Kalsiyum görüntüleme kaydı sırasında, hücreler her yöne doğru hareket eder. X ve Y hareketini düzeltmek için birçok araç geliştirilmiştir, ancak Z eksenindeki hareketin de açıkça teşhis edilmesi ve düzeltilmesi gerekir. TACI kullanıcı dostu bir açık kaynaklı görüntü J eklentisidir.
Z sürüklenmesini kontrol eder ve 3D kalsiyum görüntülemeyi her yöne hareket ederek analiz eder. Sinek larvalarını hazırladıktan sonra, PBS'de üç kez durulayın. Bir cam kızağın ortasına 75 mikrolitre PBS pipetin.
PBS'ye bir veya iki larva koyun ve termokupl mikrprobunu larvaların yanına yerleştirin. Larva ve termokupl mikroprobu bir cam kapak kayması ile örtün ve oje ile kapatın. Slaytı mikroskop aşamasına yerleştirin.
25 kat objektif kullanarak odağı bulun ve termo elektrikli soğutucuyu kızağın üzerine yerleştirin. Konfokal yazılımda, ilgilenilen floresan hücrelere odaklanın. Aşırı doygunluğu önlemek için lazer gücünü ayarlayın ve Z yığını ayarında ilk ve son dilim konumlarını ayarlayın.
Aynı zamanda, Z yığını taramasını ve sıcaklık kaydını başlatın. Peltier'in yüzey sıcaklığını değiştirmek için Peltier'e güç veren güç kaynağını kontrol edin. Daha sonra, Z yığını taramasını ve sıcaklık kaydını durdurun.
TACI kalsiyum görüntüleme nokta kavanozunu indirdikten sonra, menü çubuğundaki eklentilere tıklayarak eklentiyi Fiji'ye yükleyin, ardından açılır menüye yükleyin. Ardından Fiji'yi yeniden başlatın ve eklentilere tıklayarak ve TACI kalsiyum görüntülemeyi seçerek eklentiyi çalıştırın. TIFF dosya adlarını gerekli yapıya dönüştürmek için yeniden adlandırma işlevini seçin.
Klasörlere gözat'ı tıklatarak TIFF görüntülerinin yeniden adlandırılması gereken klasörü seçin ve klasör adını kullanarak dosya adının otomatik olarak doldurulmasını bekleyin. Maksimum T konumunu ve maksimum Z konumunu kontrol edin. Maksimum T konumu ve maksimum Z konumu için parametre değerlerinin tüm rakamları içerdiğinden emin olun.
Her parametrenin konumunu sırayla girin. TIFF dosya adları tümceciği ve kanalı içermiyorsa, karşılık gelen parametre değerini boş bırakın ve sırayla NA'yı seçin. Herhangi bir posttext varsa, posttext parametresine eklenir.
Aynı ada sahip bir klasör oluşturmak için yeniden adlandır'ı tıklatın, ardından alt çizgi R.TIFF dosya adlarının klasörde düzenleme işleviyle uyumlu olacak şekilde yeniden yapılandırıldığını gözlemleyin. Ardından, TIFF görüntülerini aynı Z konumunda bir klasöre kaydetmek için organize işlevini kullanın. Klasörlere gözat'ı tıklatarak T görüntülerinin düzenlenmesi gereken klasörü seçin.
CSV dosyası parametresi varsa, parametre değerlerinin otomatik olarak doldurulmasını bekleyin. CSV dosyası parametresi yoksa, parametre değerlerini el ile doldurun. Faz ve kanalın parametre değerlerinin varsa harfleri içerdiğinden emin olun, T pozisyonunun ve Z pozisyonunun parametre değerleri ise T ve Z pozisyonlarının en büyük sayıları olmalıdır.
Görüntü dosyası adları fazı veya kanalı içermiyorsa, NA girin. Ardından, R görüntüleri gri kutusunun işaretli olmadığından emin olarak gerektiğinde gri tonlamalı TIFF görüntüleri oluşturun. Aynı ada ve ardından alt çizgi gri alt çizgi yığınlarına sahip bir klasör oluşturmak ve klasörde aynı adın ardından alt çizgi ve Z konum numarasına sahip klasörler oluşturmak için Düzenle'yi tıklatın. Ardından, TIFF dosyalarının Z konumlarına göre karşılık gelen klasörlere sıralandığını ve parametrelerin ve değerlerinin bulunabileceği param dot CSV adlı bir dosyanın oluşturulduğunu gözlemleyin.
Şimdi, her bir Z pozisyonundan ilgili hücrelerin floresan yoğunluklarını çıkarmak için Fiji'de trackmate kullanın. TIFF görüntülerini Fiji'nin bir Z konumu klasöründe açın ve eklentilere tıklayıp izlemeyi ve ardından Trackmate'i seçerek TRACKMATE'i çalıştırın. DOG veya LOG dedektörlerini kullanarak parametreleri ayarlayın.
Blob çap eşiğini ve medyan filtresini değiştirin. Alakasız sinyalleri kaldırmak için filtreleri ayarlayın. Bağlantı maksimum mesafesini, boşluk kapatma maksimum mesafesini ve boşluk kapatma maksimum çerçeve boşluğunu ayarlayın.
İlgilenilen bölgelerin floresan yoğunluklarını bir CSV dosyasına aktarın. Her nöron için bir klasör oluşturun ve nöron numarasını kullanarak adlandırın. Nöron sıfırdan başlayarak.
İlgili nöronun floresan bilgilerini içeren CSV dosyalarını klasöre kaydedin. CSV dosyalarını ortalama yoğunluk Z konum numarası nokta CSV olarak adlandırın ve en az iki sütun, T konumu ve ortalama yoğunluk veya ortalama yoğunluk kanalı bir'i ekleyin. Nöron sıfırdan başlayarak tüm nöronların bilgilerini belirli bir biçimde içeren arka plan alt çizgi listesi nokta CSV dosyasını oluşturun.
Birinci satırdaki nöron sıfır gibi nöron numaralarını doldurun. Ardından, analiz edilen her Z konumu için arka plan yoğunluğunu sağlayın. Nöron sıfır için dört Z pozisyonu analiz edilirse, nöron sıfırın altındaki dört arka plan yoğunluğu değerini doldurun.
Oluşturulan arka plan listesi nokta CSV dosyasını ve floresan bilgilerinin CSV dosyalarını içeren klasörleri tek bir klasöre kaydedin. TACI'yi açın ve ayıklama işlevini seçin. Ardından dosyalara göz at'a tıklayarak klasörü seçin.
Arka plan dosyası otomatik olarak doldurulur. T pozisyonlarının sayısı için en fazla sayıda T pozisyonunu doldurun. Her nöronun CSV dosyalarını ve grafiklerini içeren bir sonuç klasörü oluşturmak için özütle'yi tıklayın.
CSV dosyaları maksimum floresan yoğunluğunu ve her T konumunda delta sıfır üzerinde delta F'yi içerir. Grafikler, F sıfır ve T konumları üzerinden delta F'nin çizgi grafikleridir. Birleştirme işlevini kullanarak, tüm nöronlardan F sıfırı üzerinden F deltasının ortalaması.
SEM'i hesaplayın ve ortalama Delta F'yi F sıfırın üzerinde T konumlarının üzerine çizin. Dosyalara göz at'a tıklayarak ayıklama işlevi tarafından oluşturulan sonuçlar klasörünü seçin. T pozisyonlarının sayısını en fazla sayıda T pozisyonu ile doldurun.
Birleştirilmiş altı çizili veri CSV dosyası ve ortalama alt çizgi DF alt çizgi F sıfır nokta PNG grafiği dahil olmak üzere birleştirilmiş bir veri klasörü oluşturmak için birleştir'i tıklatın. CSV dosyası, her T konumunda F sıfır üzerinden ortalama ve SEM delta F bilgilerini içerir. Grafik, T pozisyonları üzerinden F sıfır üzerindeki ortalama delta F'nin çizgi grafiğidir.
GCaMP altı M eksprese eden sinek larva serin hücrelerinin kalsiyum görüntülemesi, 27 santigrat derecede inaktif durumda herhangi bir floresan göstermez. Bununla birlikte, hücre içi kalsiyum seviyeleri 10 santigrat derecede hızla artmıştır. Sıcaklık arttığında kalsiyum seviyeleri hızla düştü.
0.1 zamanında GCaMP altı F'yi ifade eden sinek beyni nöronlarının kalsiyum görüntülemesi, yedi nöronun dördünde floresan gösterdi ve bu nöronların yoğunluğu zamanla azaldı. Oktinal varlığında, çoklu nöronlar aydınlandı. 10 nöronun floresansı, 92 zaman noktasında aynı anda artmıştır, bu da bu mantar nöronlarının oktinal kokuya tepki verdiğini düşündürmektedir.
TACI çakışan hücreleri ayırabilir. Bu maksimum projeksiyon görüntüsünde, üst üste binen iki nöron tanımlandı. Bu nöronlar orthro görünümünde ayrıldı ve bu nöronların farklı Z pozisyonlarında ortaya çıktığını gösterdi.
Turuncu hücre Z yedide en güçlü sinyali gösterirken, mavi hücre Z 10'da en güçlü sinyale sahipti. Floresandaki değişim bu iki hücreyi ve turuncu hücrenin gecikmiş ancak güçlü aktivasyonunu ortaya çıkardı. Ekstraksiyon sırasında, bir nöronun göründüğü tüm Z pozisyonlarından maksimum floresan değeri, nöronun yoğunluğunu karşılık gelen birikimde temsil etmek için kullanılır.
Çok sayıda nöronu analiz etmek için TACI kullanılıyorsa, Z pozisyonları arasında bazı kayıtların floresan bilgisi ile organize edilmiş olarak geliştirilecek yeni bir fonksiyona dahil edilmesi gerekir. TACI, tek tek hücreler birden fazla Z konumunda göründüğünde Z eksenindeki hücre hareketini kontrol etmek için 3D kapsül görüntüleme analizi için kullanıcı dostu, açık kaynaklı bir hesaplama yaklaşımı sağlar.
