Cultiver un biofilm polymicrobien pertinent pour la fibrose kystique afin de sonder les phénotypes des communautés

Nous essayons de comprendre comment les microbes se comportent lorsqu’ils sont cultivés dans des conditions imitant les conditions de la vie réelle, dans le but de déterminer les mécanismes à l’origine des changements phénotypiques dans les communautés multi-espèces par rapport à la croissance en monoculture. Grâce à l’utilisation de ce système in vitro, nous avons caractérisé une voie moléculaire conduisant les récalcitrants de Pseudomonas aeruginosa, un pathogène notoire dans le contexte des infections des voies respiratoires de la mucoviscidose. En raison de son format de plaque à 96 puits et avec des conditions de croissance reflétant celles observées dans le poumon de la mucoviscidose, nous pouvons explorer facilement un large éventail d’interactions entre les microbes.

Nous avons acquis des connaissances sur les mécanismes à l’origine de la sensibilité des microbes aux antimicrobiens dans un contexte entièrement microbiome. Notre modèle sert de pont entre les observations cliniques et les travaux de laboratoire individuels dans la recherche sur la fibrose kystique, offrant un outil précieux pour étudier diverses interactions du microbiome. Pour commencer, préparez tous les réactifs et milieux requis.

Pour l’expérience de co-culture, centrifugez les cultures bactériennes pendant la nuit et lavez les cellules avec du PBS stérile. Après la centrifugation, jetez soigneusement le surnageant et remettez en suspension chaque pastille dans un millilitre de milieu d’expectoration artificielle dilué 1X d’eau ou de base ASM. Mesurer la densité optique de 1 à 10 échantillons dilués à 600 nanomètres dans un spectrophotomètre ou dans un lecteur de plaques.

Diluez chaque échantillon bactérien jusqu’à une densité optique finale à 600 nanomètres de 0,01 et agitez à fond pendant cinq secondes. Ajoutez 100 microlitres de suspensions de monoculture et de co-culture dans trois puits séparés d’une plaque stérile en plastique à fond plat de 96 puits et incubez la plaque pendant 24 heures à 37 degrés Celsius dans des conditions anoxiques. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanaux, retirez les cellules planctoniques détachées et reconstituez les biofilms préformés avec 100 microlitres d’ASM frais ou le réactif de traitement souhaité.

Après avoir aspiré les cellules planctoniques, lavez doucement les biofilms deux fois avec 125 microlitres de PBS stérile et jetez la solution de lavage. Ajouter 50 microlitres de PBS stérile. Et à l’aide d’un réplicateur à 96 broches, j’ai doucement gratté les cellules de la plaque.

Transférez les cellules de biofilm remises en suspension dans la rangée A d’une nouvelle plaque stérile à 96 puits et effectuez une dilution en série 10X. Déposer trois à cinq microlitres de chaque échantillon de dilution sur les plaques de gélose. Une fois que les points d’inoculation sont secs, incubez les plaques de manière appropriée.

Plusieurs phénotypes ont été observés, notamment une réduction du nombre de cellules viables de Pseudomonas aeruginosa et de Staphylococcus aureus lorsqu’ils sont cultivés dans une communauté planctonique mixte par rapport à la monoculture. Une augmentation de la croissance polymicrobienne de Streptococcus sanguinis et une croissance communautaire mixte de Prevotella melaninogenica ont été observées.