Nuestra investigación busca comprender los mecanismos inmunes que subyacen a la patogénesis de la fibrosis pulmonar. Uno de los mayores desafíos en este campo sigue siendo la traducción de modelos in vitro e in vivo a la fibrosis pulmonar humana. Existen varios modelos animales para estudiar la fibrosis pulmonar.
Buscamos estandarizar uno de los modelos más utilizados, el modelo murino de bleomicina, para que sea fácilmente adaptable para que lo utilicen otros laboratorios. Presentamos un método mínimamente invasivo, altamente reproducible y seguro de administración de bleomicina en el modelo murino de fibrosis pulmonar. Este modelo animal se complementa in vitro en estudios en humanos.
Implica el funcionamiento de los tipos de células críticas para la patogénesis y replica fisiológicamente los cambios en la ventilación, la perfusión y el intercambio de gases que ocurren durante la lesión. Predecimos que las intervenciones que reducen severamente la gravedad histopatológica in vivo pueden indicar mejores resultados clínicos. Proceda a preparar las soluciones de bleomicina en una campana química mientras sigue las precauciones quimioterapéuticas adecuadas.
Primero disuelva el polvo de bleomicina en PBS estéril para preparar una concentración de stock de 10 unidades por mililitro. Dependiendo de la bleomicina específica utilizada y del objetivo experimental, prepare la concentración de trabajo final según la dosis requerida en función del peso corporal. Para ajustar el volumen final de administración, diluir bleomicina a 0,375 unidades por mililitro, asegurando un volumen total de 50 mililitros para un ratón de 25 gramos.
Suspenda el ratón debidamente anestesiado en la plataforma de procedimiento en un ángulo de 60 a 80 grados colgándolo de sus incisivos frontales para abrir eficazmente la orofaringe. Ocluya las fosas nasales con una pinza microvascular lisa para forzar la respiración a través de la orofaringe. Con fórceps, retraiga la lengua fuera de la orofaringe.
Usando una pipeta escalonada con una punta de señuelo corto, coloque suavemente el volumen deseado de bleomicina o control salino en la parte posterior de la orofaringe. Asegúrese de que una burbuja visible de líquido sea evidente. Continúe sosteniendo la lengua en su lugar hasta que el mouse aspire la solución, lo que es visible y a menudo audible.
Una vez confirmada la aspiración, retire con cuidado la pinza nasal. Observe al ratón en posición de suspensión durante 15 segundos para asegurarse de que no haya reflujo de la solución de bleomicina antes de devolverla a su jaula. A continuación, coloque al animal de lado en su jaula con una almohadilla térmica debajo para mantener la neutralidad térmica.
Pellizque suavemente los dedos de los pies y asegúrese de que los animales permanezcan eutérmicos para facilitar el despertar. Monitoree a los ratones hasta que recuperen la conciencia completa, lo que generalmente toma de una a dos horas, dependiendo de la dosis de ketamina y el tamaño y el metabolismo del animal. Monitoree clínicamente a los ratones diariamente para detectar cambios en el peso corporal, el acicalamiento, el nivel de actividad y el estado respiratorio.
Rastree el peso como un marcador clave de la efectividad del modelo. En el momento apropiado, extraiga los pulmones de los ratones debidamente sacrificados. Para la histología, diseccionar los pulmones en bloque y fijarlos en paraformaldehído al 4% durante 24 horas.
Proceda con la inclusión, el corte y la tinción con parafina utilizando hematoxilina y eosina o tricrómico de Masson. Para la medición de colágeno soluble, homogeneice el pulmón derecho. Para la citometría de flujo, se digiere el pulmón derecho utilizando un disociador de tejidos y una solución enzimática para obtener una suspensión unicelular.
Realice tinciones y análisis por citometría de flujo siguiendo protocolos estándar. En comparación con el control de PBS, se observaron cambios fibróticos en los tabiques alveolares y pequeñas áreas inflamatorias o fibróticas en muestras de pulmón tratadas con bleomicina al séptimo día. Para el día 14, aparecieron regiones fibróticas más grandes y confluentes con una destrucción significativa de la arquitectura alveolar normal.
Para el día 21, los cambios fibróticos persistieron sin un aumento más significativo. El sistema de puntuación de Ashcroft modificado confirmó que los niveles de fibrosis fueron similares entre los días 14 y 21. Los ensayos de hidroxiprolina realizados el día 14 demostraron un aumento en el contenido de colágeno soluble total en los pulmones tratados con bleomicina en comparación con el control.
El análisis cuantitativo de la reacción en cadena de la polimerasa mostró una regulación positiva de los genes profibróticos Col1A1 y TGFB en respuesta a la bleomicina. El análisis de citometría de flujo reveló una infiltración robusta de células mieloides, incluidos macrófagos intersticiales, macrófagos alveolares derivados de monocitos y neutrófilos en los pulmones.
