلها يدويا.
على اقتراح من هذه الورقة هو تحسين تقنية التصوير TIRFM لرصد القاعدية وحفز الإفراج العصبي في خط الخلية العصبية SH-5YSY، ووصف، خطوة بخطوة، وهو إجراء المتقدمة في المختبر لتحليل البيانات، على حد سواء عند مستويات كلها خلية واحدة حويصلة.
1. الثقافة الخلية وترنسفكأيشن
التصوير 2. خلية من انعكاس إجمالي الداخلية المجهر مضان (TIRFM)
3. تحليل الصورة ومعالجة البيانات
ملاحظة: لتحليل الصور، وقد وضعت وحدات الماكرو في المختبر، استنادا إلى المهام الحالية للبرنامج تحليل الصور. تتوفر وحدات الماكرو مماثلة عبر الإنترنت (URL المقدمة في جدول المواد والمعدات).
وقد صممت هذه الإجراءات التصوير TIRF وتحليل البيانات ووصف لدراسة الحويصلات ديناميكية في الأنظمة الخلوية. يمكن استخدام هذه التقنية لتحديد آثار يشير الجزيئات والمخدرات على الأحداث الانصهار وديناميكية العصبي حويصلة 17. باستخدام بروتينات غشاء البلازما الموسومة GFP، وقد تم استخدام التحليل TIRFM لتوصيف الاتجار التأسيسي من الناقلين الغلوتامات الموسومة GFP في الدبقية والخلايا الظهارية 18،19.
للتحقق من صحة استراتيجية إجراء التصوير وتحليل البيانات المبلغ عنها، وتسجل الأحداث الانصهار تحت القاعدية وحفز الشروط (الاستقطاب الناجم البوتاسيوم)، في الخلايا العصبية SH-SY5Y transfected مع synapto-pHluorin. (فيديو 1، 2، على التوالي). يتم إجراء تحليلين مختلفة: خلايا كلها (الشكل 4) وتحليلات واحدة الحويصلة (الشكل 5).
تحليل خلية كاملة الشرق الأوسط وأفريقياسورس العدد الإجمالي للأحداث الانصهار في الخلية والتغيرات مضان صافي الناتج الناجم عن التحفيز. في الشكل (4)، وتسجل synapto-pHluorin الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل تحت يستريح وحفز الشروط (التحفيز بوكل)، وذلك باستخدام نفس البروتوكول التجريبي (التعرض الوقت، قوة الليزر، الخ). ويبين الشكل 4A أن synapto-pHluorin يتراكم في نقاط والفلورسنت متناثرة على غشاء الخلية. كما هو موضح في الأدب، إشارة الفلورسنت خافت هي أيضا موجودة في غشاء البلازما 9؛ هذه الإشارة هي مفيدة لتحديد الخلايا المراد تصويرها. في الشكل 4B، وفرضه البقع التي اختارها الإجراء التلقائي هو موضح في ورقة (القسم 3.3) إلى صورة TIRFM التي أعلن عنها في الشكل 4A. الشكل 4C يظهر تطبيع ملامح كثافة الفلورسنت من أماكن مختارة في ظل ظروف يستريح. هذه الملامح تكشف عن وجود قمم الفردية مشابهة من حيث كثافة الفلورسنتensity التي تخرج في أوقات مختلفة خلال تسجيل وربما تتوافق مع الحويصلات التي تلتحم أحيانا مع الغشاء. ويبين الشكل 4D آثار التحفيز بوكل. كما هو متوقع، الاستقطاب مع 25 ملي بوكل يثير استجابة سريعة وتظهر عدة نقاط والفلورسنت مشرقة جدا في غشاء الخلية (فيديو 2). هذه نقاط وتتوافق مع تجمع "نشره بسهولة" من الحويصلات المشبكية الحالية تحت غشاء البلازما. ويشير التحليل مدار الساعة من التغييرات الفلورسنت قياس في المراسلات من مواضع فردية وجود قمم، من كثافة مضان المتغيرة، التي تظهر فجأة بعد تطبيق التحفيز الإفرازية (الشكل 4D و4F). وذكرت نتائج التحليل خلية كاملة خلال فترة التسجيل في الشكل 4E-H. يسبب التحفيز بوكل زيادة سريعة ملحوظ في عدد الأحداث الانصهار (2.5 أضعاف على الأوضاع يستريح) (الشكل 4E-F) وفي الناتجة التغييرات كثافة مضان (9.3 أضعاف على الأوضاع يستريح) (الشكل 4G-H)، مما يدل على الإفراج العصبي الهائل.
تحليل واحدة أوقات الذروة يسمح توصيف الأحداث احد الانصهار (الشكل 5). ويبين الشكل 5A ومتتابعة صور لتمثيلية "ROI التجريبي" سجلت في ظل ظروف يستريح. على وجه الخصوص يسلط الضوء على synapto-pHluorin المسمى الحويصلة التي تدمج مع غشاء تحت منطقة TIRF. بعد إطارين، يختفي إشارة الفلورسنت، مشيرا المحتمل استرجاع الحويصلة وإعادة تحمض. الملف الشخصى مضان تطبيع المنطقة من الفائدة (الشكل 5B) يقيس زيادة في إشارة الفلورسنت في المراسلات من ظهور بقعة في المنطقة TIRF. على العكس، فإن مضان يعود إلى مستوى القاعدية بعد اختفاء بقعة (ذروة واحدةمتوسط العرض 1.91 ± 0.32 ثانية؛ متوسط ارتفاع الذروة 0.042 ± 0.005 كثافة مضان تطبيع). الشكل 5C و5D تظهر صور متسلسلة من "ROI التجريبي" سجلت تحت التحفيز بوكل والمقابلة الشخصية تطبيع كثافة مضان. لاحظ زيادة في حركة الحويصلات داخل وخارج منطقة TIRF بعد بوكل الاستقطاب.
ويتم اختيار 40 الأحداث الانصهار وتحليلها في الراحة وحفز الظروف. يتم قياس المعلمات التالية: متوسط ذروة AUC، عرض الذروة والارتفاع. يحدد عرض ذروة وقت الانصهار الحويصلة، والتعلق والإلتقام قبل إعادة تحمض وإعادة التدوير، والشكل 5G. ارتفاع ذروة يقيس التغيرات كثافة مضان الناجمة عن الانصهار الحويصلة، الشكل 5F. التغييرات في هذه المعايير تدل على آليات إيماس مختلفة. تحليل واحدة أوقات الذروة يكشف عن أن بوكل الاستقطاب تعديلطريقة الانصهار الحويصلة إلى غشاء البلازما. في الواقع، وزيادة في متوسط منطقة الذروة (3.8 ± 0.2 أضعاف على ظروف الراحة، P <0.01 عن طريق إقران اختبار t، الشكل 5E)، ارتفاع الذروة (2.75 ± 0.03 أضعاف، P <0.01 عن طريق إقران اختبار t، الشكل 5F) وعرض (2.6 ± 0.5 أضعاف، P <0.05 عن طريق إقران اختبار t. الشكل 5G) يتم الكشف في ظل ظروف حفز. عدة تفسيرات يمكن تصور لهذه النتائج. والاحتمال هو أن بوكل الاستقطاب يسبب انصهار في وقت واحد و / أو متتابعة من الحويصلات في منطقة مقيدة للخلايا. تفسير بديل هو أن الاستقطاب القوي تفضل الاندماج الكامل مقابل الانصهار عابر. في ظل ظروف القاعدية، وآلية السائدة هي التحام عابرة: أ أشكال المسام الانصهار، ودرجة الحموضة في الزيادات الحويصلة وتظهر إشارة الفلورسنت، ولكن المسام يغلق على الفور، مما يسمح السريع إعادة تحمض وإعادة التدوير. تحتشروط حفز، الحويصلة الصمامات تماما مع غشاء البلازما، وارتفاع الذروة وزيادة العرض كما الاستيلاء على مكونات غشاء الحويصلة، وإعادة تحمض وإعادة التدوير قد تتطلب فترة أطول. ونتيجة مماثلة قد تم الحصول عليها مؤخرا تحليل مثل متشابك microvesicle إيماس في الغدد الصماء β-خلايا 20.
تعيين الرقم المجهر 1. TIRF تصل. عرض تخطيطي وصورة (أقحم) من نظام المجهر TIRF. وانشاء تضم محوري المراقب Z1 بمحركات مجهر مقلوب (A)، ومتعدد خط 100 ميغاواط الأرجون ليزر ايون (B)، وعلى بعد المنزلق TIRF (C). وتظهر ضوء الليزر (الخط الأخضر) والضوء الأبيض (الخط الأصفر). يتم تصوير الخلايا باستخدام الهدف الغمر 100 × النفط. يتم التقاط الصور الرقمية على RetigaSRV تبريد كاميرا CCD السريع. المرجعوحدة LECTOR، انبعاث (488/10 نانومتر) والإثارة (تمرير الفرقة 525/50 نانومتر) مرشحات، وتلسكوب الموازاة (L1) والتركيز وأشار (L2) العدسة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. الحصول على التكوين TIRFM. (A) الكرتون تخطيطي يوضح الهدف، غطاء للانزلاق، والعينة والموقف من شعاع الليزر (الخط الأزرق). اليسار، شعاع الإثارة يسافر مباشرة من خلال واجهة تغطية الانزلاق عينة . العينة هو متحمس كما هو الحال في وضع epifluorescence مركز، وأشكال الإثارة شعاع مع العينة أقل زاوية الحادث من زاوية حرجة، وعلى ضوء ينير العينة في زاوية متغيرة. الحق، شعاع الإثارة يشكل incidزاوية الأنف والحنجرة أكبر من الزاوية الحرجة، يتم الانتهاء من الضوء المنعكس مرة أخرى في عدسة موضوعية، وينتشر حقل زائل في العينة. (B) كارتون تبين غطاء عينة والموقف من شعاع الإثارة (الدائرة الزرقاء)، التي تنبثق من هذا الهدف، خلال فترة الانتقال من epifluorescence (يسار) نحو TIRF الإضاءة (يمين). (C) epifluorescence (يسار) وTIRFM (يمين) وصور من synapto-pHluorin مضان في خلية SH-SY5Y الحية. شريط مقياس: 10 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. معالجة البيانات وتحليلها. (A) صورة TIRFM من synapto-pHluorin مضان في الحي SH-SY5Y الخلية. الساحة الخضراء يشير إلى وجود تمثيلية "ROI الخلفية". مقياس شريط 10 ميكرون. (ب) سير العمل المقترحة لROI الخلفية. من أعلى إلى أسفل:.... على مدار الساعة من التغيرات كثافة مضان قياس العائد على الاستثمار في الخلفية؛ ب تطبيع التغييرات مضان إلى القيمة مضان الأولية (F / F0)؛ ج تطبيق الانحدار المتسارع، د التصحيح ل photobleaching، ه. تقييم عتبة (مربع رمادي شفاف). (C) TIRFM صورة synapto-pHluorin مضان في خلية SH-SY5Y الحية. مربع أبيض يشير إلى وجود تمثيلية "ROI التجريبي". مقياس شريط 10 ميكرون. (D) سير العمل المقترحة لROI التجريبية. من أعلى إلى أسفل: أ مدار الساعة من التغيرات كثافة مضان، ب تطبيع البيانات إلى قيمة مضان الأولية (F / F0)؛ ج. photobleaching من التصحيح؛ دي تطبيق وظائف منطقية للكشف عن عدد الذروة، AUC والعرض والارتفاع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. تحليل خلية كاملة. (A) صورة TIRFM من synapto-pHluorin مضان في خلية SH-SY5Y الحية. وتسجل الخلايا تحت يستريح وحفز (25 ملي بوكل التطبيق) الشروط (عينات في 1 هرتز). شريط مقياس: 10 ميكرون. وتظهر (ب) المناطق التي تم تحديدها من قبل الإجراء التلقائي فرضه (اللون الأخضر) على الصورة TIRFM. (C) تطبيع ملامح كثافة مضان (F / F0) من البقع التي اختارها الإجراء التلقائي في خلية كاملة في ظل ظروف يستريح. (D) Normalizإد ملامح كثافة مضان (F / F0) من أماكن مختارة في ظل ظروف حفز. شريط على آثار تشير إلى تطبيق بوكل. (EH) عدد من الأحداث والتغيرات كثافة مضان سجلت في الخلية بأكملها تحت يستريح (الأزرق)، وحفز (الحمراء) الظروف. (E) المدرج الإحصائي تبين العدد الإجمالي للأحداث الانصهار سجلت في الخلية. (F) التوزيع الزمني للأحداث الانصهار. (G) المدرج الإحصائي تمثل التغيرات في pHluorin كثافة مضان التي تحدث في الخلية بأكملها (AUC مجموع). (H) منحنيات تبين pHluorin تغييرات كثافة مضان التراكمية بوصفها وظيفة من الزمن. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
يتم تصوير الشكل 5. وحيدة من حويصلة التحليل. (A) خلايا SH-SY5Y معربا عن synapto-pHluorin في 1 هرتز، في ظل ظروف يستريح. TIRFM تمثيلي صور متسلسلة (كل 2 ثانية) لROI تظهر synapto-pHluorin وصفت حويصلة. ROI = 40 × 35 بكسل. (B) لمحة مضان تطبيع (F / F0) من العائد على الاستثمار هو مبين في A. النجمة السوداء تشير إلى حدث الانصهار، يظهر خط العتبة. يتم تسجيل (C) والخلية نفسها تحت ظروف حفز (25 ملي بوكل)، وتظهر TIRFM تمثيلي صور متسلسلة من العائد على الاستثمار. يشار تطبيق بوكل من قبل النجمة الصفراء. (D) وصورة مضان تطبيع في المنطقة هو مبين في C يسلط الضوء على الوصول (في) واختفاء (الخروج) من الحويصلات. النجمة السوداء تشير الأحداث الانصهار، يظهر خط العتبة. (EG) خصائص الأحداث احدة حويصلة سجلت تحت يستريح (الشريط الأزرق) وحفز ( شريط الحمراء) الظروف. ن = 40 الأحداث الانصهار. (E) يسار، يشار إلى منطقة ذروة (AUC) من الضوء الأزرق؛ والحق، رسوم بيانية متوسط المناطق الذروة. ** ف <0.01. (F) اليسار، ارتفاع الذروة (ح) يشار بواسطة سهم برأسين، مركز، رسوم بيانية من متوسط ارتفاع الذروة. ** ف <0.01؛ والحق، ويحدد ارتفاع ذروة آلية الانصهار. نجم في الكرتون تشير synapto-pHluorin. (G) اليسار، يشار إلى العرض ذروة بواسطة سهم برأسين، مركز، رسوم بيانية للمتوسط عرض الذروة. * P <0.05؛ والحق، ويحدد العرض ذروة وقت حويصلة إيماس، التعلق والإلتقام. لون نجوم الأخضر عندما مضان synapto-pHluorin مرئيا والرمادي عند تشغيل-إيقاف ذلك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
يتم تسجيل الفيديو 2. خلايا SH-SY5Y معربا عن synapto-pHluorin في ظل ظروف حفز (عينات في 1 هرتز). وأشار بوكل الارواء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو.
وتعرض هذه الورقة على بروتوكول لصورة وتحليل ديناميات الحويصلات في الخلايا المفرزة، وذلك باستخدام ناقلات ترميز [كدنا الفلورسنت وTIRFM. العناصر الرئيسية في التصوير الناجحة التي قام بها TIRFM هي اختيار نموذج الخلوية وترنسفكأيشن الخلية مع المؤشرات البصرية المشفرة وراثيا الإفراج الحويصلة وإعادة التدوير.
هي مناسبة بشكل مثالي لخلايا TIRFM المتزايد تمسكا غطاء زجاجي ومسطحة بما فيه الكفاية للسماح التصور المستقر للأغشية والأحداث الانصهار. الحويصلات ينبغي من الناحية المثالية أن تفرق في الخلية بحيث بهم الاتجار، والانصهار والإلتقام ولا يمكن تصوير وكميا في مستوى واحد-حويصلة. للأسف، الخلايا العصبية لا تلبي هذه المعايير: لديهم الأشكال غير النظامية، neurites التي التي تعبر في كثير من الأحيان فوق بعضها البعض، وحويصلات يتركز الانصهار سائد في مناطق صغيرة (المناطق النشطة). لهذه المناطق من الصعب جدا لدراسة ديناميات الحويصلة التي كتبها TIRFM في الثقافات الأولية من الخلايا العصبية.
الطبقة = "jove_content"> علينا أن نظهر للمرة الأولى أن العصبية البشري خط الخلية SH-SY5Y يمكن أن يكون نموذجا بديلا قيما للتحقيق الافراج عن ناقل عصبي تحت يستريح وحفز الظروف، من خلال TIRFM. هذا خط الخلية لديه النمط الظاهري الخلايا العصبية مع هيئة الخلوي والعمليات رقيقة، وتمتلك الانزيمات لالتوليف العصبي، والبروتينات من الآلات متشابك، وإفراز منظم. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن أن تكون متباينة في النمط الظاهري العصبية ناضجة وظيفيا في وجود عوامل مختلفة، بما في ذلك حمض الريتينويك، استرات phorbol، وdibutyryl دوري AMP 21،22. الخلايا هي مسطحة بما فيه الكفاية للسماح التصور المستقر للأغشية والأحداث الانصهار في وضع TIRFM (وخاصة في خلايا الجسم) وفرقت الحويصلات نسبيا. وأخيرا، يمكن خلايا transfected بسهولة مع ترميز البلازميد البروتينات المسمى GFP أو العلامات البروتين الحساسة الرقم الهيدروجيني باستخدام الكواشف ترنسفكأيشن مختلفة. في هذا البروتوكول، وقد استخدمت PEI إلى بالنقلالخلايا. ويشكل هذا كاشف أساس معظم وكلاء ترنسفكأيشن المتاحة تجاريا وبمثابة فعالة من حيث التكلفة جدا ترنسفكأيشن ناقلات وحدها. ومن المتوقع أن الكفاءة 20٪ من ترنسفكأيشن باستخدام بروتوكول ذكرت أعلاه وهي كافية للتصوير خلية واحدة.
في حين توفر الكواشف ترنسفكأيشن مختلفة وإجراءات يجعل ترنسفكأيشن تقريبا الإجراء القياسي في SH-SY5Y وحتى في الثقافات العصبية الأولية، يجب توخي الحذر عند تسجيل وتحليل وتفسير البيانات TIRFM. TIRFM يسهل جمع المعلومات بشأن العمليات التي تحدث في أو بالقرب من الغشاء في الخلايا الحية، وتمكن من تحليل الأحداث الجزيئية الفردية من خلال الكشف عن التغييرات في إشارة الفلورسنت المستمدة من البروتينات الموسومة التي تتحرك داخل أو خارج وزائل المقدمة. ومع ذلك، يمكن عدة عوامل تعديل الإشارات الفلورية في هذه المنطقة، من دون أن يعني ذلك بالضرورة إكسو / الأحداث التقامي، وهذا يجب أن تأخذن بعين الاعتبار عند تسجيل وتحليل البيانات. ومن بين هذه التغييرات الشكلية في الخلية، وخاصة تلك المتعلقة الطائرة في التركيز تحت التعديلات الميدانية وfluorophore زائل أثناء التسجيل.
الصرفية التغييرات
يعتمد قرار عالية من التقنية TIRF على إثارة fluorophores في مجال زائل، مع عمق 100 نانومتر من واجهة الزجاج (11). هذه منطقة رقيقة جدا، ويتوقع أن تغيير الطائرة خلية في التركيز التعديلات الشكلية غير محسوس. هذا ينطبق بشكل خاص على الخلايا العصبية والخلايا التي تقدم العديد من العمليات وعرض الإزعاج وضوحا. في هذه الخلايا، ومنطقة غشاء على اتصال مع زلة غطاء أثناء تسجيل غير منتظم ويمكن أن تتغير بسرعة، مما تسبب في تقييم غير دقيقة من إيماس. لهذا السبب، كلما أمكن ذلك، من المهم لتحديد نموذج الخلوي للتحقيق. للحد من moveme خلية يمكن اليلة تكون مفيدة لمعطف الزجاج يغطي مع البروتينات المصفوفة خارج الخلية أو بولي-ل-ليسين. ومع ذلك، يجب على المرء أن نضع في اعتبارنا أن هذه ركائز قد تعديل سلوك الخلية والحويصلة ديناميات.
مصادر أخرى محتملة من التعديلات الشكلية أثناء تسجيل هي تحفيز الخلايا، بالإضافة للحلول، والتغيرات في درجات الحرارة. المحفزات قادرة على حمل الإفراج الحويصلات ضخمة (أي بوكل الاستقطاب) غالبا ما تسبب انكماش الخلية الذي يعدل من الواضح أن سطح الخلية تحت منطقة TIRF. ولذا فمن المهم لتحديد بدقة الوقت نوع، والتركيز، وتطبيق التحفيز في التجارب الأولية.
مقدمة بسيطة من الحلول في الحمام مع ماصة، بصرف النظر عن تكوينها، قد يسبب تعديل مورفولوجيا الخلايا التي إجهاد القص. لحل هذه القطع الأثرية، إضافة المتوسطة يفضل استخدام نظام نضح، وربما على اتصال مع مضخة فراغ للحد من الضوضاء.
= "jove_content"> التشكل خلية وظيفة حساسة للغاية لتغيرات درجة الحرارة بسبب البيئة التجريبية، بالإضافة المتوسطة وإضاءة ليزر مكثفة. ويتحقق التحكم في درجة الحرارة في التصوير الخلية الحية عادة باستخدام حاضنات. صغير (مرحلة أعلى) والكبيرة (الغرفة) حاضنات المتاحة. فالأولى هي مفيد للغاية ومناسبة تماما لمراقبة مزارع الخلايا، وضمان هذا الأخير على درجة حرارة ثابتة لجميع الأجهزة داخل الحاضنة، بما في ذلك جزء كبير من المجهر، وبالتالي التقليل من الانجراف التركيز الناتج عن درجة حرارة التدرج. في حالة عدم وجود نظام رقابي درجة الحرارة، فمن الأهمية بمكان أن تتوازن الخلايا، غرفة التصوير الخلية الحية، والحلول لRT وتجنب تجارب التصوير على المدى الطويل.
Fluorophore
قد يكون تغيير إشارات الفلورسنت المقرر ايضا ان التعديل من fluorophore أثناء التسجيل. والأهم هو photobleaching من 23. photobleaching من هو التحلل التي يسببها الفوتون من fluorophore. أنه يسبب عموما خسارة دائمة من مضان ويعتم من العينة لوحظ مع مرور الوقت. في TIRFM، fluorophores فقط مغلقة إلى أصل مجال زائل يمكن photobleached وphotobleached-GFP الموسومة البروتينات الغشاء لأنهم يقيمون في هذا المجال. منع يتلاشى من كثافة الانبعاثات مضان مهم جدا للحصول على صور ذات جودة عالية، واجب على الكمي المجهري مضان. مع تقريب معقول، لجزيء معين في بيئة ثابتة، photobleaching من يعتمد على الوقت ودورة من التعرض لمصدر الإثارة. في كثير من الحالات، photobleaching من يتبع وظيفة تسوس الأسي بسيطة، الأمر الذي يجعل تقييمها وتصحيح وأسهل عن طريق إجراء التسجيلات سيطرة 23. الصيغ المختلفة التصحيح / وحدات الماكرو على شبكة الإنترنت (انظر جدول المواد والمعدات)؛ في البروتوكول وexponenti بسيطةوقد تم استخدام وظيفة ال.
هناك عدة استراتيجيات للتغلب على photobleaching من. استراتيجية جيدة لمنع photobleaching من عند المصدر، على سبيل المثال، وذلك باستخدام fluorophores مع صمود عالية. لسوء الحظ، في الوقت الراهن، واختيار من تحقيقات ترميز الحمض النووي لا تزال محدودة. في هذه الحالة، وفقدان النشاط الناجمة عن photobleaching من يمكن التقليل من خلال الاستحواذ التصوير، وتحسين فترة زمنية من التعرض للضوء، وطاقة الفوتون من ضوء المدخلات وتواتر أخذ العينات.
عند استخدام المجسات الحساسة للدرجة الحموضة، مصدرا إضافيا للتعديل fluorophore أثناء التسجيل هو التحول درجة الحموضة على المدى المتوسط. حجم السائل من غرفة تسجيل عادة ما يكون منخفضا جدا وتطبيق المخدرات، قد نشاط الخلايا والأيض تعديل الرقم الهيدروجيني للمتوسطة، وخاصة في حجم صغير بين الخلية وسطح ساترة. وهذا بدوره، يغير إشارة الفلورسنت pHluorin، مما تسبب في أكثر من / تحت تقدير من حويصلة إعادةتأجير. على سبيل المثال، قد التحفيز القوية يؤدي إلى تحمض تعتمد على الكالسيوم من العصارة الخلوية وتنعكس قلونة في الفضاء خارج الخلية، مما أدى إلى زيادة مبالغ فيها في إشارة الفلورسنت 24.
لتجنب هذه المشكلة، استخدم دائما حلول التخزين المؤقت ورصد درجة الحموضة التعديلات الممكنة التي أدخلها البروتوكول المعمول بها، في التجارب الأولية. لتقدير أكثر دقة للإفراج عنهم حويصلة منبهات المسموعة، عند تحليل البيانات، ورصد إشارة مضان في منطقة من سطح الخلية دون أحداث الانصهار، واستخدام تعديلات للإشارة الفلورسنت ضمن هذه المنطقة كعامل التعديل.
في الختام، وقد وصفت طريقة لرصد وتحليل الانصهار الحويصلة وديناميكية. هذه التقنية يمكن استخدامها في مختلف أنواع الخلايا (الخلايا العصبية وخلايا الغدد الصماء) لتصور وتشريح الخطوات المختلفة لإكسو / الإلتقام، لتكشف عن دور البروتينات وpathogeni بهمالمسوخ ج في تنظيم ديناميات الحويصلة وللكشف عن آليات عمل الأدوية التي تستهدف إيماس التأسيسي وتنظيمها.
The authors declare that they have no competing financial interests.
فإن الكتاب أود أن أنوه جامعة ديلي ستودي دي ميلانو لدعم إليانا دي Cairano (زمالة ما بعد الدكتوراه) وستيفانيا موريتي (زمالة الدكتوراه). وأيد هذا العمل من قبل برنامج أبحاث جامعة PUR لCP
ونود أن نشكر البروفيسور جيريمي م هينلي، كلية الكيمياء الحيوية، جامعة بريستول، المملكة المتحدة، لpHluorin بناء والدكتور Dotti فرانشيسكو للمساعدة في تحليل البيانات، وسيلفيا Marsicano للحصول على المساعدة الفنية.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Axio Observer Z1 | ![]() | 491912-9850-000 | inverted microscope |
Multiline Argon Laser Lasos 77 | ![]() | 00000-1312-752 | multi-line (458/488/514 nm), 100 mW argon-ion laser |
Laser TIRF slider | ![]() | 423681-9901-000 | |
100X Objective | ![]() | 421190-9900-000 | Oil, NA 1.45 Alpha-Plan |
CCD Camera RetigaSRV Fast 1394 | ![]() | ||
LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter | ![]() | ||
Software | |||
Image ProPlus 6.3 Software | ![]() | spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination | |
Excel | ![]() | photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses | |
GraphPad Prism 4.00 | ![]() | statistical analysis |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved