Topluluk fenotiplerini araştırmak için kistik fibrozla ilgili bir polimikrobiyal biyofilm yetiştirmek

Monokültür büyümesine kıyasla çok türlü topluluklarda fenotipik değişikliklere neden olan mekanizmaları belirlemek amacıyla, gerçek yaşam koşullarını taklit eden koşullarda büyüdüklerinde mikropların nasıl davrandığını anlamaya çalışıyoruz. Bu in vitro sistemin kullanılmasıyla, kistik fibroz hava yolu enfeksiyonları bağlamında kötü şöhretli bir patojen olan Pseudomonas aeruginosa'nın inatçılarını yönlendiren moleküler bir yolu karakterize ettik. 96 oyuklu plaka formatı ve kistik fibroz akciğerinde gözlenenleri yansıtan büyüme koşulları sayesinde, çok çeşitli mikrobiyom etkileşimlerini kolaylıkla keşfedebiliriz.

Tamamen mikrobiyom bağlamında mikropların antimikrobiyallere karşı duyarlılığını değiştirmesinin arkasındaki mekanizmalar hakkında bilgi edindik. Modelimiz, kistik fibroz araştırmalarında klinik gözlemler ve bireysel laboratuvar çalışmaları arasında bir köprü görevi görür ve çeşitli mikrobiyom etkileşimlerini incelemek için değerli bir araç sunar. Başlamak için gerekli tüm reaktifleri ve ortamı hazırlayın.

Ko-kültür deneyi için, bakteri gece kültürlerini santrifüjleyin ve hücreleri steril PBS ile yıkayın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı dikkatlice atın ve her peleti bir mililitre 1X suyla seyreltilmiş yapay balgam ortamı veya ASM bazında yeniden süspanse edin. Bir spektrofotometrede veya bir plaka okuyucuda 600 nanometrede 1 ila 10 seyreltilmiş numunenin optik yoğunluğunu ölçün.

Her bakteri örneğini 600 nanometre 0.01'de nihai bir optik yoğunluğa seyreltin ve beş saniye boyunca iyice girdaplayın. Steril plastik düz tabanlı 96 oyuklu bir plakanın üç ayrı kuyucuğuna 100 mikrolitre monokültür ve ko-kültür süspansiyonu ekleyin ve plakayı anoksik koşullarda 37 santigrat derecede 24 saat inkübe edin. Daha sonra çok kanallı bir pipet kullanarak, bağlanmamış planktonik hücreleri çıkarın ve önceden oluşturulmuş biyofilmleri 100 mikrolitre taze ASM veya istenen tedavi reaktifi ile doldurun.

Planktonik hücreleri aspire ettikten sonra, biyofilmleri 125 mikrolitre steril PBS ile iki kez nazikçe yıkayın ve yıkama solüsyonunu atın. 50 mikrolitre steril PBS ekleyin. Ve 96 pinli bir çoğaltıcı kullanarak, hücreleri plakadan nazikçe kazıyın.

Yeniden süspanse edilmiş biyofilm hücrelerini yeni bir steril 96 oyuklu plakanın A sırasına aktarın ve 10X seri seyreltme gerçekleştirin. Her seyreltme örneğinden üç ila beş mikrolitreyi agar plakalarına yerleştirin. Aşılama noktaları kuruduktan sonra, plakaları uygun şekilde inkübe edin.

Monokültüre kıyasla karışık bir planktonik toplulukta büyütüldüğünde canlı Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus hücre sayımlarının sayısında bir azalma da dahil olmak üzere çeşitli fenotipler gözlendi. Streptococcus sanguinis'in polimikrobiyal büyümesinde bir artış ve Prevotella melaninogenica'nın karışık topluluk büyümesinde bir artış gözlenmiştir.