Organizmalar şekillerinde muazzam bir çeşitlilik gösterirler. Bu şekillerin oluşumunun, çeşitlenmesinin ve evriminin altında yatan moleküler ve hücresel mekanizmalarla yakından ilgileniyoruz. Bunu anlamak için, Drosophila'da kader tarafından belirlenen hücrelerin yetişkin bacağının son şeklini nasıl oluşturduğunu araştırıyoruz.
Canlı görüntüleme kullanarak, hücrelerin beklenmedik bir şekilde şaşırtıcı bir davranışını bulduk. Bacağın son şekil oluşumu sırasında, epitel hücreleri geçici olarak Parthenon benzeri yapı adını verdiğimiz özel yapıyı oluşturmuştur. Bu yapı, epitel hücrelerinin son şeklini oluşturdukları için genel bir özelliği gibi görünmektedir Pupa aşamasında uzun süreli canlı görüntüleme için, nemi korurken puparyumun çıkarılması önemlidir.
Bir cam tabanlı tabak ve bir damla su kullanan yöntemimiz, yeni başlayanlar için bile kararlı, güvenilir ve kullanımı kolaydır. Sonuçlarımız, hücrelerin son şekil oluşturma sürecinde beklenmedik dinamik şekil değişikliklerine uğradığını göstermektedir. Nihai şekil oluşum mekanizmalarını doğru bir şekilde anlamak için, hücre şeklindeki sürekli değişiklikleri tam olarak kavramak ve bu değişikliklerin arkasındaki mekanizmaları ve bunların morfogenez için önemini araştırmak esastır.
Ele almak istediğimiz bir sonraki sorular, Parthenon benzeri yapının geçici olarak nasıl oluştuğu ve daha ince şekil oluşumuna nasıl katkıda bulunduğudur. Başlamak için, istenen Drosophila melanogaster suşunun beyaz pupalarını şişelerden toplayın ve bir boya fırçası kullanarak tabaklara veya boş şişelere yerleştirin. Toplanan beyaz pupaları, gözlem için istenen aşamaya gelene kadar en az 14 saat boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin.
Damıtılmış suya batırılmış bir boya fırçası kullanarak, yapıştırıcıyı dikkatlice çıkarın ve yiyecekleri pupariumun yüzeyinden uçurun. Daha sonra temizlenmiş pupaları temizleme mendillerinin üzerine yerleştirin ve kuruması için birkaç dakika bekletin. Şimdi bir cam slayta bir parça çift taraflı bant takın ve kurutulmuş pupaları ventral tarafı aşağı bakacak şekilde çift taraflı bandın üzerine yerleştirin.
Kurumuş bir boya fırçası kullanarak, çift taraflı banda yapışmayı iyileştirmek için pupanın sırt tarafını hafifçe itin. Stereo mikroskop altında, pupariumun operkulumunu dikkatlice açmak için bir çift forseps kullanın. Forsepsin bir ucunu, açılan operkulumun kenarından pupa ile puparium arasındaki boşluğa sokun.
Daha sonra forsepsleri kullanarak puparyumu kavrayın ve açılana kadar dışarı doğru çekin. Puparyumun yırtık parçalarını kaldırın ve çift taraflı banda yapıştırın. Başlamak için, görüntüleme için Drosophila melanogaster pupa bacağını hazırlayın.
Kullanılan lense bağlı olarak, cam tabanlı bir tabağın dibine bir mikrolitre damıtılmış su veya silikon yağı uygulayın. Sonra bir boya fırçasını damıtılmış suya batırın ve pupayı nazikçe alın. Pupa'yı ventral tarafı aşağı bakacak şekilde tabaktaki damıtılmış su veya silikon yağının üzerine yerleştirin.
Bir mikropipet kullanarak, tabağın cam kısmının kenarına yakın bir yere 10 mikrolitre damıtılmış su ekleyin. Bir şırınga kullanarak, yemeğin cam kısmının kenarına bir daire silikon yağ sürün. Ardından, tabağı kapatmak için silikon yağın üzerine bir kapak astarı yerleştirin.
Konfokal mikroskobu ve yazılımı açtıktan sonra, pupa ile birlikte cam alt tabağı mikroskop tablasına yerleştirin ve istenen ilgi alanını görüntüleyin. Tarsustaki epitel hücreleri, puparium oluşumundan 16 saat ile 27.5 saat sonra Parthenon'u anımsatan apikobazal bazal çıkıntılar ve bazal bağlantılar oluşturmuştur. Puparium oluşumundan 41 saat ila 60 saat sonra, bacak dokusu taslağı daha belirgin hale geldikten sonra bile epitel kalınlığında ilerleyici azalma gözlendi.
