الكبار ماوس وريدي ارتفاع ضغط الدم نموذج: الشريان السباتي المشترك لجهات خارجية الوداجي الوريد التحام.

نحن تصف طريقة لخلق نموذج موثوق من ارتفاع ضغط الدم الوريدي الدماغي في الماوس الكبار. وقد وصفت على نطاق واسع هذا النموذج واختبارها في الفئران. هذه نظيره جديد في الفئران يفتح إمكانية استخدام الحيوانات المعدلة وراثية، وبالتالي يوسع تطبيقات النموذج.

فهم الفيزيولوجيا المرضية من تشوهات الشرايين والدماغ والشرايين والأوردة الناسور قد تحسنت بفضل النماذج الحيوانية. نموذج الفئران خلق الناسور الاصطناعي بين الشريان السباتي المشترك (CCA) والوريد الوداجي الخارجي (EJV) وقد وصفت على نطاق واسع وأثبت ممكنا من الناحية التقنية. هذا التصور يثير ارتفاع ضغط الدم الوريدي الدماغي ثابت (CVH)، وبالتالي ساعدت دراسة مساهمة ارتفاع ضغط الدم الوريدي إلى تشكيل، والأعراض السريرية، والتشخيص من الألغام المضادة للمركبات الدماغ وAVFs السحائي. تم نماذج الفئران تعادل وصف نادرا فقط وأظهرت مشكلة مع تضيق من الناسور. ومن شأن نموذج الفئران أنشئت تسمح دراسة الفيزيولوجيا المرضية ليس فقط ولكن أيضا العلاجات الجينية المحتملة لهذه الأمراض الدماغية الوعائية.

نقدم نموذجا للشرياني الناسور الذي ينتج ارتفاع ضغط الدم الوريدي داخل الجمجمة دائم في الماوس. المجهرية مفاغرة سو على الفئران CCA وEJV يمكن أن يكون صعبا نظرا لضآلة علم التشريح ويؤدي في كثير من الأحيان في الناسور غير البراءات. في هذا البروتوكول خطوة بخطوة نعالج جميع التحديات الهامة التي واجهتها خلال هذا الإجراء. تجنب تراجع المفرط للالوريد خلال التعرض، وذلك باستخدام خيوط 11-0 بدلا من 10-0، وجعل مفاغرة المخطط لها بعناية نهاية إلى الجانب هي بعض الخطوات الحاسمة. على الرغم من أن هذه الطريقة تتطلب مهارات المجهرية المتقدمة ومنحنى التعلم الطويل الذي يعادل في الفئران، ويمكن تطويرها باستمرار.

وقد تم تصميم هذا النموذج رواية لدمج تقنيات الماوس المعدلة وراثيا مع نظام تجريبي سابقا الراسخة التي أثبتت مفيدة لدراسة الألغام المضادة للمركبات الدماغ وAVFs السحائي. عن طريق فتح إمكانية استخدام الفئران المعدلة وراثيا، طائفة واسعة من نماذج صالحة يمكن أن يتحقق ويمكن أيضا اختبار المعالجات الجينية. ويمكن أيضا لبناء التجريبية أن تتكيف أيضا على دراسة بعد التمديدأمراض لها الدماغية ذات الصلة مع ارتفاع ضغط الدم الوريدي مثل الصداع النصفي، وفقدان الذاكرة العالمية عابرة، والعمى أحادي عابر، الخ

وقد أثبتت النماذج الحيوانية من ارتفاع ضغط الدم الوريدي الدماغي ليكون أداة رئيسية في فهم الفيزيولوجيا المرضية من تشوهات الشرايين والدماغ والشرايين والأوردة الناسور ^1-7. الأكثر استخداما هو نموذج الفئران التي تم إنشاؤها من خلال الناسور الاصطناعي بين الشريان السباتي المشترك (CCA) والوريد الوداجي الخارجي (EJV)، والذي يثير ثابت ارتفاع ضغط الدم الوريدي الدماغي (CVH) في الفئران ^1،8-10. نماذج الفئران ما يعادلها، عن طريق فتح إمكانية استخدام مختلف سلالات الفئران المعدلة وراثيا، من شأنه أن يسمح مزيد من الدراسة على الفيزيولوجيا المرضية وليس فقط ولكن أيضا العلاجات الجينية المحتملة لهذه الأمراض الدماغية الوعائية. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا بناء التجريبية أن تتكيف أيضا على دراسة الأمراض القلبية الوعائية الأخرى ذات الصلة مع ارتفاع ضغط الدم الوريدي مثل الصداع النصفي، وفقدان الذاكرة العالمية عابرة، والعمى أحادي عابر، الخ ¹¹ ولكن المحاولات السابقة لبناء هذه النماذج الفئران حأظهرت افي الصعوبات مع المباح من الناسور بسبب التشريح ضآلة ^5،12. هنا، نحن تصف لدينا بروتوكول خطوة بخطوة لمفاغرة الناجحة للالفئران CCA وEJV أن يترجم إلى ناسور براءات الاختراع على المدى الطويل وارتفاع ضغط الدم الوريدي دائم في الماوس.

1. إعداد ماوس

1. لحث التخدير العام في الماوس مع الغاز الأيزوفلورين. حقن 0.15 مل من brupenorphine داخل الصفاق لإدارة الألم. قبل المتابعة، تحقق إذا كان مستوى التخدير هو مرض من وخز الكفوف الفأر.
2. ضع الماوس في ظهري الاستلقاء مع الأطراف الأربعة التي يحددها شريط لاصق. إزالة الشعر من الرقبة وأعلى الصدر مع مقص. عن طريق الحقن تحت الجلد، إدارة 0،2-0،4 مل من المياه المالحة 0.9٪ للحفاظ على الماوس رطب خلال إجراء العمليات الجراحية.
3. إعداد حقل من المنطوق التالية طريقة عقيمة صارمة. يجب تنظيف المنطقة من شق الجلد مع 90٪ كحول.

2. تشريح الشريان السباتي المشترك والخارجية الوداجي الوريد

1. جعل خط الوسط شق عنق الرحم أفقي عبر منطقة الرقبة أقل من الفأرة. بعد تعميق الجرح، ورفع الغدد اللعابية والأنسجة اللينة عنق الرحم باستخدام فيخياطة raction (الشكل 1). فضح الصحيح الوريد الوداجي الخارجي (EJV) الجانبي لعضلة القصية الترقوية الخشائية (SCM). يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة تحت المجهر، منذ الجر الزائد على الوريد قد يضر به وحمل تخثر لها.
2. تشريح بعناية EJV الصحيح على طول مجراه من الترقوة إلى قاعدة الجمجمة. عادة الملقط القطبين الكهربائية، وتجلط وتقسيم أي فروع لإعداد طول كاف لاحق وضع مقطع مؤقت ومفاغرة.
3. الأفقي إلى القصبة الهوائية وسطي إلى SCM، واستكشاف الشريان السباتي المشترك (CCA). كان ينبغي أن تتعرض بعناية من الترقوة إلى أبعد من مجرد التشعب لها في الشرايين السباتية الخارجية والداخلية. خلال هذه الخطوة، ينبغي إيلاء اهتمام مرة أخرى لتجنب الجر المفرط للEJV التي يمكن أن تضر وقت لاحق من المباح من مفاغرة.

3. إعداد التحام

1. Ligate التقييم القطري المشترك مع 10-0 نيويوركخط الطول القريبة فقط إلى التشعب به. المقبل، تطبيق مقطع مؤقت خلال الداني CCA أقرب إلى الترقوة وقت ممكن.
2. وبمجرد توقف تدفق، القطع الشريان فقط تحت ضمد التشعب ولري مع المياه المالحة لتغسل أي دم المتبقية داخل التجويف. تجنب تخثر القطبين في هذه الخطوة، لأن الإصابة الحرارية لجدار الشريان يمكن أن يضع مفاغرة في المستقبل للخطر.
3. من أجل تحسين وضوح حواف EJV، يتم وضع علامة على جدار وسطي بالقلم بمناسبة الأزرق على طول مسار فصد المخطط لها. مرة واحدة يتم وضع علامة على EJV، استخدم 10-0 خياطة لligate نهاية البعيدة كما الذيلية ممكن وتطبيق مقطع الأوعية الدموية مؤقت على نهاية القريبة كما الجمجمة ممكن.
4. مع 30 G إبرة و 0.5 مل حقنة غرامة، وجعل فتحة الأولية على المنطقة ملحوظة من EJV وعلى الفور لري التجويف مع المياه المالحة لتجنب تشكيل خثرة. وبعد ذلك، تمديد فصد مع microscissorsحتى طول حوالي 2-3 مرات القطر من CCA. تجنب العنف تمتد وإيلاء الاهتمام للحفاظ على القطع الحادة وأنيق الحافة.
5. التقريبي نهاية CCA إلى EJV. وجعل شق قطع الجانب في نهاية الجهات المانحة للCCA لضبط القطر لطول لحجم فصد (الشكل 2).

4. النهاية إلى جنب التحام

1. استخدام 11-0 حيدة النايلون خياطة لمفاغرة CCA-إلى-EJV نهاية إلى الجانب. خياطة الجدار الأنسي من مفاغرة في اتجاه craneo الذيلية هي الخطوة الأولى. يجب وضع كل غرزة من خارج في جدار الوريد أولا (الشكل 3) ومن من الداخل إلى الخارج جدران الشرايين (الشكل 4) المقبل. هذا وسوف تبقي عقدة على السطح الخارجي للسفن المفاغرة في جميع الأوقات (الشكل 5). إما توقف أو خيوط مستمرة يمكن استخدامها، ولكن ينبغي تشديد جميع الغرز مستمرة كخطوة نهائية.
2. ONCE تم خياطة الجدار الأنسي، كرر الإجراء من الذيلية لالجمجمة مع الجدار الجانبي. الآن يجب أن توضع كل غرزة من خارج في جدران الشرايين أولا ومن من الداخل إلى الخارج الجدار الوريدي المقبل. سوف الري المالحة تساعد على الحفاظ على التجويف من مفاغرة مرئية في جميع الأوقات أثناء العملية.
3. بعد الانتهاء من جميع الخطوات من مفاغرة، وإزالة مقطع مؤقت من الوريد أولا ومن الشريان المقبل. فإن تدفق الدم في الشرايين في EJV مع عدم وجود أو ناز القليل من مفاغرة (انظر الفيديو VH نموذج وVH نموذج ^2). يجب أن يتوقف النزيف الحد الأدنى من دون استخدام ضغط القطن خلال مفاغرة. يجب تجنب هذا من أجل منع تجلط الدم من الوريد دقيق.
4. مرة واحدة تدفق نابض من خلال مفاغرة تأكيد ويلاحظ عدم وجود نزيف واضح، لري الجراحي الميداني مع المياه المالحة وإغلاق شق عنق الرحم مع خياطة 6-0 النايلون. وأخيرا، إدارة 0.15 مل أكثر من intrapbrupenorphine eritoneal لإدارة الألم بعد العملية الجراحية و0،2-0،4 مل من تحت الجلد 0.9٪ المالحة لتجديد أي فقدان الدم أثناء الجراحة.

وهناك نتيجة ناجحة للنموذج هي شرياني الناسور براءات الاختراع أن يدفع ارتفاع ضغط الدم الوريدي في الدماغ الفئران. للتحقق من صحة النموذج الذي يقاس في البداية الضغط الوريدي داخل الجمجمة في الجيوب الأنفية sagital من الفئران في 2 و 3 و 4 أسابيع بعد الجراحة. تم تعيين 6 الفئران مختلفة لكل مجموعة الوقت. وكان ضغط الجيوب الأنفية قياس 8.8 ± 1.2 مم زئبق في المجموعة أسبوعين بعد الجراحة. في 6 الفئران قياسها بعد 3 أسابيع من الجراحة، وكان ضغط الجيوب الأنفية 4.7 ± 1.4 مم زئبق. وأخيرا، ويقاس على 6 الفئران 4 أسابيع بعد الجراحة كان ضغط الجيوب الأنفية 3.9 ± 0.6 مم زئبق (الشكل 6). كان ما بعد الجراحة 2 الاسبوع ضغط الجيوب الأنفية أعلى بكثير من الضغط في الجيوب الأنفية 3 و 4 أسابيع (سواء p <0.001).

ومع ذلك، فإن تقنية المعقدة المطلوبة لقياس ضغط الجيوب الأنفية ليست ضرورية لضمان المباح الناسور وارتفاع ضغط الدم الوريدي على أساس منتظم. بدلا من ذلك، يمكن أن النتيجة المرجوة يكون جhecked عن طريق التفتيش المباشر للناسور وعلامات سريرية من ارتفاع ضغط الدم الوريدي في الماوس.

والمباح من الناسور يمكن أن تفقد مباشرة في نهاية العملية الجراحية من قبل اثنين من الأساليب. يتكون أول واحد من مؤقتة عرقلة الجمجمة EJV إلى المنطقة anastomsis مع ملقط والمجوهرات. هذه النقطة هي الآن تدفق الوحيد من الدم القادم من CCA. إذا كان مفاغرة نهاية إلى الجانب هي براءات الاختراع، فإن EJV قابل للنفخ بالون على الفور كما هو موضح في الفيديو اختبار المباح 1. الطريقة الثانية يتم تنفيذها بواسطة تسد القاصي الوريد الكسب غير المشروع إلى مفاغرة وببطء تفريغها أو "حلب" من مع زوج من ملقط المجوهرات. كما هو موضح في الفيديو الثاني لاختبار المباح، مرة واحدة يتم الافراج عن انسداد، يجب أن مفاغرة براءات الاختراع إعادة ملء بسرعة قطاع تفرغ.

إذا كان يعمل هذا النموذج، وتجدر الإشارة إلى توسيع العين الماوس 24 ساعة بعد الجراحة. هذا أماهذ يكون راجعا إلى تتألف التصريف الوريدي من الرأس والرقبة. على الرغم من أن كلتا العينين الحصول على مكبرة بعد الجراحة، وهذه الظاهرة هي أكثر وضوحا على الجانب تشغيلها كما يمكن ملاحظتها في الشكل 7.

الشكل 1: الجلد شق وخط منتصف شق عنق الرحم أفقي عبر منطقة الرقبة أقل من الفأرة والجر لينة من الغدد اللعابية يعرض الصحيح الوريد الوداجي الخارجي (EJV). لاحظ موقع سطحي من EJV يستدعي شق الجلد دقيق لمنع أي إصابات في الوريد دقيق.

الشكل 2: إعداد مفاغرة تم وضع علامة على الجدار الأنسي من EJV مع خط أزرق على طول مسار فصد المخطط لها. والجانب قطع INCIيتم تنفيذ سيون في نهاية الجهات المانحة للCCA لضبط قطر الشريان لطول لفصد.

الشكل (3): خارج في يتم خياطة الجدار الأنسي من مفاغرة في اتجاه craneo الذيلية مع غرزة 11-0 المركز الأول من خارج في جدار الوريد.

الشكل 4: من الداخل إلى الخارج هو الدافع وراء إبرة هنا من من الداخل إلى الخارج جدران الشرايين لإكمال خياطة في جدار وسطي في الطريقة المناسبة للحفاظ على عقدة على السطح الخارجي للمفاغرة.

الشكل 5: الحفاظ على عقدة خارج لاحظ هو.ث عقدة من خياطة انقطاع المختار في هذه الحالة يبقى خارج التجويف من السفن لتجنب تشكيل خثرة التي من شأنها أن تسد الناسور.

الشكل 6: تحليل ضغط الجيوب الأنفية يعرض هذا الرسم البياني بارت بيانيا الفرق في الضغط داخل الجمجمة الجيوب الأنفية تقاس ملم زئبقي في 2 و 3 و 4 أسابيع بعد الجراحة.

الرقم 7: جحوظ يوم واحد بعد الجراحة، وكلتا العينين تتضخم ولكن الصحيح توسيع العين (المماثل للجراحة) هو أكثر بروزا.

وقد أصيب ارتفاع ضغط الدم الوريدي الدماغي يرتبط ارتباطا وثيقا مع المظاهر السريرية أكثر شدة وسوء أحوال الطقس في المرضى الذين يعانون AVFs السحائي والألغام المضادة للمركبات الدماغ ^3. هذه الآثار من CVH وقد تم دراسة على نطاق واسع في نماذج الفئران ^1،2،8. ومن شأن نموذج مماثل في الماوس تسمح باستخدام الحيوانات المعدلة وراثيا والتي من شأنها أن تسمح في نهاية المطاف تحليل المسارات الجزيئية تشارك في التسبب في ارتفاع ضغط الدم الوريدي وعلاقته مع AVF الجافية وAVM الدماغ.

هنا، ونحن التقرير وسيلة لخلق ارتفاع ضغط الدم الوريدي الدماغي في الماوس الكبار من خلال الشريان السباتي-الوداجي الناسور نهاية إلى الجانب. هذا النموذج الجديد من شأنه أن يعزز نماذج السباتي-الوداجي الناسور موصوفة وصفا جيدا في الفئران عن طريق ترجمة ذلك إلى والماوس مما يتيح إمكانية المذكورة آنفا التحقيق في المسارات الجزيئية والعلاج الجيني.

المشاكل الشائعة التي واجهتها واقتراحات

الموالية آخر شائعblem يضر الوريد مع الجر الزائد، وضغط، أو تشريح على طول مجراه. ولذلك، فإن التعرض EJV يجب إجراء بعناية تحت المجهر لتحديد الطائرة المناسبة للتشريح. وينبغي أيضا تحديد جميع الفروع الصغيرة التي تصب عليها ومتخثر. هذا سوف تجنب النزيف غير المنضبط تتطلب ضغط الوريد، وسوف توفر ما يكفي من التكرار لتجنب التوتر المفرط.

ليس من غير المألوف أن يكون ضعف وظيفة من الناسور بعد إزالة مقاطع مؤقتة. في هذه الحالة، يجب أن تكون الخطوة الأولى نبحث عن نقاط التوتر المحتملة أو التزوي في التقييم القطري المشترك. سوف مزيد من تشريح الشريان أو استئصال جزئي للعضلة القصية الترقوية الخشائية حل هذه المشكلة. ومع ذلك، إذا استمرت ضعف وظيفة بعد هذه المناورات، لا بد من يشتبه تخثر لموقع مفاغرة. في هذه الحالة، بدلا من إعادة فتح الموقع مفاغرة وإزالة الجلطة، ونحن نوصي أداء جديدة مفاغرة الجمجمة لسابقتها. في تجربتنا، ومفاغرة الثالثة هي مستحيلة. ليس هناك ما يكفي من طول EJV والماوس لا يتسامح التخدير لهذه الفترة الطويلة من الزمن.

القيود المفروضة على تقنية

القيود الرئيسية لهذه التقنية ما يلي: (1) التشريح الصغير من السفن يتطلب مهارات المجهرية المتقدمة ومنحنى التعلم أطول من لنموذج مماثل في الفئران. (2) في كثير من الأحيان للخطر في المباح من مفاغرة التي كتبها تشكيل خثرة وطول EJV الماوس سوف تسمح فقط واحد محاولة إضافية لحل هذه المسألة؛ و (3) قد يستغرق الجراحة تصل إلى ثلاث ساعات، وفضح الماوس لفترة طويلة التخدير. ومع ذلك، في أعقاب الاقتراحات الفنية المقترحة أعلاه، والحفاظ على الماوس دافئة ورطبة أثناء الإجراء، على براءة اختراع CCA-إلى-EJV يمكن أن يؤديها بنجاح ومعدل البقاء على قيد الحياة عالية من الحيوانات التي تحققت في تجربتنا.

"jove_step"> تطبيقات تقنية

والدماغية وارتفاع ضغط الدم الوريدي نموذج موثوق ودائم في الفئران أداة هامة التي يمكن أن تخدم عددا واسعا من الأغراض في مجال البحوث الدماغية ^13-16. بإضافة التكنولوجيا خروج المغلوب من الفئران المعدلة وراثيا، ينبغي هذا النموذج الجديد تسهيل مزيد المتعلقة الجينات في الجسم الحي البحوث لجميع الأمراض المرتبطة بارتفاع ضغط الدم الوريدي الدماغي.

سابقا، وقد وصفت مؤلفين آخرين نموذج ارتفاع ضغط الدم الوريدي في الفئران واستخدمت لدراسة الفيزيولوجيا المرضية لالسحائي AVF وAVM الدماغ ^4،5،8،9. وصفنا الآن طريقة لترجمة بنجاح هذا النموذج نفسه للفئران، وبالتالي فتح تطبيقاتها المحتملة لجميع أنواع اختبار العلاج الجيني.

استنتاج

علينا أن نظهر هنا بروتوكول لتحقيق براءة اختراع CCA-إلى-EJV مفاغرة في الماوس الكبار. يوفر هذا الناسوردائم في الدماغ وارتفاع ضغط الدم الوريدي الذي كان أداة مفيدة لتطوير نماذج مختلفة المرض الدماغية في الفئران. من خلال توفير هذه الخطوة الأولية لتطوير تلك النماذج نفسها في الفئران، نفتح إمكانية اختبار المعالجات الجينية لتلك الأمراض الدماغية الوعائية.

وتمت الموافقة على إجراءات تجريبية مع الحيوانات المختبرية من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام جامعة كاليفورنيا، سان فرانسيسكو (UCSF).

الكتاب ليس لديهم تضارب محتمل في المصالح المتعلقة الأدوية والمواد المستخدمة في هذا الإجراء.

ويدعم هذا المشروع جزئيا NIH T32 GM008440 إلى اسبن ووكر، R01 NS27713 إلى وليام L.Young، P01 NS44155 إلى وليام L.Young وهوا سو، R21 NS070153 لهوا SU ومن قبل جمعية القلب الأمريكية AHA 10GRNT3130004 لهوا سو. ويدعم الدكتور آنا رودريغيز-هيرنانديز عن طريق منحة من "OBRA لا كايكسا الاجتماعي"