Araştırmamız, pulmoner fibrozisin patogenezinin altında yatan immün mekanizmaları anlamaya çalışmaktadır. Alandaki en büyük zorluklardan biri, in vitro ve in vivo modellerin insan pulmoner fibrozuna çevrilmesi olmaya devam etmektedir. Pulmoner fibrozu incelemek için bir dizi hayvan modeli mevcuttur.
En sık kullanılan modellerden biri olan bleomisin murin modelini standartlaştırmaya çalışıyoruz, böylece diğer laboratuvarların kullanması için kolayca uyarlanabilir. Pulmoner fibrozisin murin modelinde bleomisin uygulamak için minimal invaziv, yüksek tekrarlanabilir ve güvenli bir yöntem sunuyoruz. Bu hayvan modeli, insan çalışmalarında in vitro olarak iltifat eder.
Patogenez için kritik olan hücre tiplerinin çalıştırılmasını içerir ve yaralanma sırasında meydana gelen ventilasyon, perfüzyon ve gaz değişimindeki değişiklikleri fizyolojik olarak çoğaltır. Histopatolojik şiddeti in vivo olarak ciddi şekilde azaltan girişimlerin daha iyi klinik sonuçlara işaret edebileceğini öngörüyoruz. Uygun kemoterapötik önlemleri izlerken kimyasal bir başlıkta bleomisin çözeltileri hazırlamaya devam edin.
İlk olarak, mililitre başına 10 birimlik bir stok konsantrasyonu hazırlamak için bleomisin tozunu steril PBS'de çözün. Kullanılan spesifik bleomisine ve deneysel hedefe bağlı olarak, vücut ağırlığına göre gerekli doza göre nihai çalışma konsantrasyonunu hazırlayın. Son uygulama hacmini ayarlamak için, bleomisini mililitre başına 0.375 birime seyreltin ve 25 gramlık bir fare için toplam 50 mililitre hacim sağlayın.
Uygun şekilde anestezi uygulanmış fareyi, orofarinksi etkili bir şekilde açmak için ön kesici dişlerinden asarak prosedürel platformda 60 ila 80 derecelik bir açıyla asın. Orofarenks yoluyla solunumu zorlamak için düz bir mikrovasküler kelepçe kullanarak burun pasajını kapatın. Forseps kullanarak, dili orofarenksten geri çekin.
Saplama yemi saplama ucuna sahip bir step pipet kullanarak, istenen hacimde bleomisin veya salin kontrolünü orofarenksin arkasına nazikçe yerleştirin. Görünür bir sıvı kabarcığının büyük ölçüde belirgin olduğundan emin olun. Fare, gözle görülür ve genellikle duyulabilir bir şekilde görünen çözeltiyi aspire edene kadar dili yerinde tutmaya devam edin.
Aspirasyon onaylandıktan sonra burun klipsini dikkatlice çıkarın. Bleomisin solüsyonunu kafesine geri koymadan önce geri akış olmadığından emin olmak için fareyi 15 saniye boyunca asılı pozisyonda gözlemleyin. Daha sonra, termo nötrlüğü korumak için hayvanı, altında bir ısıtma yastığı bulunan kafesine yan yatırın.
Ayak parmaklarını nazikçe sıkıştırın ve uyanmayı kolaylaştırmak için hayvanların ötermik kalmasını sağlayın. Fareleri, ketamin dozuna ve hayvan büyüklüğüne ve metabolizmasına bağlı olarak tipik olarak bir ila iki saat süren tam bilinçlerini geri kazanana kadar izleyin. Vücut ağırlığı, tımar, aktivite seviyesi ve solunum durumundaki değişiklikler için fareleri günlük olarak klinik olarak izleyin.
Modelin etkinliğinin önemli bir göstergesi olarak ağırlığı takip edin. Uygun zamanda, uygun şekilde ötenazi yapılmış farelerden akciğerleri toplayın. Histoloji için, akciğerleri blok üzerinde inceleyin ve 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin.
Hematoksilen ve eozin veya Masson'un trikrom kullanarak parafin gömme, bölümleme ve boyama ile devam edin. Çözünür kollajen ölçümü için sağ akciğeri homojenize edin. Akış sitometrisi için, tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için bir doku ayrıştırıcı ve enzimatik bir çözelti kullanarak sağ akciğeri sindirin.
Standart protokolleri izleyerek akış sitometrik boyama ve analiz yapın. PBS kontrolü ile karşılaştırıldığında, bleomisin ile tedavi edilen akciğer örneklerinde yedinci güne kadar alveolar septa ve küçük enflamatuar veya fibrotik alanlarda fibrotik değişiklikler gözlendi. 14. günde, normal alveolar mimarinin önemli ölçüde tahrip olmasıyla daha büyük ve daha birleşik fibrotik bölgeler ortaya çıktı.
21. günde, fibrotik değişiklikler daha önemli bir artış olmadan devam etti. Modifiye edilmiş Ashcroft skorlama sistemi, fibroz seviyelerinin 14. ve 21. günler arasında benzer olduğunu doğruladı. 14. günde gerçekleştirilen hidroksiprolin testleri, bleomisin ile tedavi edilen akciğerlerde kontrole kıyasla toplam çözünür kollajen içeriğinde bir artış olduğunu gösterdi.
Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu analizi, bleomisine yanıt olarak profibrotik genler Col1A1 ve TGFB'nin yukarı regülasyonunu gösterdi. Flow sitometri analizi, interstisyel makrofajlar, monosit kaynaklı alveoler makrofajlar ve akciğerlerdeki nötrofiller dahil olmak üzere miyeloid hücrelerin sağlam bir infiltrasyonunu ortaya çıkardı.
