Method Article
توضح هذه المقالة الفيديو على ميكروأري يستند أسلوب في المختبر لتحديد أهداف الجينات ومواقع الربط لمدة المنظمين استجابة النظام المكون.
في الأساليب فيفو مثل رقاقة رقاقة هي تقنيات راسخة المستخدمة لتحديد الأهداف الجين العالمية لعوامل النسخ. ومع ذلك، فإنها ليست ذات فائدة محدودة في استكشاف البكتيرية نظامين التنظيمية المكون مع الظروف تفعيل uncharacterized. هذه النظم تنظيم النسخ فقط عند تفعيلها في وجود إشارات فريدة من نوعها. منذ هذه الإشارات غالبا ما تكون غير معروفة، في المختبر ميكروأري تستند الطريقة الموضحة في هذه المقالة الفيديو يمكن استخدامها لتحديد الأهداف الجينات ومواقع الربط للمنظمين الاستجابة. هذا الأسلوب تنقية الحمض النووي تقارب رقاقة يمكن أن تستخدم لأي منظم تنقيته في أي كائن حي مع تسلسل الجينوم. ينطوي على بروتوكول يسمح البروتين الموسومة تنقيته لربط الحمض النووي الجيني المنفصمة ثم تنقية تقارب الحمض النووي المرتبط بالبروتين، يليه وضع العلامات الفلورية من الحمض النووي والتهجين لمجموعة وتبليط مخصصة. السابقة الخطوات التي يمكن استخدامها لتحسين مقايسة لspecifiكما وصف المنظمين ج. وتستخدم القمم الناتجة عن تحليل البيانات للتنبؤ مجموعة زخارف موقع الملزمة، والتي يتم بعد ذلك التحقق من صحة تجريبيا. التنبؤات عزر يمكن استخدامها لتحديد المزيد من الأهداف الجينات المنظمين استجابة orthologous في الأنواع ذات الصلة عن كثب. ونحن لشرح تطبيق هذه الطريقة من خلال تحديد أهداف ملزمة الجينات والزخارف الموقع وبالتالي توقع وظيفة لمنظم استجابة DVU3023 تعتمد على sigma54 في البكتيريا البيئية منتزعة الكبريت الشائع Hildenborough.
قدرة البكتيريا على البقاء على قيد الحياة وتزدهر اعتمادا كبيرا على مدى وهم قادرون على إدراك والرد على الاضطرابات في بيئاتهم، وهذا بدوره يعتمد على أنظمتها نقل الإشارة. وقد دعا عدد من النظم يدل على تشفير بكتيريا في "الذكاء الميكروبي"، ويمكن أن يكون مؤشرا لكلا تنوع بيئتها وقدرتها على الإحساس إشارات متعددة وتهذيب ردها 1. نظامان مكون نقل الإشارة (TCS) هي أنظمة الإشارات الأكثر انتشارا التي تستخدمها البكتيريا، وأنها تتكون من كيناز الحامض الاميني (هونج كونج) تستشعر إشارة خارجية وينقل عبر الفسفرة إلى منظم استجابة المستجيب (RR) 2. يمكن سجلات المورد دينا مجموعة متنوعة من المجالات الانتاج وسائط المستجيب مما مختلفة، لكن الرد الأكثر شيوعا هو التنظيم النسخي عن طريق الحمض النووي نطاق 1 ملزمة. إشارات لمست وظائف المقابلة من خدمات القيمة المضافةر غالبية TCSs لا تزال مجهولة.
على الرغم من أن في الجسم الحي أساليب مثل رقاقة رقاقة تستخدم بشكل روتيني لتحديد مواقع الربط الجيني لعوامل النسخ 3، فإنها يمكن أن تستخدم إلا لاثنين من الممثلين الإقليميين النظام المكون الجرثومي إذا من المعروف أن الظروف تفعيل أو الإشارات. غالبا ما تكون العظة البيئية التي تنشيط TCS هي أصعب لتحديد الأهداف من الجينات الخاصة بهم. في المختبر ميكروأري مقايسة على أساس وصفها هنا يمكن أن تستخدم لتحديد بفعالية وبسرعة الأهداف الجينات والتنبؤ ظائف TCSs. هذا الاختبار يستفيد من حقيقة أن الممثلين الإقليميين يمكن فسفرته وبالتالي تفعيلها في المختبر باستخدام جزيء صغير المانحين مثل الاسيتيل الفوسفات 4.
في هذه الطريقة، واسمه DAP رقاقة الحمض النووي للتقارب منقى رقاقة (الشكل 1)، يتم استنساخ الجين RR من الفائدة مع صاحب العلامة في E. القولونية، ويسمح للبروتين الموسومة تنقيته بعد ذلك إلى ثنائيةالثانية لالمنفصمة الحمض النووي الجيني. ثم يتم إثراء الحمض النووي ملزمة البروتين تقارب تنقية، وتتضخم الحمض النووي المخصب والمدخلات، fluorescently المسمى، المجمعة معا، وتهجين لمجموعة والتبليط الذي هو العرف لكائن من الفائدة (الشكل 1). تجارب ميكروأري تخضع لالتحف، وبالتالي يعملون خطوات إضافية لتحسين الفحص. واحدة من هذه الخطوة هو محاولة لتحديد هدف واحد لRR قيد الدراسة باستخدام فحوصات الكهربي التحول التنقل (EMSA) (انظر سير العمل في الشكل 2). ثم، بعد الملزمة لالحمض النووي الجيني والخطوات مديرية إدارة السجون، ويتم فحص الحمض النووي المرتبط بالبروتين والمدخلات التي كتبها QPCR لمعرفة ما إذا تم تخصيب الهدف الإيجابي في جزء محدد من البروتين بالنسبة للجزء المدخلات، مؤكدة بذلك الشروط الملزمة الأمثل ل RR (الشكل 2). بعد مجموعة التهجين، يتم تحليل البيانات للعثور على قمم أعلى كثافة إشارة تشير إلى مواضع الجيني حيث البروتين حالإعلان ملزمة. يمكن توقع وظائف للRR على أساس أهداف الجينات التي تم الحصول عليها. يتم استخدام مواضع الجيني المستهدف للتنبؤ الزخارف موقع ملزمة، والتي يتم بعد ذلك التحقق من صحة تجريبيا باستخدام EMSAs (الشكل 2). ثم قد يتم تمديد التوقعات الوظيفية والأهداف الجينات لRR إلى الأنواع التي تكود الممثلين الإقليميين orthologous عن طريق مسح الجينوم لتلك الزخارف ملزمة مماثلة (الشكل 2) ترتبط ارتباطا وثيقا. يمكن طريقة DAP رقاقة توفر ثروة من المعلومات عن TCS حيث سبق وكان هناك لا شيء. ويمكن أيضا أن تستخدم أسلوب لأي منظم النسخي إذا كان البروتين يمكن تنقيته ويمكن تحديد شروط ملزمة الحمض النووي، ولأي كائن من الفائدة مع تسلسل الجينوم المتاحة.
الشكل 1. ورقاقة تنقية الحمض النووي تقارب (DAP-رقاقة) استراتيجية 7. يتم استنساخ الجين RR من كائن من الفائدة مع كربوكسي محطة صاحب العلامة إلى E. سلالة التعبير القولونية. يتم تنشيط البروتين تنقية صاحب الموسومة من قبل الفسفرة مع الاسيتيل الفوسفات، ومختلطة مع الحمض النووي الجيني المنفصمة. يتم حفظ قسامة من رد فعل ملزم ال DNA المدخلات، في حين يخضع الباقي لتنقية تقارب باستخدام الراتنج ني NTA. المدخلات والحمض النووي محددة RR هي الجينوم تضخيمها، والمسمى مع CY3 وCy5، على التوالي. يتم تجميع الحمض النووي المسمى معا، وتهجين لمجموعة وتبليط، والتي يتم بعد ذلك تحليلها لتحديد الأهداف الجين. الرقم تعديل وطبعها باستخدام رخصة المشاع الإبداعي من 7.
الشكل 2. ملخص سير العمل. للحصول على أي البروتينات الموسومة تنقيتهن، تبدأ من خلال تحديد الهدف باستخدام EMSA. تسمح البروتين لربط الحمض النووي الجيني ومن ثم الحمض النووي تقارب تنقية (DAP) والجينوم تضخيم (WGA) والحمض النووي والمدخلات المخصب. إذا كان من المعروف هدفا الجين، استخدم QPCR لضمان أن الهدف معروف غير المخصب في جزء محدد من البروتين. إذا لم يتسن تحديد الهدف، الانتقال مباشرة إلى وضع العلامات الحمض النووي ومجموعة التهجين. إذا التخصيب بحلول QPCR لا يمكن ملاحظة، ثم كرر ملزمة البروتين gDNA والخطوات DAP-WGA باستخدام كميات البروتين المختلفة. استخدام تحليل مجموعة للعثور على القمم ورسم خريطة لها لاستهداف الجينات. استخدام مناطق المنبع من الجينات المستهدفة للتنبؤ الزخارف موقع ملزمة. التحقق من صحة الزخارف تجريبيا باستخدام EMSAs. استخدام الحافز لمسح الجينوم من الأنواع ذات الصلة ترميز orthologs من لوائح الراديو قيد الدراسة، والتنبؤ الجينات المستهدفة في تلك الأنواع كذلك. استنادا إلى أهداف الجينات التي تم الحصول عليها، ويمكن توقع وظيفة فسيولوجية من لوائح الراديو وorthologs لها. الرقم تعديل وطبعها باستخدام ج الإبداعيةترخيص ommons من 7.
ملاحظة: بروتوكول الواردة أدناه مصممة لتحديد الأهداف الجين من DVU3023 RR من البكتيريا الشائع Hildenborough منتزعة الكبريت. ويمكن أن تتكيف مع أي منظم النسخي الأخرى ذات الاهتمام.
1. استنساخ وتنقية RR
2. تحديد الجينات المستهدفة لRR طريق التحول الكهربي التنقل الفحص (EMSA)
3. تحقق الهدف التخصيب بعد الجينوم الحمض النووي والبروتينات ملزم
4. صفها الحمض النووي والتهجين صفيف
5. ربط الحافز تنبؤ الموقع والتحقق من صحة
6. حفظ الحافز في ذات الأنواع البكتيرية الأخرى
تم تطبيق الأسلوب أعلاه لتحديد الأهداف الجين العالمية من الممثلين الإقليميين في الحد من كبريتات نموذج بكتيريا منتزعة الكبريت الشائع Hildenborough 7. هذا الكائن لديها عدد كبير من TCSs يمثلها أكثر من 70 سجلات المورد، مما يدل على تشكيلة واسعة من إشارات الممكن أنه يستشعر ويستجيب ل. في الجسم الحي يحلل على وظائف هذه النظم مما يشير يصعب أداء منذ إشاراتها وبالتالي تفعيل الظروف الخاصة غير معروفة. هنا تم استخدام أسلوب DAP رقاقة لتحديد أهداف الجينات، وبالتالي التنبؤ الوظائف المحتملة لRR DVU3023 ممثل.
DVU3023 هو المعتمد على 54 سيغما RR المشفرة في الاوبرون مع هونج كونج وما شابه ذلك (الشكل 3A) لها. تم استنساخ الجين صاحب الموسومة C-محطة في وتنقيته من E. القولونية. للتقرير الأولي الهدف، تم اختبار RR تنقية للربط إلى الاوبرون المصب والذي هو بمثابة عشرة الجينات الاوبرون (DVU3025-3035) جonsisting اللاكتات في امتصاص والأكسدة الجينات. RR DVU3023 تحولت المنطقة المنبع من DVU3025 (الشكل 3B). سمح المقبل RR DVU3023 لربط المنفصمة D. الشائع Hildenborough الحمض النووي الجيني. على الرغم من أن الفسفرة لم يكن مطلوبا للربط إلى منطقة المروج من DVU3025، تم إضافة الاسيتيل الفوسفات إلى رد فعل في حال كان مطلوبا منها للربط إلى المروجين الأخرى. التالية تقارب تنقية الحمض النووي جزء محدد من البروتين، وكان يستخدم QPCR لاظهار ان المنطقة المنبع من DVU3025 غير المخصب (8.45 أضعاف) في جزء محدد بروتين (C T = 6.9) نسبة إلى الحمض النووي المدخلات (C = 9.98 طن ) (الشكل 3C)، مما يدل على أن الشروط الملزمة المستخدمة كانت مناسبة للRR DVU3023. وقد استخدم نقص إثراء منطقة المروج من الجينات اختيارها عشوائيا (DVU0013) كعنصر تحكم السلبية.
كانت عينات محددة من البروتين والحمض النووي المدخلات ثم fluorescently المسمى والمهجنة لوD. الشائع Hildenborough مجموعة تبليط التي كان لها كثافة عالية التحقيق في المناطق بين الجينات. وقد تم اختيار أعلى أربعة قمم مثل الأهداف الأكثر احتمالا لDVU3023 (الشكل 3D). وتلت هذه القمم الأربعة من قبل العديد من الآخرين، والتي تم تحديدها أيضا في DAP-رقاقة تحليلات لعدة سجلات المورد أخرى، وبالتالي يبدو أن الحمض النووي لزجة (الجدول 1). الشكل 3E هو تمثيل التخطيطي للجينات التي تنظمها DVU3023. كان الهدف DVU3025 إيجابية الذروة الأولى التي تم الحصول عليها وفقا لأعلى نقاط. أهداف الجينات اثنين هما permeases اللاكتات المشفرة منفردة أخرى (DVU2451 وDVU3284). لا يكمن الهدف الرابع الجين في منطقة المنبع، ولكن في المنطقة بين الجينات بين اثنين كتب convergently الجينات / operons (DVU0652 وDVU0653). هذه هي منطقة كبيرة بين الجينات، وبالإضافة إلى ذلك بترميز أيضا تعتمد على sigma54 المروج توقع. فمن الممكن أن هناك الحمض الريبي النووي الذواب المشفرة غير المكتشفة في هذه المنطقة التي هي reguذا الصلة من قبل RR DVU3023.
باستخدام مناطق المنبع من الأهداف التي حصلت عليها مديرية إدارة السجون رقاقة، وكان يستخدم للتنبؤ MEME موقع عزر ملزمة (الشكل 3F، الجدول 2). وقد صممت ركائز EMSA تحمل المنبع عزر محددة من DVU3025 للتأكد من أن DVU3023 RR تعترف ويربط عزر توقع. تم التحقق من صحة عزر مزيد بجعل بدائل في قواعد الحفظ داخل عزر الذي قضى على التحول ملزم (الشكل 3G). ثم تم استخدام هذا الحافز التحقق من صحتها في البرامج النصية ولدت بيرل لمسح متواليات جينوم أخرى ترتبط ارتباطا وثيقا كبريتات الحد من البكتيريا التي كان orthologs لDVU3023. وقد تم اختيار مواضع الجينات كأهداف ممكنة عندما كانت تقع عزر في مناطق المنبع من إطارات القراءة المفتوحة (الجدول 3). باستخدام تسلسل عزر توقع لسجلات المورد orthologous، وقد ولدت فكرة موقع ملزم الآراء (الشكل 3F) والتي تشبه إلى حد كبير سشمال شرق الحصول عليها لD. الشائع Hildenborough وحدها.
الشكل 3. تحديد الأهداف الجيني لD. منظم استجابة الشائع DVU3023. A. يتم ترميز DVU3023 في الاوبرون مع هونج كونج في وما شابه ذلك. والاوبرون المصب لديه المروج التي تعتمد على sigma54 (السهم الأسود عازمة)، وكان يستخدم بمثابة الجين المستهدف المرشح. B. تنقية RR DVU3023 ملزمة وتحولت المنطقة المنبع من DVU3025 7. C. Q-PCR من مناطق المنبع من DVU3025 (إيجابية استهداف) وDVU0013 (اختار كعنصر تحكم السلبية). E هو محدد البروتين المخصب جزء الحمض النووي، والحمض النووي هو الإدخال. D. أعلى قمم الأربعة التي تم الحصول عليها بعد التحليل DAP رقاقة. بدء وإنهاء الرجوع إلى الحمض النووي ينسق في بداية ونهاية PEاس؛ تشير النتيجة إلى نسبة R سجل 2 من رابع أعلى التحقيق في الذروة؛ روزفلت = معدل اكتشاف كاذبة؛ cutoff_p هو النسبة المئوية في قطع التي تم تحديدها الذروة. E. تمثيل تخطيطي للأهداف الجينات لDVU3023 استنادا إلى قمم DAP رقاقة. أرقام في صناديق تشير إلى عدد الذروة في D. الجينات HK-RR هي باللون الأخضر، الجينات المستهدفة في الجينات الزرقاء وغيرها في الرمادي. السهام السوداء هي عازمة المروجين sigma54 التي تعتمد، ومن المتوقع شغلها الدوائر الخضراء الزخارف موقع ملزمة. أسماء الجينات هي كما يلي: البرتغال - البيروفات فيريدوكسين مؤكسدة مختزلة؛ محاماة - لاكتات بيرمياز؛ أوكسيديز GLCD-غليكولات؛ glpC الحديد-S الكتلة بروتين ملزمة؛ منطقة التجارة التفضيلية - ناقلة أسيتيل الفسفات؛ كيناز ACK-خلات؛ lldE - اللاكتات أوكسيديز الوحيدات؛ lldF / G - لاكتات أوكسيديز الوحيدات؛ MCP - قبول-الميثيل البروتين الكيميائي F. Weblogo 8 صور من PREDicted موقع عزر ملزمة. الأعلى - المستمدة من أهداف DAP رقاقة؛ أسفل - المستمدة من مواقع الربط موجودة في الجينوم مع orthologs من DVU3023 7 G. التحقق من تنبأ موقع عزر ملزمة باستخدام EMSA. DVU3023 تحول نوع عزر البرية (ث) ولكن ليس عزر تعديل (م). يتم عرض تسلسل للزخارف وث م على الحق 7. الرقم تعديل وطبعها باستخدام رخصة المشاع الإبداعي من راجيف وآخرون 7.
الجدول 1. أعلى 20 قمم من تحليل مجموعة DAP رقاقة. ينقسم الجدول إلى ثلاثة أقسام. تظهر سمات ذروة تفاصيل القمم كما تم إنشاؤها بواسطة برامج تحليل مجموعة، حيث يشير إلى ما إذا كان الموقع تم العثور على الذروة في الجينوم أو البلازميد خارج الصبغي، بداية ونهاية الرجوع إلى لياليلاذع ونهاية مواضع للذروة، ويشير إلى نقاط نسب R 2 سجل للرابع أعلى التحقيق في الذروة، وفرانكلين روزفلت يشير إلى قيمة معدل اكتشاف كاذبة، وcutoff_p هو النسبة المئوية في قطع التي تم تحديدها الذروة. بدء تشغيل أخرى قسمين تنسيق رسم الخرائط ووضع حد للتنسيق ورسم الخرائط خريطة بداية ونهاية مواضع، على التوالي، من الذروة إلى الجينات. في هذه المقاطع يشير إلى جين حبلا حبلا ترميز الجين، أوفست يشير إلى المسافة من بداية الجين (القيم الإيجابية تدل على مواضع هو المنبع من الجين، بينما تشير القيم السلبية مواضع ضمن الجينات)، وقيمة التداخل الجينات هي TRUE إذا كانت موضع يتداخل جين، حدة مكافحة العنف العائلي يشير إلى حدة مكافحة العنف العائلي # من الجين الذي إحداثيات الخريطة ل، والوصف يدل على الشرح الجينات. جدول تعديل وأعيد طبعه باستخدام رخصة المشاع الإبداعي من راجيف وآخرون 7. الرجاء انقر هنا لعرض آلنسخة arger من هذا الجدول.
الجدول 2. متواليات تستخدم لبناء الهدف DAP رقاقة إجماع عالمي قائم عزر في الشكل 3. الجدول تعديل وطبعها باستخدام رخصة المشاع الإبداعي من راجيف وآخرون 7.
الجدول 3. الزخارف موقع ملزم لDVU3023 orthologs موجودة في غيرها منتزعة الكبريت متسلسلة والأنواع ذات الصلة. لكل الجينوم الممسوحة ضوئيا، يشار إلى اسم الحي، تليها علامة موضع لortholog DVU3023 وهويتها في المئة الى DVU3023 بين قوسين. النتيجة تشير القيمة التي تم تعيينها من قبل برنامج بيرل على أساس التشابه إلى sequen مدخلاتالمجال الاقتصادي الموحد. وصف تنص شروح الجين لجينات في الاوبرون الهدف. جدول تعديل وأعيد طبعه باستخدام رخصة المشاع الإبداعي من راجيف وآخرون 7. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الجدول.
تم استخدام أسلوب DAP رقاقة الموصوفة هنا بنجاح لتحديد الأهداف الجين لعدة سجلات المورد في منتزعة الكبريت الشائع Hildenborough 7 من الذي يظهر واحد هنا نتيجة ممثل. لRR DVU3023، واختيار الهدف الجين مرشح كان مباشرة. يقع DVU3025 المصب على الفور من الجين RR، ويتم حفظها لوائح الراديو والهدف الجينات في العديد من الأنواع منتزعة الكبريت، وبالإضافة إلى ذلك DVU3025 لديه تعتمد على sigma54 المروج توقع. يوفر EMSA طريقة بسيطة لاختبار بسرعة لوائح الراديو للربط إلى المرشح الجينات المستهدفة، ويسمح أيضا تقييم النشاط من العينة البروتين النقي، وكذلك تحديد شروط ملزمة الحمض النووي البروتين الأمثل.
ويمكن أيضا النشاط ملزمة الحمض النووي يتم اختبارها في حضور وغياب الاسيتيل الفوسفات لمعرفة ما إذا الفسفرة ضروري لالحمض النووي ملزمة. لا يتم فسفرته جميع الممثلين الإقليميين من المانحين جزيء صغير9، في هذه الحالات المنقى وما شابه ذلك كيناز أجهزة الاستشعار، إن وجدت، يمكن أن تستخدم لتنشيط البروتين. هناك أيضا سجلات المورد شاذة المعروفة التي تفتقر بقايا موقع نشط رئيسي في مجال الاستقبال وعدم تفعيلها من خلال الفسفرة 10. بالنسبة لغالبية الممثلين الإقليميين درس، الفسفرة يحفز الحمض النووي ملزمة 11. ولكن هناك أمثلة حيث لا يؤثر الفسفرة في الحمض النووي في المختبر ملزمة 12، وهناك أمثلة حيث هو مطلوب للربط الفسفرة 13، وكذلك الحالات التي يكون فيها فرعية من المروجين ملزمة الزيادات مع الفسفرة 14. طريقة DAP رقاقة يمكن أداؤها مع وبدون الفسفرة لتحديد ما إذا كان هناك اختلافات في مجموعة من المروجين ملزمة RR. ومع ذلك، تجدر الإشارة أيضا إلى أن بعض الممثلين الإقليميين يمكن تنقيته في شكل فسفرته وظيفيا من E. القولونية 13.
بروتوكول الموصوفة هنا هو لصاحب البروتينات الموسومةن مثل أن الحمض النووي ملزمة البروتين هو تقارب تنقيتها باستخدام ني NTA الراتنج الاغاروز، ولكن يمكن بسهولة أن تتكيف لأي نوع من البروتين الموسومة باستخدام راتنج تقارب المناسبة لالمنسدلة. الخطوات التالية DAP-WGA، ويوفر الخطوة QPCR عنصر تحكم إضافية لضمان أن الشروط ملزمة البروتين gDNA كانت المناسبة والتي تم التخصيب الحمض النووي المرتبط بالبروتين بنجاح من قبل تنقية تقارب. تخصيب أكبر من 3 أضعاف ما يكفي للمضي قدما في الخطوة التهجين. على عكس رد الفعل EMSA، لا يوجد منافس الحمض النووي غير محددة مثل وأضاف بولي dI.dC إلى gDNA رد فعل ملزم لأنه يتداخل مع خطوة WGA. ونتيجة لهذا إذا كان له نشاط البروتين عينة الحمض النووي ملزم غير محددة ثم تخصيب اضحة من الحمض النووي المستهدف أكد لن يتم مراعاتها من قبل QPCR. وبالتالي فإن خطوة السيطرة QPCR يمكن استخدامها لتحسين كمية البروتين المستخدمة في رد فعل ملزم gDNA. مجموعات المتاحة تجاريا لكامل الجينوم التضخيم يدعون INTRالعامة oduce أي تحيز التضخيم عند اتباع المبادئ التوجيهية من أجل الحد الأدنى المواد الحمض النووي البداية وانخفاض عدد دورات التضخيم. يمكن مراجعة التحيز التضخيم باستخدام QPCR مع مختلف مجموعات التمهيدي على تضخيم الحمض النووي مقابل unamplified. ويمكن أيضا أن تحدد أي تأثير على مجرى النهر مجموعة التهجين عن طريق وضع العلامات تفاضلي والتهجين المجمعة تضخيمها وunamplified الحمض النووي الجيني.
قائمة من القمم التي تم إنشاؤها بعد تحليل بيانات مجموعة عادة طويلة مع عدة قمم وجود قيمة معدل اكتشاف كاذبة من 0. ولذلك مزيج من سمات ذروة أخرى مثل سجل ارتفاع 2 عشرات R والقيم cutoff_p (كما ولدت من خلال تحليل مجموعة وتستخدم البرمجيات المستخدمة في هذه الدراسة) لاعدام القائمة أسفل إلى أعلى الأهداف الجينات الثقة. وجود هدف محدد مسبقا الجينات بين أفضل خمسة إصابات يعزز إلى حد كبير من الثقة في مجموعة البيانات. أداء هذا الاختبار لعدد من البروتينات التنظيمية جيئة وذهابام سوف نفس الحي يساعد أيضا على تحديد "لزجة" تسلسل الحمض النووي التي تظهر في العديد من مجموعات البيانات 7. بالإضافة إلى ذلك إذا كان من الممكن توقع موقع عزر ملزمة والتحقق من صحة ثم وجود الحافز في قمم خفض أسفل في القائمة يمكن أن تستخدم أيضا لاختيار قائمة الجينات المستهدفة المحافظة. إثراء تسلسل الحمض النووي بخلاف مناطق المروج قد تكون القطع الأثرية من مجموعة التهجين أو قد تشير إلى تنظيم إطارات القراءة المفتوحة مجهولة سابقا أو الرنا صغيرة 7. للمنظمين حيث لا يمكن سلفا هدف الجينات باستخدام EMSA، قد يتم تنفيذ الفحص DAP رقاقة "العمياء" 7. في مثل هذه الحالات أيضا، تحديد موقع عزر ملزمة من شأنها تحسين اختيار الأهداف الجينات. سوف تحديد تركيز البروتين لاستخدامها في فحص تعتمد على النشاط غير محددة وملزمة من البروتين، والتي يمكن تقييمها من قبل EMSA باستخدام الحمض النووي ركائز اختيارها عشوائيا. تركيزات أقل تعمل على نحو أفضل لرالبروتينات خرطوم مع ارتفاع النشاط ملزمة غير محددة. موثوقية أعمى DAP رقاقة يمكن أن يتحسن عن طريق إجراء فحوصات تكرار مع تركيزات بروتين مختلفة. لسجلات المورد مع عدد قليل من الأهداف، قد يكون اثنين فقط أو حتى فحص واحد كافية لإنشاء قائمة المستهدفة التي يمكن التحقق من صحتها باستخدام EMSAs اللاحقة. البيانات DAP رقاقة لمثل سجلات المورد عادة ما تظهر قفزة واضحة في عشرات R سجل 2 أو القيم cutoff_p وراء قمم القليلة الأولى. لسجلات المورد مع العديد من الأهداف، ويمكن تحليل البيانات من ثلاثة مكررات لإنشاء قائمة من القمم المشتركة، والبعض منها قد يكون محددا للمصادقة EMSA.
القدرة على التنبؤ الزخارف موقع ملزمة استنادا إلى الأهداف DAP رقاقة يضيف إلى قيمة هذا الأسلوب ويزيد بشكل كبير من المعلومات المكتسبة. يوفر EMSA مرة أخرى بروتوكول للتحقق من كفاءة تجريبيا التوقعات. مخطوطات برامج في بيرل أو لغة برمجة أخرى يمكن استخدامها للبحث بسرعة عن طريق المتاحة seque الجينومالامتحانات التنافسية الوطنية. فإن نتائج تحديد كل الجينات المستهدفة orthologous وكذلك الجينات المستهدفة ينظم فريد في الجينوم البحث. في النتيجة ممثل هو موضح هنا، وثلاثة من المناطق المستهدفة المنبع الأربعة المحددة لDVU3023 والمشروح وظائف الجينات المتعلقة امتصاص اكتات والأكسدة. بالإضافة إلى ذلك منذ أن تم التحقق من صحة موقع عزر ملزمة لDVU3023، يمكن البحث عن المواقع الأخرى الجينوم عزر مماثلة. معا تشير النتائج إلى أن DVU3022-3023 TCS يتم حفظها جيدا في منتزعة الكبريت وغيرها من البكتيريا والحد كبريتات ذات الصلة، وأنه ينظم الجينات للنقل اللاكتات والأكسدة لخلات. منذ اللاكتات هو الكربون والإلكترون المصدر الرئيسي المستخدمة من قبل هذه الكائنات، DVU3023 من المرجح ان يلعب دورا رئيسيا في علم وظائف الأعضاء الخاصة بهم. من بين أعلى قمم DAP-رقاقة لRR DVU3023، كان هناك أيضا منطقة بين الجينات. على الرغم من أن موقع عزر ملزمة لم يتم العثور في هذه المنطقة، وجود سيغما تعتمد على 54 مروجا وتوقع يوحي رقبعة قد تكون هناك ORF مجهولين أو الحمض الريبي النووي الذواب المشفرة، وأنه يمكن أن يكون هدفا صحيحا لDVU3023. هذه النتيجة يسلط الضوء على قيمة النهج DAP رقاقة التجريبية جنبا إلى جنب مع التنبؤات موقع ملزم بدلا من تحديد المواقع المستهدفة على أساس التنبؤات الحسابية وحدها.
أساليب مماثلة في المختبر مثل واحد هو موضح هنا تم استخدامها فقط في حالات قليلة جدا، ونادرا ما 15-17 لمنظم غير مدروسة مسبقا. التحسين EMSA وQPCR الخطوات قبل التهجين مجموعة سوف تساعد إلى حد كبير في تحليل النتائج عند هذه الطريقة التي ستستخدم لمنظم الرواية. إذا أصبح عائقا مجموعة الطباعة، ويمكن الجمع بين الخطوات DAP مع الجيل القادم التسلسل للحصول على مواقع الربط 18،19. كما مزيد من الأساليب المستندة إلى مجموعة تصبح استبداله مع الاستراتيجيات القائمة على التسلسل، مثل التكيف المستقبلي للطريقة تلتف على الحاجة لتصميم ميكروأرس تبليط مخصصة لسrganism من الفائدة. التكنولوجيات رقاقة تسلسل يؤدي إلى مزيد من حساسية وخصوصية كشف عن القمم بالمقارنة مع الأساليب رقاقة رقاقة، وأيضا أصبحت بسرعة أكثر فعالية من حيث التكلفة 20. على الرغم من أن هذه المادة تركز على اثنين من المنظمين استجابة عنصر، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم في أي عامل النسخ حقيقية النواة بدائية النواة أو 15. إشغال النيوكليوسومات غالبا ما يكون لها تأثير على الأهداف التي تنظم ومقارنة الهدف المواقع لعوامل النسخ حقيقية النواة من قبل في الجسم الحي في المختبر ملزمة وتحليلات يمكن أن تكشف عن هذه الآثار 21.
والكتاب ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها.
نشكر ايمي تشن لمساعدتها في التحضير لتصوير الفيديو ولإظهار هذه التقنية. هذا العمل الذي قامت به ENIGMA: النظم البيئية والشبكات المتكاملة مع الجينات الجزيئية وجمعيات (http://enigma.lbl.gov)، وهو برنامج مجال التركيز العلمي في مختبر لورنس بيركلي الوطني، وبدعم من مكتب العلوم ومكتب البيولوجية و البحوث البيئية، من وزارة الطاقة في الولايات المتحدة بموجب العقد رقم DE-AC02-05CH11231.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
HisTrapFF column (Ni-Sepharose column) | GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA | 17-5255-01 | |
Akta explorer (FPLC instrument) | GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA | ||
HiPrep 26/10 Desalting column | GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA | 17-5087-01 | |
Qiaquick Gel extraction kit | Qiagen Inc, Valencia, CA, USA | 28704 | |
Biotin-labeled oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | N/A | |
6% polyacrylamide-0.5x TBE precast mini DNA retardation gel | Life Technologies, Grand Island, NY, USA | EC63652BOX | Alternately, you can pour your own gel. |
Nylon membrane | EMD Millipore, Billerica, MA, USA | INYC00010 | |
Trans-Blot SD Semi-dry electrophoretic transfer cell | Biorad, Hercules, CA, USA | 170-3940 | |
Extra thick blot paper, 8 x 13.5 cm | Biorad, Hercules, CA, USA | 170-3967 | |
UV crosslinker Model XL-1000 | Fisher Scientific | 11-992-89 | |
Nucleic Acid chemiluminescent detection kit (Pierce) | Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA | 89880 | |
Ni-NTA agarose resin | Qiagen Inc, Valencia, CA, USA | 30210 | |
GenomePlex Whole genome amplification kit (Fragmentation buffer, library preparation buffer, library stabilization solution, library preparation enzyme, 10x amplification master mix, WGA polymerase) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | WGA2-50RXN | |
Nanodrop ND-1000 | Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA | For quantitation of DNA | |
Perfecta Sybr Green SuperMix, with ROX | Quanta biosciences | 95055-500 | Any Sybr Green PCR mix may be used |
PlateMax Ultra clear heat sealing film for qPCR | Axygen | ||
[header] | |||
96-well clear low profile PCR microplate | Life Technologies, Grand Island, NY, USA | PCR-96-LP-AB-C | |
Applied Biosystems StepOne Plus Real time PCR system | Life Technologies, Grand Island, NY, USA | 4376600 | Any real time PCR system may be used |
Qiaquick PCR purification kit | Qiagen Inc, Valencia, CA, USA | 28104 | Any PCR clean up kit may be used |
Cy3/Cy5-labeled nonamers | Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USA | N46-0001, N46-0002 | |
Klenow polymerase 50,000 U/ml, 3'-5' exo- | New England Biolabs, Ipswich, MA | M0212M | |
Hybridization system | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | This company no longer makes arrays or related items, so alternate sources such as Agilent or Affymetrix will need to be used. |
Custom printed microarrays and mixers | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | |
Hybridization kit (2x Hybridization buffer, Hybridization component A, Alignment oligo) | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | |
Wash buffer kit (10x Wash buffer I, II, III, 1 M DTT) | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | |
GenePix 4200A microarray scanner | Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA | This model has been replaced by superior ones | |
GenePix Pro microarray software | Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA | ||
Nimblescan v.2.4, ChIP-chip analysis software | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved